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免疫荧光组织化学技术
一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………
二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………
(一)直接方法……………………………………………………………………………1.检查抗原方法……………………………………………………………………2.检查抗体方法……………………………………………………………………
(二)间接方法……………………………………………………………………………1.检查抗体夹心法方法……………………………………………………………2.检查抗体方法……………………………………………………………………3.检查抗原法………………………………………………………………………
(三)补体法………………………………………………………………………………1.直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………2.间接检查组织内抗原方法………………………………………………………
(四)双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………
(五)对照试验……………………………………………………………………………1.直接方法…………………………………………………………………………2.间接方法…………………………………………………………………………3.补体方法…………………………………………………………………………
三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………
(一)荧光素………………………………………………………………………………1.异硫氰酸荧光素…………………………………………………………………2.四甲基异硫氰酸罗达明…………………………………………………………3.得克萨斯红Texasred……………………………………………………………4.其它荧光素…………………………………………………………………………
(二)荧光素标记抗体的方法……………………………………………………………1.FITC标记抗体的方法……………………………………………………………2.四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法……………………………………………3.藻红蛋白标记抗体方法……………………………………………………………4.蓝色荧光素标记抗体方法…………………………………………………………
(三)荧光抗体的质量控制………………………………………………………………1.染色特异性和敏感性的测定方法…………………………………………………2.F/P比值的测定方法………………………………………………………………3.荧光抗体的保存……………………………………………………………………
四、免疫荧光组织化学染色方法………………………………………………………………
(一)荧光抗体染色方法…………………………………………………………………1.直接方法……………………………………………………………………………2.间接方法双层法………………………………………………………………3.间接方法夹心法………………………………………………………………4.补体方法……………………………………………………………………………5.膜抗原荧光抗体染色方法………………………………………………………6.双重染色方法………………………………………………………………………7.荧光抗体再染色方法………………………………………………………………
(二)荧光抗原染色方法…………………………………………………………………
五、荧光显微镜检查方法………………………………………………………………………
(一)荧光和荧光显微镜…………………………………………………………………
(二)荧光显微镜标本制作要求…………………………………………………………1.载玻片……………………………………………………………………………2.盖玻片……………………………………………………………………………3.标本…………………………………………………………………………………4.封裱剂………………………………………………………………………………5.镜油…………………………………………………………………………………
(三)使用荧光显微镜注意事项…………………………………………………………
(四)荧光图像的记录方法………………………………………………………………
六、非特异性染色的消除方法…………………………………………………………………
(一)非特异性染色的主要因素…………………………………………………………
(二)消除非特异性染色的方法…………………………………………………………1.葡聚糖凝胶G-50柱层析法………………………………………………………2.DEAE纤维素柱层析法……………………………………………………………3.荧光抗体稀释法…………………………………………………………………4.纯化抗原方法………………………………………………………………………5.纯化抗体方法——免疫吸收方法………………………………………………6.伊文氏蓝Evansblue衬染色方法………………………………………………
七、现状与展望…………………………………………………………………………………免疫荧光组织化学技术
一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述免疫荧光组织化学是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一,是由Coons和他的同事1941建立,免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成免疫荧光细胞或组织化学它与葡萄球菌A蛋白SPA、生物素与卵白素、植物血凝素ConA等相结合拓宽了领域;与激光技术、电子计算机,扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光组织化学技术;荧光激活细胞分类器FluorescinactivatedcellsorterFACS的应用,激光共聚焦显微镜的问世,使免疫荧光细胞技术发展到更高的阶段,开创了免疫荧光技术的新领域细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确80年代到90年代相继又有新的荧光素出现如R-藻红朊,B-藻红朊,C-藻青蛋白,cy2cy3cy5cy7均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中广泛应用由于免疫荧光组织化学的特异性,快速性和在细胞水平定位的准确性,已在免疫学、微生物学、病理学、肿瘤学以及临床检验等许多方面得到广泛应用,日益发挥重要的作用
二、免疫荧光组织化学的原理免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,再用这种荧光抗体或抗原作为探针检查细胞或组织内的相应抗原或抗体在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,荧光素受激发光的照射,由低能态进入高能态,而高能态的电子是不稳定的,以辐射光量子的形式释放能量后,再回到原来的低能态,这时发出明亮的荧光黄绿色或桔红色,利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织,从而确定抗原或抗体的性质和定位,以及利用定量技术测定含量(图3-2-1)图3-2-1紫外光激发荧光物质放射荧光示意图用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法免疫荧光组织化学分直接法、间接法和补体法
(一)直接方法1.检查抗原方法这是最简便、快速的方法,用已知特异性抗体与荧光素结合,制成特异性荧光抗体,直接用于细胞或组织抗原的检查此法特异性强,常用于肾穿刺,皮肤活检和病原体检查,其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原,敏感性较差(图3-2-2)图3-2-2直接法2.检查抗体方法将抗原标记上荧光素,用此荧光抗原与细胞或组织内相应抗体反应,而将抗体在原位检测出来
