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文本内容:
大肠杆菌高效表达重组蛋白策略前言重组蛋白的制备在蛋白结构分析和医疗应用领域十分重要药物蛋白的研究需要高纯度的重组蛋白来进行药物动力学和物理化学的研究
[1]重组蛋白在检测酶活、连接配体、蛋白相互作用等生物学领域广泛应用已经表达出多种重组蛋白被证明有很大的应用潜力
[23]通过基因工程改造的方法已经获得了许多性状优良的宿主菌表达系统,尤其是通过大肠杆菌可以大量表达外源基因编码的重组蛋白
[4]但是仍然有两个问题制约着大肠杆菌表达系统对重组蛋白的表达一个是表达量低,还有一个就是表达错误折叠的蛋白包涵体
[5]蛋白的表达和纯化工艺一直在发展进步,但是超过30%的重组蛋白为不具有生物活性的包涵体,严重影响了重组蛋白的生产应用
[67]在理想条件下,重组蛋白由强启动子进行表达,产生大量的具有生物学活性的可溶性重组蛋白但是,强启动子会导致重组蛋白的过表达从而影响宿主菌体的生长并产生包涵体
[8]在某些条件下可以通过变性、复性的方法使包涵体恢复活性
[9],但是复性后的蛋白是否能够完全恢复活性仍然未可知一般来讲,可以通过表达条件的优化来促进蛋白的可溶性表达,比如诱导温度、培养基组成、宿主菌的种类还可以通过多种方案来解决蛋白不溶的问题蛋白重新折叠
[10],构建融合蛋白
[11]另外想要进一步增加蛋白可溶性可以与分子伴侣共表达
[8]或者低温诱导
[12]本文对目前主要的促进蛋白可溶表达的方法进行了比较全面的总结
1.大肠杆菌表达系统的构建
1.1选择表达宿主菌对于大规模的表达重组蛋白,一般选择胞内表达或者周质空间表达与周质空间表达相比,胞内表达的表达量更高,因此应用更为广泛在实验研究和实际生产中,已经有很多大肠杆菌表达系统广泛应用于在表达体系中较为常用的大肠杆菌为B菌株和K12菌株及它们的衍生菌株(表1
[13])美国国立研究院已经认证了K12菌株的标准性以及安全的使用方案,因此K12菌株在生产应用中具有极大的优势但是由B菌株演变而来的BL系列菌株与K12相比,突变了lon和ompT两个基因
[14],因此具有许多表达优势产物积累少,缺少蛋白酶,防止产物被降解这些优势使得BL菌株也具有非常广泛的应用
[151617]通常来讲,针对不同的重组蛋白,宿主菌的选择也是不同的如果重组蛋白含有大肠杆菌稀有密码子,就需要宿主能够表...。