文本内容:
一、实验名称质粒DNA的提取与纯化,DNA琼脂糖凝胶电泳
二、实验原理
1.质粒DNA的提取质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外(细胞质中)呈游离状态的双链、闭环的DNA分子,能够自主复制和稳定遗传,以超螺旋形式存在,是最常用的基因克隆载体除质粒外,大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质,因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA分离制备质粒DNA的方法很多,其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择本实验使用碱裂解法,即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下
(1)碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA,达到分离提纯质粒DNA的目的在pH值高达
12.6的碱性条件下,线性的DNA因氢键断裂,双螺旋结构解开而变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂,但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕,不会完全分离当加入pH
4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时,共价闭合环状的质粒DNA复性,恢复其天然构象,以可溶状态存在于液相中;而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质,然后用无水乙醇沉淀,即可获得纯化的质粒DNASolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下
(2)四种溶液作用及原理
①SolutionI的作用悬浮大肠杆菌菌体,增加溶液的粘度,维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,在溶液I中加入EDTA,是要把大肠杆菌细胞中的二价金属离子都螯合掉,从而起到抑制DNA酶对DNA的降解和抑制微生物生长的作用另外也可保证溶菌酶活性
②SolutionII的作用提供碱性条件,pH高达
12.6,使大肠杆菌瞬间裂解,促使染色体DNA和质粒D...。