(二)间接方法1.检查抗体夹心法方法此法是先用特异性抗原与细胞或组织内抗体反应,再用此抗原的特异性荧光抗体与结合在细胞内抗体上的抗原相结合,抗原夹在细胞抗体与荧光抗体之间,故称夹心法2.检查抗体方法用已知抗原细胞或组织切片,加上待检血清,如果血清含有切片中某种抗原的抗体,抗体结合在抗原上,再用间接荧光抗体抗种属特异性IgG荧光抗体与结合在抗原上的抗体反应,在荧光显微镜下可见抗原抗体反应部位呈现明亮的特异性荧光此法是检验血清中自身抗体和多种病原体抗体的重要手段3.检查抗原法此法是直接法的重要改进,先用特异性抗体与细胞标本反应,随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体,再用间接荧光抗体与结合在抗原上的抗体结合,形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物同直接法相比荧光亮度可增强3或4倍此法除灵敏性高外,它只需要制备一种种属间接荧光抗体,可以适用于同一种属产生的多种第一抗体的标记显示,这是现在最广泛应用的技术
(三)补体法1.直接检查组织内免疫复合物方法用抗补体C3荧光抗体直接作用组织切片,与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应,而形成抗原-抗体-补体—抗补体荧光抗体复合物,在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处,此法常用于肾穿刺组织活检诊断等2.间接检查组织内抗原方法常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上,经37℃孵育后,如发生抗原抗体反应,补体就结合在此复合物上,再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应,形成抗原-抗体-补体—荧光抗体的复合物,此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查
(四)双重免疫荧光组织化学标记方法在同一组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色,一般均采用直接法,将两种荧光抗体如抗A和抗B以适当比例混合,加在标本上孵育后,按直接法洗去未结合的荧光抗体,抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记,发黄绿色荧光;抗B抗体用TMRITC或RB200标记,发红色荧光,可以明确显示两种抗原的定位
(五)对照试验为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性,排除某些非特异性染色,必须在初次试验时进行以下对照试验1.直接方法
(1)标本自发荧光对照标本只加PBS或缓冲甘油封片,荧光显微镜观察组织内如果有荧光,称为自发荧光
(2)抑制试验可分为二步方法和一步方法1)一步抑制方法先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合,再加在标本上染色,结果应为阴性2)二步抑制方法标本先加未标记的特异性抗体,水洗后再加标记荧光抗体,结果应呈阴性或明显减弱的荧光
(3)阳性对照用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织化学染色,结果应呈阳性荧光结果如对照1和2无荧光或弱荧光,3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光2.间接方法
(1)自发荧光对照同直接法
(2)荧光抗体对照标本只加间接荧光抗体染色,结果阴性
(3)抑制试验同直接法
(4)阳性对照同直接法结果如对照
(1)、
(2)、
(3)均呈阴性,阳性对照和待检标本呈阳性荧光则为特异性荧光3.补体方法
(1)自发荧光对照
(2)荧光抗体对照
(3)抑制试验
(4)补体对照取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本,洗后再用抗补体荧光抗体染色,结果阴性
(5)抑制试验标本加灭活的第一抗体,再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后,再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液,结果应为阴性
(6)阳性对照
(1)~
(5)结果阴性,6和待检标本阳性时,则为特异性荧光
三、荧光抗体的制备制备荧光抗体是免疫荧光组织化学的重要技术之一,制备特异性强和高效价的荧光抗体必须选用高质量的荧光素和高效价的抗体
(一)荧光素荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后即刻引起发光,停止能量供给,发光也瞬时停止可以产生明亮荧光的染料物质,称荧光色素目前主要常用于标记抗体的荧光色素如下1.异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanateFITC)FITC是一种呈黄色粉末状,性质稳定,在室温下能保存2年以上,在低温中可保存多年易溶于水和酒精最大吸收光谱为490~495nm,最大发射光谱为520~530nm,呈现黄绿色荧光,分子量为
389.4(图3-2-3)图3-2-3FITC的分子结构式在碱性条件下,FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键结合成为标记荧光免疫球蛋白,即荧光抗体一个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子2.四甲基异硫氰酸罗达明tetramethylrhodamineisothiocyanateTMRITCTMRITC是一种紫红色粉末,较稳定其最大吸收光谱为550nm,最大发射光谱620nm呈橙红色荧光,与FITC的黄绿色荧光对比清晰,与蛋白质结合方式同FITC它可用于双标记示踪研究图3-2-43.得克萨斯红texasred得克萨斯红是一种褐色粉末状,易溶于有机溶剂,性质稳定,在4℃下能保存2年以上,最大吸收光谱为590-595nm,最大发射光谱为620-630mm,共有四种结构,常用的分子量为
625.15图3-2-5图3-2-4TMRITC的分子结构式图3-2-5Texasred的分子结构式4.其它荧光素如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸芪SITS7-氨基甲基香豆素AMC呈兰色荧光;藻红素Rphycoerythrin-R;花青CyanineCy2Cy3Cy5Cy7等
(二)荧光素标记抗体的方法1.FITC标记抗体的方法
(1)Marsshall氏法1)材料抗体溶液、
0.5mol/LpH
9.0碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1%硫柳汞水溶液、三角烧瓶25-50ml、冰及冰槽或1000ml烧杯、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯500ml、pH
7.2的
0.01mol/LPBS葡聚糖凝胶G-25层析柱等2)方法及步骤
①抗体的准备取适量已知抗体浓度之溶液,加入三角烧瓶中,再加入生理盐水及碳酸盐缓冲液,使最后抗体浓度为20mg/ml,碳酸盐缓冲液容量为总量的1/10,混匀,将三角烧瓶置冰槽中,电磁搅拌速度适当以不起泡沫为宜5~10min
②荧光素的准备根据标记的抗体总量,按每毫克蛋白加
0.01mg荧光素,用分析天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末
③结合边搅拌边将称取的荧光素渐渐加入抗体溶液中,避免将荧光素粘于三角烧瓶壁或搅拌玻棒上大约在5~10min内加完,加完后,在4℃左右继续搅拌12~18h,通常将装置安放4℃冰箱或冰库中进行
④透析结合完毕后,将标记的抗体溶液离心2000r/min10min,除去其中少量的沉淀物,装入透析袋中再置于烧杯中用
0.01MpH
7.2缓冲盐水透析0~4℃过夜
⑤过柱取透析过夜的标记物,通过葡聚糖凝胶G-25或G-50柱,分离游离荧光素,收集标记的荧光抗体进行鉴定(图3-2-6,图3-2-7)图3-2-6SephadexG-25对FITC标记抗体液羊抗兔柱层析洗脱模型图3-2-7FITC与家兔IgG球蛋白在25℃和2℃时结合的动力学Kawamura1964
(2)Chadwick氏法1)试剂和材料抗体球蛋白溶液、异硫氰酸荧光素、3%重碳酸钠水溶液、
0.01mol/LpH
8.0磷酸盐缓冲盐水、1%硫柳汞、离心机及离心管、三角烧瓶25ml、冰槽、无菌吸管及毛细滴管、烧杯500ml透析袋、棉线、玻棒等2)方法及步骤
①抗体准备用0~4℃的pH
