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文本内容:
质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定
一、实验目的
1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法;
2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法;
3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法;
4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法;
5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法
二、实验原理
1.PCR多聚酶链式反应在DNA聚合酶催化下,可以DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以dNTP为原料,通过变性、退火、延伸等步骤,在体外(缓冲液中)复制DNA,使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增PCR一次循环的具体反应步骤为A.变性加热反应系统至95℃,使模板DNA在高温下完全变性,双链解链B.退火逐渐降低溶液温度,使合成引物在低温(35-70℃一般低于模板Tm值的5℃左右),与模板DNA互补退火形成部分双链C.延伸溶液反应温度升至中温72℃,在Taq酶作用下,以dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链
2.质粒DNA的提取与制备
1.碱裂解法染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异A.高碱性条件下,染色体DNA和质粒DNA均变性;B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并保存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除
2.离心层析柱A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质;B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除;C.低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱
3.质粒DNA的定量分析(紫外分光光度法)A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性;B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反应DNA的纯度;A260/A280=
1.8DNA纯净A260/A
2801.8表示样品中含蛋白质(芳香族)或酚...。