RNA提取常见问题、原因分析及其对策

RNA提取常见问题、原因分析及其对策

一、RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法（即TriZol类试剂）细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA步骤:材料准备尽量新鲜裂解变性异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）              使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶纯化分离苯酚，氯仿，异戊醇苯酚/氯仿可抽提去除杂物洗涤70％乙醇沉淀异丙醇、无水乙醇          乙酸钠（pH

4.0）维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA          此外还常用氯化锂选择沉淀RNA 

二、影响RNA提取的因素由于RNA样品易受环境因素特别是RNA酶的影响而降解，提取高质量的RNA样品在生命科研中具有相当的挑战性RNA提取对样品的新鲜性要求非常高，获取样品后最好立即提取RNA，若无条件立即实验，应于-80℃或液氮中保存样品，提取时取出样品后立即在低温下研磨裂解细胞，以防RNA降解    

1.材料新鲜，切忌使用反复冻融的材料，如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存，液氮长期保存，－70℃短期保存    

2.样品破碎及裂解    根据不同材料选择不同的处理方法    培养细胞通常可直接加裂解液裂解    酵母和细菌一般TRIzol可直接裂解，对一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁    动植物组织先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解期间动作快速，样品保持冷冻，样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量    

3.纯化在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成 RNA 降解；柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择 RNA提取及其RT-PCR常见问题、原因分析及其对策

一、常见问题...。