8.0磷酸盐缓冲盐水将抗体蛋白溶液稀释至浓度为30~40mg/ml,置入三角烧瓶内,放于冰槽中
②荧光素准备按每毫克蛋白加入荧光素
0.01mg计算,称取所需之荧光素量,用3%重碳酸钠水溶液溶解
③将准备的抗体与荧光素溶液等量混合,充分搅匀,在0~4℃冰箱中结合18~24h
④透析和柱层析方法同Marshall氏法
(3)改良法试剂1)
0.01mol/LpH
7.2PBS配法NaCl18g、Na2HPO
41.15g、KH2PO
40.2g,溶于2000ml蒸馏水中,校定pH至
7.22)
0.5mol/LpH
9.0碳酸盐缓冲液配法取
0.5mol/LNa2CO
35.3%10ml加入
0.5mol/LNaHCO
34.2%90ml,混匀后,校定pH至
9.03)3%重碳酸钠水溶液配法称
1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水中即成方法及步骤取高效价的抗人球蛋白兔免疫血清,分离球蛋白,用盐水
0.15mol/LNaCI及缓冲液
0.5mol/LNaHCO3-Na2CO3pH
9.0稀释使每ml内含抗体10mg,缓冲液为总量的10%,降温至4℃,加入异硫氰酸荧光素,蛋白荧光素=80mg:1mg,在0~4℃下电磁搅拌12~14h然后用半饱和的硫酸铵将标记球蛋沉淀分离,除去未结合的荧光素,再用缓冲盐水透析,除去硫酸铵用Nessler氏试剂测验至隔夜透析的盐水无氨离子及荧光色素为止将制备好的荧光抗体加叠氮钠
0.01%,分装在1ml安瓿中,或冻干,保存于冰箱中4℃可以用半年以上,-20保存可达2年以上2.四甲基异硫氰酸罗达明标记抗体方法
(1)取IgG10ml6mg/ml在
0.1mol/LpH
9.5碳酸盐缓冲液中透析过夜
(2)将四甲基异硫氰酸罗达明每毫克IgG加入5~20g溶于二甲亚砜1mg/ml,取此溶液300l一滴一滴加入抗体溶液中,同时电磁搅拌
(3)在室温中搅拌2h,避光
(4)把结合物移入直径3cm,高30cm大小的Bio-GelP-6层析柱,用
0.01mol/LpH
8.0的PBS平衡过柱,流速为
1.5ml/min
(5)收集先流出的红色结合物,即为标记抗体,分装,4℃保存备用3.藻红蛋白标记抗体方法
(1)巯基化藻红蛋白phycoerthrinPE的制备600μl的
15.5mg/ml盐酸巯醇亚胺iminothiolanehydrochloride加到
1.2ml的
3.6mg/ml的PE中,和
1.2mlPBpH
6.8混合,装入透析袋置入50mmol/LpH
6.8PB中透析,4℃过夜,再换用pH
7.5PB透析6h每个PE分子中可结合8个巯基
(2)巯基PE-IgG制备异双功能试剂SPDP[N-Succinimdyl3-2-pyridyldithiopropionate]30g
1.1mg/ml的乙醇溶液,加入700μl的
4.2mg/mlIgGPB溶液50mmol/LpH
7.5,在室温中反应
2.5h再加入巯基化PE400μl
1.7mg/ml加到500μl反应混合液中,室温反应12h,加入100μl的50mmol/L碘乙酸钠封闭残余巯基,在4℃用PB透析过夜加入
0.01%NaN3分装,4℃保存半年
(3)PE-标记蛋白A方法1)取
4.08mgPE溶于
0.1mol/LpH
7.4PB含
0.1mol/LNaCl1ml中,溶解后,取出
0.5ml,再加入10μlSPDP无水甲醇液
2.6mg/ml,SPDP/蛋白摩尔比为1022℃反应5min,过SephadexG-501×17cm,用100mmol/LpH
7.4PBS含
0.1mol/LNaCl平衡和洗脱2)
0.5ml蛋白2mg/ml100mmol/LPBS含有100mmol/LNaClpH
7.4,加入
2.6μl上述SPDP甲醇液,SPDP蛋白A=95,22℃,40min加入25μl二硫苏糖醇DTTpH
7.4缓冲液,22℃,25min,同上过sephadexG-25,收集蛋白A峰3)取
0.77mg/ml的PE和
0.27mg/ml蛋白A等量混合,22℃反应6h,混合物4℃保存备用,以上两种PE标记制品,可最后溶于
0.01mol/LpH
7.4PB含有
0.1mol/LEDTA、1mol/L碘乙酰胺、1%BAS和
0.1%NaN3,0~4℃保存4.蓝色荧光素标记抗体方法Kbaffan等1986首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术,可进行双标记或多标记
(1)取7-氨基-甲基香豆素7-amino-4-methylcoumarinAMC260μg溶于二甲亚砜25μl中
(2)将上液加入10mlIgG- 巴比妥缓冲液
0.5mol/LpH
8.5内含50~100mgIgG中,室温反应2h,过SephadexG-50除去游离荧光素最大荧光波长430nm最大吸收波长354nm
(三)荧光抗体的质量控制1.染色特异性和敏感性的测定方法
(1)特异性染色和效价测定直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如12,14,18……,与相应抗原标本作一系列染色,荧光强度在“+++”的最大稀释度,为其染色滴度效价或单位实际染色应用时,可取低一个或两个稀释度即2~4个单位,如染色效价为164,实际应用时可取132或116间接染色效价可按抗核抗体荧光染色法步骤,先用不同稀释度的荧光抗体染色,结果以抗核抗体荧光强度“++”为标准,染色用效价和直接法相同
(2)非特异性染色测定根据荧光抗体的用途不同,可用相类似的抗原切片或涂片,倍比稀释荧光抗体,按常规染色,结果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色,否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体
(3)吸收试验在荧光抗体中加入过量相应抗原,于室温中搅拌2h后,移入4℃中过夜,3000r/min离心30min,收集上清液,再用于相应抗原阳性标本染色,结果应不出现明显阳性荧光2.F/P比值的测定方法F荧光素和P抗体蛋白的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量,一般要求F/P的克分子比值为1~2过高时,非特异性染色增强;过低时,荧光很弱,降低敏感性
(1)蛋白质定量测定荧光抗体的蛋白质mg/ml量
(2)结合荧光素定量先制作荧光素定量标准曲线,即准确称取FITC1mg,溶于10ml
0.5mol/LpH
9.0碳酸盐缓冲液中,再用
0.01mol/LpH
7.2PBS稀释到100ml,此时荧光素含量为10μg/ml,以此为原液,再倍比稀释9个不同浓度的溶液,用分光光度计在490nm波长测定光密度值(OD),以光密度为纵坐标,荧光素含量为横座标,作标准函数图荧光素与蛋白质结合后,其吸收光谱峰值向长波方向位移约5nm,FITC和蛋白质结合后由490nm变为493-495nm,RB200和蛋白质结合后变为595nmF/P比值的计算可按以下公式计算FITCg/ml160000×103FITCg/mlF/P克分子比值=———————×——————=
0.41×蛋白质mg/ml390×106蛋白质mg/ml式中160000为抗体蛋白质的分子量,390为FITC的分子量蛋白质从克换算为毫克需再乘以103,而荧光素从克换算为微克需要再乘以106测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下RB200g/ml×10-3÷580RB200荧光抗体的克分子比值=—————————————蛋白质mg/ml÷160000IgGA515nmOD160000TMRITC荧光抗体克分子量比值=————或=重量比g/g×————A280nmOD5803.荧光抗体的保存以0~4℃或-20℃低温保存,防止抗体活性降低和蛋白变性最好加入浓度为15000的硫柳汞或者110000,叠氮纳防腐,小量分装如
0.1~1ml,真空干燥后更易长期保存
四、免疫荧光组织化学染色方法
(一)标本制作
(二)荧光抗体染色方法1.直接方法
(1)染色切片经固定后,滴加经稀释至染色效价如18或116的荧光抗体,在室温或37℃染色30min,切片置入能保持潮湿的染色盒内,防止干燥
(2)洗片倾去荧光抗体,将切片浸入pH
7.2PBS中洗两次,电磁振动,每次5min,再用蒸馏水洗1min,除去盐结晶
(3)50%缓冲
0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH
9.0~
9.5甘油封固、镜检直接法比较简单,适合做细菌、螺旋体、原虫、真菌及浓度较高的蛋白质抗原如肾、皮肤的检查和研究此法每种荧光抗体只能检查一种相应的抗原,特异性高而敏感性较低2.间接方法双层法
