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文本内容:
木瓜蛋白酶的分离纯化
一、目的
(1)它是利用未成熟的番木瓜(Caricapapaya)果实中的乳汁中提取粗酶液,并进一步纯化,获得高纯度的木瓜蛋白酶
(2)通过此次试验,熟悉掌握木瓜蛋白酶分离纯化的基本步骤和原理,了解离心分离,萃取等实验技术
二、原理木瓜蛋白酶(Papain)是一种巯基蛋白酶,它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物它也具有脂酶活力其分子量约为23000左右在25℃pH
6.2时,1分钟生成1umol酪氨酸的酶量为1单位木瓜蛋白酶是单条肽链,有211氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝,酶分子只有1个巯基,对酶活力是必需的,激活剂有半胱氨酸,硫化物,亚硫酸盐和EDTA;抑制剂有巯基试剂,包括重金属和羧基试剂和过氧化氢酪蛋白是一种蛋白质,它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区275nm处有吸收峰,根据测定275nm处的吸收值,可以判定木瓜蛋白酶的酶活力吸收值的大小与酪氨酸含量的多少有关,吸收值大说明酪氨酸含量高,也就是说木瓜蛋白酶分解的酪蛋白多,酶活力高
三、实验材料番木瓜汁;PEG聚乙二醇,分子量为6000;NH42SO4;三氯乙酸TCA;酪氨酸;考马斯亮蓝
四、仪器设备
(1)离心机4000-1000rpm(冷冻式或非冷冻式)
(2)752紫外分光光度计
(3)水浴箱
(4)冰箱
(5)榨汁机
五、玻璃器皿(以组为单位)试管
(6),100mL烧杯
(2),吸管
(1)、玻棒
(1),试剂瓶(1000mL、500mL、250mL等),移液管或移液器5mL
1、1mL
2、
0.5mL
(1),漏斗
(3),滤纸(3-6)等
六、实验试剂配制及实验步骤
(一)酪氨酸的标准曲线试管编号012345标准酪氨酸溶液ml
00.
20.
40.
60.
81.0蒸馏水(ml)
21.
81.
61.
41.21紫外吸光度A275nm
00.
0660.
1750.
3000.
4300.550将上述各管混匀,静置2min测定各管的A275nm,做标准曲线,...。