(1)切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上,置于染色盒中保持一定的湿度,37℃作用30min然后用
0.01mol/LpH
7.2PBS洗两次,10min,用吸水纸吸去多余的液体
(2)再滴加间接荧光抗体如兔抗人γ-球蛋白荧光抗体等,同上步骤,染色30min,37℃,缓冲盐水洗两次10min,振动,缓冲甘油封固,镜检3.间接方法夹心法
(1)切片或涂片固定后,置于染色湿盒内
(2)滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃,30min
(3)缓冲盐水洗2次,每次5min,吹干
(4)滴加特异性荧光抗体在切片上37℃,30min
(5)如
(3)水洗
(6)缓冲甘油封固,镜检4.补体方法
(1)材料和试剂1)免疫血清60℃灭活20min,用Kolmers盐水作2倍稀释成12,14,18……补体用110稀释的新鲜豚鼠血清,抗补体荧光抗体等,按下述的补体法染色免疫血清补体结合的效价如为132则免疫血清应用18稀释2)补体用新鲜豚鼠血清一般作110稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果,按2单位的比例,用Kolmers盐水稀释备用Kolmers盐水配法即在pH
7.4的
0.1mol/LPBS中溶解MgSO4的含量为
0.01%浓度3)抗补体荧光抗体在免疫血清效价为14,补体为2单位的条件下,用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价,然后按染色效价14的浓度用Kolmers盐水稀释备用
(2)方法步骤1)涂片或冰冻切片用冷丙酮10min固定和PBS洗一次,3min,吹至组织表面无水份2)吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液此时免疫血清及补体又都各稀释一倍滴于切片上,37℃作用30min,置于保持一定湿度的染色盒内3)用缓冲盐水洗2次,搅拌或振动,每次5min,吸干标本周围水份4)滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体30min,37℃,水洗同35)蒸馏水洗1min,缓冲甘油封固5.膜抗原荧光抗体染色方法本法应用直接法或间接法的原理和步骤,可对活细胞在试管内进行染色,常用于T和B细胞、细胞培养物、瘤细胞抗原和受体等的研究,阳性荧光主要在细胞膜上FACS即采用此原理和方法6.双重染色方法在同一标本上有两种抗原需要同时显示如A抗原和B抗原,A抗原的抗体用FITC标记,B抗原的抗体用罗达明标记,可采用以下染色方法
(1)一步法双染色方法先将两种标记抗体按适当比例混合A+B,按直接方法进行染色
(2)二步法双染色方法先用RB200标记的B抗体染色,不必洗去,再用FITC标记的A抗体染色,按间接法进行结果A抗原阳性荧光呈现绿色,B抗原阳性呈现桔红色荧光
(三)荧光抗原染色方法某些抗原可以用荧光素标记,制成荧光抗原,标记荧光素的方法与制备荧光抗体方法相同用荧光抗原可以直接检查细胞或组织内的相应抗体,特异性较好,敏感性较差染色方法同荧光抗体染色的直接方法由于多数抗原难以提纯或量少昂贵,一般很少采用此法
五、荧光显微镜检查方法
(一)荧光显微镜荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具,分透谢和落射二种类型,落射光无需镜内操作方便,效果更好它是由超高压光源、滤板系统包括激发和压制滤板和光学系统等主要部件组成是利用一定波长的光激发标本发射荧光,通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像
(二)荧光显微镜标本制作要求1.载玻片载玻片厚度应在
0.8-
1.2mm之间,太厚的玻片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚焦载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光有时需用石英玻璃载玻片2.盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质如氟化镁的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光又可激发标本3.标本组织切片或其他标本不能太厚,如太厚激发光大部消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不能充分激发另外,细胞重叠或杂质掩盖,背景非特异染色引起的荧光影响判断4.封裱剂封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH
8.5~
9.5时较亮,不易很快褪去所以,常用甘油和
0.5mol/LpH
9.0~
9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影配方是将P—次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS10m1中,调pH至
9.0~
9.5,再加入甘油90ml,混匀,在室温放置过夜,待其中小气泡完全消失即可使用5.镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油可用甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响对于落射光荧光显微镜BX60,NikonE-1000无须镜油
(三)使用荧光显微镜注意事项1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序2.应在暗室中进行检查进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本3.防止紫外线对眼睛的损害在调整光源时应戴上防护眼镜4.检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱或褪色;所以最多不得超过2~3h5.荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃一天中应避免数次点燃光源6.标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发7.荧光亮度的判断标准一般为四级,即“—”——无或可见微弱自发荧光“+”——仅能见明确可见的荧光“++”——可见有明亮的荧光“+++”——可见耀眼的荧光
(四)荧光图像的记录方法荧光显微镜所看到的荧光图像,一是具有形态学特征,二是具有荧光的颜色和亮度,在判断结果时,必须将二者结合起来综合判断结果记录根据主观指标,即凭工作者目力观察,作为一般定性观察,基本上是可靠的随着技术科学的发展,采用细胞分光光度计,流式细胞仪,激光共聚焦显微镜和图像分析仪等仪器但这些仪器记录的结果,也必须结合主观的判断荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要,由于荧光很易减弱褪色,要及时摄影记录结果方法与普通显微镜摄影技术基本相同只是需要采用高速感光胶片如ASA200以上或24o以上因紫外光对荧光猝灭作用大,如FITC的标记物,在紫外光下照射30s,荧光亮度就有降低有的荧光强度不够,曝光速度太慢,只能用人工掌握曝光时间,将荧光图像拍摄下来研究型荧光显微镜都有半自动或全自动显微数码相机摄影系统装置,如Nikon公司2001年在我国推出了NikonE-1000全自动荧光显微镜配备有CoolCCD与计算机联接将图像采集在软盘上再与彩色打印机连接直接打印照片
六、非特异性染色的消除方法
(一)非特异性染色的主要因素组织的非特异性染色的机理很复杂,其产生的原因主要可分以下几点1.一部分荧光素未与抗体结合,形成了聚合物和衍化物,而不能被透析除去引起非特异性染色2.抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白,可与组织成分非特异结合3.除去检查的抗原以外,组织中还可能存在类属抗原如Forssman氏抗原,可与组织中特异性抗原以外的相应抗原结合4.从组织中难以提纯抗原性物质,所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体,以致容易混淆5.抗体分子上标记的荧光素分子太多,这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子,可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色6.荧光素不纯,标本固定不当等
(二)消除非特异性染色的方法消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法,常用的方法有以下几种1.透析法荧光素如FITC分子可以通过半透膜,而蛋白质大分子不能透过,可将未与蛋白结合的荧光素透析除去
(1)将标记完毕的荧光抗体液装入一透析袋或玻璃纸袋内,液面稍留空隙,紧扎
(2)浸人
0.01mol/LpH
7.2的PBS中悬于大于标记物体积约50—100倍的PBS内,在4℃中透析,每日更换3~4次PBS,透析液中无荧光即可在荧光光源照射下2.葡聚糖凝胶G-50柱层析法除去游离荧光素可用葡聚糖凝胶G-25或G-50柱层析方法,加入荧光抗体15~18ml按床体积的5%~10%加样,使其缓慢渗人柱内,待即将全部入柱时,加入PBS少许,关闭下口,停留30—40min,使游离荧光素充分进入分子筛孔中,然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液加入洗脱液一定量后,荧光抗体即向下移行,逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的距离界线,随着大量洗脱液的不断加入,二者分离距离越来越大,荧光抗体最先流出,分前、中、后三部分,收集中间部分,测F/P比值,合格者浓缩,分装如仅用小量荧光抗体,可用1cm×20cm的层析柱,取2gSephadexG-50装柱,即可过滤2~
3.5ml荧光抗体
3.荧光抗体稀释法先测定荧光抗体的特异性染色与非特异性染色效价,若二者效价相差较大,则可将荧光抗体稀释至一临界浓度,使特异性染色呈阳性,而使非特异性染色保持阴性,稀释方法和染色效价测定方法相同
4.纯化抗原方法用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件现代免疫化学技术免疫吸收法和柱层析法等提供了很大的可能性5.伊文蓝(Evanblue)衬染色方法用
0.01%伊文蓝的
0.01mol/LpH
7.2PBS溶液稀释荧光抗体,可将背景细胞和组织染色呈红色荧光,与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比,减少了非特异性荧光,宜作常规应用伊文蓝一般配成1%溶液,保存于4℃,用前再稀释至
0.01%用以稀释荧光抗体此外,还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色,提高特异性染色
七、现状与展望免疫荧光组织化学技术经过半个多世纪的不断改进和创新,已成为现代研究生物和医学的重要手段之一由于免疫荧光技术与形态、机能相结合不断完善和发展,尤其是合成了多种新荧光素与抗体容易结合,结合物稳定可以和FITC结合进行免疫荧光组织化学双标记或三标记至今,它已和亲合化学技术如SPA,Biotin及avidinConA相结合,应用领域也日益扩大,又与现代的电子计算机和扫描电视技术,共聚焦显微镜,荧光激活细胞分类器(FACS)以及数码相机摄影技术的应用,使得快速性、简便性有了更大的提高,使得定量更加准确90年代又开展了荧光原位末端标记和荧光原位杂交技术,使得范围更广大虽然免疫组织化学有了很大的发展,如免疫金银法,免疫胶体铁法,SP,Evision和CSA法,但由于它有自己独特的优点,特异性强,定位准确、简便、快速、鲜明,在许多领域中仍占有不可取代的地位如肾活检、皮肤活检中IgGIgMIgAC3等检测,自身抗体的检查,传染病的快速诊断,单克隆抗体的筛选及鉴定等随着科学技术的不断发展,免疫荧光组织化学技术广泛应用于生命科学的各个领域,放射出更加灿烂五彩缤纷的荧光参考文献
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5119.王伯沄李玉松,黄高昇张远强主编病理学技术北京人民卫生出版社出版;2000年6月P380-396第三节免疫金银组织化学技术
一、免疫金银组织化学技术发展史概述………………………………………………
二、溶胶的基本概念……………………………………………………………………
(一)胶体金……………………………………………………………………1.离子分散体系………………………………………………………………2.胶体分散体系………………………………………………………………3.粗分散体系………………………………………………………………
(二)胶体金的一般性状…………………………………………………………1.胶体金的颜色………………………………………………………………2.胶体金的稳定性…………………………………………………………3.溶胶的聚沉现象…………………………………………………………
三、胶体金的制备方法………………………………………………………………
(一)制备胶体金的准备…………………………………………………………1.玻璃器皿的清洁…………………………………………………………2.试剂的配制要求…………………………………………………………
(二)制备胶体金的方法和步骤………………………………………………1.白磷还原法………………………………………………………………2.抗坏血酸还原法StathisandFabrikanos1958…………………………3.柠檬酸三钠还原法Frens1973…………………………………………4.鞣酸-柠檬酸三钠还原法Slot与Gueeze1985年………………………5.乙醇超声波还原法BaigentandMuller1980…………………………6.硼氢化钠还原法Tschoppetal1982……………………………………7.放射性胶体金的制备方法KentandAllen1981…………………………
四、胶体金的质量鉴定………………………………………………………………
(一)胶体金颗粒直径测定……………………………………………………
(二)胶体金颗粒均匀度测定……………………………………………………
(三)影响胶体金颗粒大小的因素………………………………………………
五、胶体金标记的准备………………………………………………………………
(一)待标记蛋白质的准备……………………………………………………1.透析除盐:……………………………………………………………………2.去除蛋白质中的沉淀……………………………………………………
(二)胶体金pH值的调整…………………………………………………………
(三)待标记蛋白质最适稳定性的测定…………………………………………1.光电比色法:………………………………………………………………2.目测法……………………………………………………………………
(四)蛋白质的胶体金标记……………………………………………………
(五)胶体金标记蛋白质的纯化………………………………………………1.高速与超速离心法…………………………………………………………2.凝胶过滤法………………………………………………………………
(六)免疫金探针的鉴定…………………………………………………………
六、光镜免疫金银组织化学…………………………………………………………
(一)免疫金染色………………………………………………………………1.免疫金法IGS………………………………………………………………2.蛋白A-金PAG放大法……………………………………………………
(二)免疫金银法(IGSS)…………………………………………………………1.石蜡切片的IGSS染色……………………………………………………2.冰冻切片的IGSS染色……………………………………………………3.半薄切片的IGSS染色……………………………………………………
(三)彩色免疫金银法CIGSS……………………………………………………
(四)免疫金及免疫金银技术的优点…………………………………………1.制备简单……………………………………………………………………2.标记简单……………………………………………………………………3.适用范围广………………………………………………………………4.特异性强……………………………………………………………………5.敏感性高……………………………………………………………………6.无毒…………………………………………………………………………
(五)IGSS染色技术的质量控制………………………………………………1.试剂质量……………………………………………………………………2.染色过程……………………………………………………………………3.背景染色的消除…………………………………………………………
(六)物理显影液及缓冲液的配制………………………………………………1.缓冲液的配制………………………………………………………………2.银显影液的配制…………………………………………………………3.柠檬酸缓冲液的配制……………………………………………………4.氢氧化钠NaOH无水乙醇饱和溶液的配制………………………………
七、现状与展望…………………………………………………………………………第三节免疫金银标记技术
一、免疫金技术发展史早在一个世纪以前化学家就对胶体金进行了研究当时只是研究它的结构和金属性质1939年KauscheandRuska把烟草花叶病毒吸附到金颗粒上在电子显微镜下观察金离子呈高电子密度然而胶体金技术作为标记物应用于免疫组织化学研究是在1971年Faulk和Taylor首先将兔抗沙门氏菌抗血清与抗胶体金颗粒结合用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原此后他们还把胶体金与抗胶原血清植物血凝素卵白蛋白人免疫球蛋白轻链、牛血清白蛋白结合应用1974年Romano和他的同事们将胶体金标记在马抗人的IgG上实现了间接免疫金染色法1974年Bauer等报道凝集素-金复合物的应用1978年Geoghegan等应用免疫金技术检测B淋巴细胞表面抗原1981年Danscher建立了银显影液增强光镜下金颗粒可见性的免疫金银染色法ImmunogoldsliverstainingIGSS到了1986年Fritz等人在免疫金银法基础上成功地进行了彩色免疫金银染色使得结果更加鲜艳夺目胶体金技术逐渐地得到完善和成熟近10年此项技术得到了迅速发展和广泛应用应用胶体金为标记物的免疫金染色IGS与免疫金银染色IGSS方法在光镜和电镜下可以单标记和双标记或多种标记观察细胞和组织结构可以定性定位以至定量研究目前它已被应用于医学和生物学研究的众多领域
二、溶胶的基本概念
(一)胶体金1.离子分散体系指分散相以小分子或离子状态分散着这种溶液具有高度稳定性无论放置多久分散相颗粒都不会因重力而下沉不会从溶液中分离出来2.胶体分散体系是指分散相颗粒在1-100nm之间的分散体系叫做胶体分散体系胶体溶液外观透明不浑浊在普通显微镜下看不见它的分散相粒子不易受重力影响与分散介质分离沉降但其中的溶胶粒子有聚结变大的倾向即具有聚结不稳定性,胶体金属于这种体系3.粗分散体系分散相颗粒是由许多分子组成因粒子较大用肉眼或显微镜即可看见不稳定极易因重力而自动沉降外观浑浊不透明
(二)胶体金的一般性状1.胶体金的颜色溶胶的颜色决定于分散相物质的颜色、分散相物质的散度和入射光线的种类是散射光还是透射光粒子越小分散度越高则散射光的波长越短对同一种物质的水溶胶来说粒子大小不同颜色亦不同胶体金颗粒在5-20nm之间吸收波长520nm呈葡萄酒红色20-40nm之间吸收波长530nm液体为深红色60nm的金溶液主要吸收波长600nm金溶液呈兰紫色若离心去掉较大的金颗粒溶胶呈红色2.胶体金的稳定性影响溶胶稳定性的主要原因有三点:
①胶粒间的相互吸引力当胶粒相距很近时这种吸引力可能导致胶粒合并变大
②胶粒及其溶剂化层溶剂是水就是水化层的带电情况一种溶胶的各个胶粒都带有相同的电荷同性电荷相斥双电层愈厚胶粒带电量愈大排斥力愈大愈能阻止胶粒合并聚结溶胶愈稳定
③胶体界面的溶剂膜当二固体间夹有一厚层液体时这层液体膜有一个反抗二固体接近的排斥力两个胶粒要进一步接近只有克服它们之间的溶剂化膜的斥力才有可能因此溶剂膜的斥力是使溶胶稳定的原因之一3.溶胶的聚沉现象
(1)少量电介质对溶胶的聚沉作用少量电介质即可使溶胶聚沉但各种电介质的聚沉能力可用聚沉值来表示聚沉值是在一定时间内使一升某浓度的溶胶产生聚沉所需电介质的最小毫克分子数显然聚沉值愈小聚沉能力愈大聚沉值从实验中得出如下的价规则:
①电介质负离子对带正电的溶胶起主要聚沉作用正离子对带负电的溶胶起主要聚沉作用
②同价离子聚沉能力几乎相等不同价离子的聚沉能力随离子价增加而显著增加电解质为什么能使溶胶聚沉呢?这是由于电解质与胶粒带相反电荷的离子的作用,中和了胶粒所带的一部分电荷,使胶粒电量减少,扩散层缩小,溶剂化层变薄,而当双电层厚度缩至很小和溶剂化层变得很薄时,两个胶粒间便可以更加接近即不产生斥力,两个胶质间因引力加大而合并的趋势增强,甚至引力占绝对优势以致使胶粒聚结而发生聚沉胶粒的双电层结构电图3-3-1
(2)温度对溶胶稳定性的影响一般影响不大当温度升高时吸附能力减弱溶剂化程度降低溶剂化层变薄胶粒聚结不稳定性增加
(3)浓度对溶胶的稳定性的影响浓度增大时粒子间距离缩小引力增加容易聚结而发生聚沉所以制备比较稳定的溶胶要有一定的合适浓度图3-1-1胶粒的双电子层结构示意图
三、胶体金的制备方法胶体金溶液的制备有许多种方法,其中最常用的是化学还原法,基本的原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子目前常用的还原剂有白鳞、乙醇、过氧化氢、硼氢化钠、抗坏血酸、枸椽酸钠、鞣酸等,下面分别介绍制备不同大小颗粒的胶体金溶液
(一)制备胶体金的准备1.玻璃器皿的清洁我们的经验是制备胶体金的所有玻璃器皿先用自来水把玻璃器皿上的灰尘流水冲洗干净加入清洁液浸泡24h自来水洗净清洁液然后每个玻璃器皿用洗洁剂洗3-4次自来水冲洗掉洗洁剂用蒸馏水洗3-4次再用双蒸水把每个器皿洗3-4次烤箱干燥后备用2.试剂的配制要求1所有配制试剂的容器均按以上要求酸处理洗净配制试剂用双蒸馏水或三蒸馏水2氯化金HAuCl4水溶液的配制:将1g的氯化金置入棕色细口试剂瓶中溶解于双蒸水中配成1%的水溶液放在4℃冰箱内保存长达几个月至1年左右仍保持稳定3白磷或黄磷乙醚溶液的配制:白磷在空气中易燃烧要格外心小操作把白磷在双蒸水中切成小块放在滤纸上吸干水份后迅速放入已准备好的乙醚中轻轻摇动等完全溶解后即得到饱和溶液储藏于棕色密闭瓶内放在阴凉处保存
(二)制备胶体金的方法和步骤1.白磷还原法
(1)白磷还原法ZSigmondy1905年1取1%的HAuCl4水溶液1ml加双蒸水99ml配成
0.01%的HAuCl4水溶液2用
0.2mol/LK2CO3调pH至
7.23加热煮沸迅速加入
0.5ml白磷的饱和乙醚溶液振荡数分钟至溶液呈现橙红色时即成胶体金的颗粒直径为3nm左右大小较均匀
(2)白磷还原法ZSigmondy1905及ZSigmondyThiessen19251取
0.6%的HAuCl4水溶液
2.5ml加双蒸水120ml2用
0.2mol/LK2CO3调pH至中性3加入1/5饱和度的白磷乙醚溶液1ml1份白磷4份乙醚在室温振荡约15min溶液呈红褐色再加热至典型的葡萄酒红色加热可使乙醚蒸发胶体金液体内过量的白磷通入空气后被氧化此方法获得胶体金颗粒的直径在5-12nm之间
(3)白磷还原法的改良法Henegouwen19861取20%饱和度白磷乙醚溶液
0.5ml加双蒸水60ml2用1%的HAuCl4水溶液
0.75ml加
0.1mol/LK2CO
30.6ml振荡变成棕色3加热煮沸至溶液变成透明红色胶体金颗粒直径为
5.6nm使用上述方法增加还原次数使金颗粒直径不断增大二者之间的关系见表3-3-1表3-3-1胶体金颗粒大小与还原次数之间的关系还原次数颗粒直径nm正负误差
15.
60.
926.
70.
937.
90.
949.
81.
3512.
01.02.抗坏血酸还原法StathisandFabrikanos19581将在4℃预冷的1%HAuCl4水溶液1ml
0.2mol/LK2CO
31.5ml、双蒸水25ml混匀2在搅拌下加入1ml
0.7%抗坏血酸水溶液立即呈现紫红色3加双蒸水至100ml加热至溶液变为透明红色为止胶体金颗粒直径为8-13nm3.柠檬酸三钠还原法Frens1973此方法是由Frens在1973年创立的制备程序很简单胶体金的颗粒大小较一致广为采用该法一般先将
0.01%的HAuCl4溶液加热至沸腾迅速加入一定量1%柠檬酸三钠水溶液开始有些蓝色然后浅蓝蓝色再加热出现红色煮沸7-10min出现透明的橙红色各种颗粒胶体金制备详见表3-3-2表3-3-2柠檬酸三钠用量与胶体金颗粒直径的关系
0.01%HAuCl4柠檬酸三钠ml直径nm
1005.
010.
01004.
015.
01001.
525.
01001.
050.
01000.
7560.
01000.
6070.
01000.
4298.
01000.
32147.0100
0.
25160.04.鞣酸柠檬酸三钠还原法Slot与Gueeze1985年该法是以1982年Muhplfordt法为基础1985年Slot与Geuze对该法进行了改良特点是通过改变鞣酸的用量制备出多种颗粒直径的胶体金而且颗粒的直径均匀一致很适合于双标及多标研究制备3nm、5nm、10nm、15nm的胶体金颗粒见表3-3-3表3-3-3鞣酸柠檬酸三钠还原法A液B液直径nm1%柠檬酸内
0.1mol/LK2CO31%鞣酸H2O1%HAuCl4H2Omlmlmlmlmlml
3.
340.
2411.
8179540.
20.
715.
11791040.
0250.
115.
8751791540.
00250.
0115.987179操作步骤:1根据所需要的胶体金颗粒的大小分别配制A液和B液2将配制好的A、B两液在水浴锅内加热到60℃并通过控温装置使温度保持稳定3在电磁搅拌A液迅速加入B液继续加热直至胶体金变成葡萄酒色时间大约7-10min在A、B两液混合后可见溶液立即变成蓝色大约1-3min就变成红色5.乙醇超声波还原法BaigentandMuller198011%HAuCl4水溶液
0.2ml加入100ml双蒸水2用
0.2mol/LK2CO3调pH至中性再加入1ml乙醇3用20KC、135W超声波探头浸入溶液内进行超声振荡由此法制得的胶体金颗粒为6-10nm6.硼氢化钠还原法Tschoppetal19821将预冷在4℃的40ml双蒸水中加入
0.6ml1%的HAuCl42再加入
0.2mol/LK2CO
30.2ml3在搅拌下迅速加入新鲜配制的硼氢化钠水溶液
0.5mg/ml
0.4ml一般重复加入3-5次直至溶液的兰紫色变为橙红色为至然后再搅拌5min获得的胶体金颗粒直径在2-5nm之间7.放射性胶体金的制备方法KentandAllen19811取
0.01%HAuCl4水溶液100ml加热至沸腾2加入40μl195Au3迅速加入4ml1%柠檬酸三钠水溶液5-7min出现透明的橙红色4其含量为1×106脉冲数/min5nm胶体金颗粒(5万倍)10nm胶体金颗粒(5万倍)15nm胶体金颗粒(5万倍)
四、胶体金的质量鉴定胶体金制备完毕后须经电镜下质量鉴定才能使用
(一)胶体金颗粒直径测定用预先处理好的覆有Formvar膜的镍网浸入胶体金溶液内取出放在空气中干燥或37℃内烤干然后在透射电镜下观察主要观察金颗粒的大小符合不符合所需要的颗粒直径金颗粒是否均匀一致有无椭圆形及多角形金颗粒存在理想的金颗粒是大小基本相等的圆形均匀一致无椭圆形及多角形的金颗粒存在还可以拍片放大后测量金颗粒直径的大小
(二)胶体金颗粒均匀度测定一般需测量100个以上的胶体金颗粒然后用统计学处理计算胶体金颗粒的平均直径及标准差前者反映颗粒的大小后者说明颗粒是否均匀一致
(三)影响胶体金颗粒大小的因素如果有较多大小不等的金颗粒及有椭圆形多角形金颗粒存在时应重新制备一般造成这种情况的主要原因是在加还原剂的时候不是迅速一次加入而是多次加入再者搅拌不均匀速度太慢没有搅拌起来造成了颗粒大小不等制备量的多少,容器的大小,加热的时间等也影响胶体金颗粒大小制备了合格的胶体金以后,放在室温或4℃保存避免低温冻存,因为冻存可导致胶体金凝集,破坏了胶体状态胶体金在室温避光无灰尘的环境中可放置3个月左右4℃冰箱内半年左右根据胶体金的性质,有不稳定和聚沉的可能性,因此,制备完毕后最好在20天内进行标记
五、胶体金标记的准备胶体金标记蛋白的原理,一般认为是由于pH值等于或稍偏碱的蛋白质等电点时,蛋白质呈电中性,此时蛋白质分子与胶体金颗粒相互间的静电作用较小,但蛋白质分子的表面张力却最大,处于一种微弱的水化状态,较易吸附于金颗粒的表面,由于蛋白分子牢固地结合金颗粒的表面,形成了一个蛋白层,阻止了胶体金颗粒的相互接触,而使胶体金处于稳定状态如果pH低蛋白质的等电点时,蛋白质带正电荷,胶体金带负电荷,二者极易静电结合形成大的聚合物如果pH高于蛋白质等电点,蛋白质带负电荷,与胶体金颗粒的负电荷相互排斥而不能互相结合
(一)待标记蛋白质的准备1.透析除盐:蛋白质溶液内应除去多余的电解质不然过高的盐类物质会降低胶体金颗粒的Zeta电位影响蛋白质的吸附因此标记之前必须彻底除盐一般将蛋白质置入透析袋中然后直接放入双蒸水或极低浓度的盐水
0.005mol/LNaClpH
7.0透析2.去除蛋白质中的沉淀:长期低温保存的蛋白质或4℃较长时间保存的抗体特别是在浓度高于2mg/ml的情况下很容易形成聚合物聚合物对标记过程及免疫金探针的稳定性有一定影响因此标记之前须离心以除去这些聚合物一般以1000r/min4℃离心15min取上清液调整蛋白质浓度至1mg/ml即可用于标记
(二)胶体金pH值的调整胶体金与蛋白质的结合成功与否取决于pH值一般只有在蛋白质等电点PI略偏碱的条件下二者才能牢固地结合因此标记之前须将胶体金溶液的pH值调至待标记蛋白质的等电点略偏碱需要提高胶体金的pH值时可用
0.1mol/LK2CO3需要降低胶体金的pH值时可用
0.1NHCl测定金溶液的pH可能损害pH测定计的探头因此一般用精密的pH试纸测定其pH即可常用标记蛋白质的胶体金pH值见表3-3-4
(三)待标记蛋白质最适稳定的测定1.光电比色法:制备一系列不同浓度的等体积蛋白质溶液1ml分别加入5ml胶体金中迅速混匀然后各加入1ml10%NaCl溶液摇匀静置5min后测各管的OD值根据胶体金颗粒的大小OD在520-580nm之间测定以OD值为纵座标蛋白质用量为横座标作一曲线取曲线最先与横轴相接近的那一点处的蛋白质用量为最适稳定量2.目测法:以目测法确定胶体金与待标记蛋白质用量比例将标记的蛋白质逐渐稀释后由5μg-45μg另设对照管各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中混匀5min后在上述各管内分别加入
0.1ml10%氯化钠混匀依下表3-3-5顺序进行表3-3-4常用几种蛋白质标记时胶体金所用的pH值如下蛋白质pH抗体
9.0亲合层析的IgG
7.6单克隆抗体
8.2Fab’
27.2SPA
6.0篦麻子植物凝血素Ⅰ
8.0蓖麻子植物凝血素Ⅱ
8.0花生凝集素
6.3Helixpomatialectin
7.4大豆凝集素
6.1Lensculinarislectin
6.9LotusTetragonolobuslectin
6.3荆豆凝素
6.3Bandeiraesimplicifolialectin
6.2过氧化物酶
8.0类卵粘蛋白
4.8血浆铜兰蛋白
7.0α-胎球蛋白
6.5小牛血清白蛋白
6.5牛血清球白蛋白结合肽
4.5牛血清白蛋白结合胰岛素
5.3霍乱毒素
6.9破伤风毒素
6.9DNAase
6.0RNAase
9.0低密度脂蛋白
5.5α2-巨球蛋白
6.0抗生物素蛋白亲合素
10.0链霉抗生物素蛋白
6.6麦胚凝集素
9.9表3-3-5具体的做法是按表内进行管数12345678910胶体金ml1111111111蛋白质μg51015202530354045010%NaClml
0.
10.
10.
10.
10.
10.
10.
10.
10.
10.1注明:
①当分别加入
0.1ml10%氯化钠后混匀静置2h以上观察结果未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管,即呈现由红变蓝的聚沉现象,而加蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则胶体金的红色不变其中含蛋白量最低稳定量的试管即含稳定1ml胶体金的必须蛋白量,在此基础上再加上20%即为稳定所需蛋白质的实际用量
②没有加入蛋白质的管为对照管
③小于5nm颗粒的胶体金溶液每个管内应加入5μl33%的双氧水否则有不变蓝色及聚沉现象
(四)蛋白质的胶体金标记当蛋白质的最适稳定量及标记的最佳pH值被确定以后便可进行标记具体步骤如下:1.根据用以标记的胶体金的总量计算出所需要的待标记蛋白质的总量2.在电磁搅拌下将蛋白质溶液加入胶体金溶液中pH已调至PI超过
0.5pH加入蛋白质时应逐渐加入1mg的蛋白质大约5min加完3.在磁性搅拌下加入5%牛血清白蛋白BSA使其终浓度为1%或加入3%聚乙二醇PEGMW20000使其终浓度为
0.05%我们对比了BSA和PEG稳定胶体金的效果BSA稳定的标记胶体金放在4℃达2年半仍然保持良好性能而用PEG稳定的标记胶体金放在4℃1年左右就有分层现象而且染色效果显著下降因此我们认为最好还是用BSA作稳定剂4.将标记好的胶体金装入透析袋中两头扎紧放入蔗糖或硅胶中浓缩浓缩到原体积的1/10量浓缩完毕后纯化用离心法纯化时不要浓缩
(五)胶体金标记蛋白质的纯化标记好的免疫金探针必须经过纯化处理后才能用于免疫细胞化学染色纯化的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物1.高速与超速离心法
(1)将标记的大于10nm的胶体金溶液选用1500r/min4℃离心15min吸取上清弃去沉淀以去除大的聚合物
(2)一般在10nm以上所标记的胶体金均可在高速离心机上离心小于10nm颗粒的胶体金用超速离心机离心在4℃离心1h左右弃上清将沉淀用原体积的
0.02mol/LTBSpH
8.2内含1%BSA
0.05%叠氮钠溶解重复离心2-3次沉淀溶于原体积的1/10TBS中4℃保存备用为了得到颗粒均匀一致的免疫金试剂上述粗提制剂可用10%-30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心分带收集不同大小颗粒的胶体金标记蛋白制剂几种免疫金探针离心所用转速见表3-3-6,离心纯化时所用转速见表3-3-7,胶体金的OD值见表3-3-8表3-3-6几种免疫金探针离心时所用转速参考表胶体直径nm蛋白质时间min转速r
3.0GARIgG
60300005.0GARIgG
502500010.0RAIgG
501700015.0SPA
401500015.0ALccIgG
401500020.0SPA
401300025.0SPA3512000说明:GARIgG=羊抗兔IgG;RAMIgG=兔抗鼠IgG;ALccIgG=抗肝细胞IgG;SPA=葡萄球菌A蛋白表3-3-7几种免疫金探针离心纯化时所用的转速胶体金颗粒nmpH蛋白质转速×g时间min
59.0羊抗人IgG
4500045108.2抗胃癌单克隆抗体
4500030156.5链霉亲和素
1200045206.0SPA1200030将纯化好的胶体金用
0.2mol/LTBS缓冲液作1∶20稀释用520nm测OD值表3-3-8不同大小胶体金的OD值胶体颗粒大上nmO.D520nm
52.
5102.
5153.
5205.02.凝胶过滤法
(1)将浓缩好的胶体金以1500r/min离心去掉大的聚合物吸出上清待过柱
(2)柱高34cm直径1cm加样体积为柱床体积的1/10
(3)丙烯葡聚糖S-400Sephacryls-400PharmaciaSweden装柱后用
0.02mol/LpH
8.2TBS平衡层析柱pH
7.4者用于标记的SPA平衡好后吸取上清胶体金液体加入层析柱内加样时请注意不要破坏S-400的界面
(4)用
0.02mol/LpH
8.2TBS洗脱先行滤出的液体有少量微黄不透亮的液体紧接着是浓度高红色而透亮的胶体金注意颜色的变化如红色变淡变黄立刻停止收集如Sephacryls-400没有也可以用Sepharose-4B或6B代替PharmaciaSweden也能收到较好的效果
(六)免疫金探针的鉴定1.用有Formvar膜的镍网沾取金标蛋白溶液空气中干燥后醋酸铀负染在TEM下观察可见金颗粒周围有一明显的空晕表示颗粒表面吸附着蛋白质分子2.纯化后免疫探针是否保持很好的生物学活性是判断其质量好坏的主要指标因此在使用之前必须对它的特异性敏感性进行鉴定鉴定举例用阳性抗原片脱蜡至水胰蛋白酶消化加第一抗体多克隆或单克隆一般过夜加标记同一抗种属特异性结合的胶体金抗体溶液多克隆或单克隆抗体标记的胶体金一般做1∶21∶41∶81∶16稀释,SPA金做1∶101∶201∶401∶80稀释37℃45min冲洗显色观察结果染色效价以阳性结果明确背景浅的稀释度为标准免疫细胞化学染色试验可以较全面地反应免疫金探针的质量
六、光镜免疫金银细胞化学
(一)免疫金染色1.免疫金法IGS1978年Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原建立了用于光镜水平的免疫金法ImmunogoldstainingIGSIGS的特点是染色程序简便不要显色就能检测细胞表面的抗原又能检测细胞内抗原染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm并且用的浓度较高用IGS定位细胞抗原时一般采用间接法下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明
(1)IGS的步骤1石蜡切片→脱蜡至水
20.1%胰蛋白酶消化10min或3mol/L尿素消化30min3用双蒸水振洗5min×24用
0.02mol/LTBSpH
8.2振洗10min×251%卵蛋白EA封闭10min6稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体用
0.02mol/LpH
8.2TBS作1∶100稀释4℃过夜
70.02mol/LTBSpH
8.2振洗10min×281%EA封闭10min
90.02mol/LpH
8.2的TBS稀释兔抗鼠金标抗体1∶837℃45min
100.02mol/LpH
8.2TBS振洗10min×211双蒸水振洗5min×2121%戊二醛10min13双蒸水5min14用苏木素衬染核1min甘油封片结果:在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色沿细胞膜分布表明有HBsAg定位在细胞浆内2.蛋白A-金放大法为了得到更明确的染色结果在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法使IGS得到放大这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的蛋白A-金(PAG)放大法下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法
(1)PAG放大法的步骤1石蜡切片→脱蜡至水21%胰蛋白酶消化10min或者3mol/L尿素消化30min
30.05mol/LpH
7.4TBS振洗5min×241%EA封闭组织10min5用
0.05mol/LpH
7.4的TBS稀释兔抗5-羟色胺抗体1∶10004℃过夜或者37℃1h
60.05mol/LpH
7.4TBS振洗5min×271%EA封闭10min8用
0.05mol/LpH
7.4的TBS稀释PAG1∶4037℃1h
90.05mol/LpH
7.4TBS振洗10min×2101%EA封闭10min11抗A蛋白抗体1∶10037℃45min
120.05mol/LpH
7.4TBS振洗10′×213加
0.05mol/LpH
7.4TBS稀释的PAG1∶4037℃45min
140.05mol/LpH
7.4TBS振洗10min×215双蒸水振洗5min161%戊二醛10min17双蒸水振洗5min
180.01%伊文氏蓝2min甘油封片光镜下观察小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色阳性颗粒位于细胞核底部比单纯用PAG染色深度得到加深阳性结果得到放大由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合因此与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒基本原理如图3-3-6PAG放大法的优点:
①使用试剂单一;
②可大大提高IGS的敏感性从而应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能;
③背景干净可以预见这一新方法将很快受到人们的关注图3-3-6PAG放大法原理
(二)免疫金银法1983年Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法Immunogold-sliverstainingIGSSIGSS的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用用对苯二酚还原剂将银离子Ag+还原成银原子Ag°被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”“银壳”一旦形成后本身亦具有催化作用从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大最终抗原位置得到很清楚的放大(图3-3-7)图3-3-7用银增敏示意图1.石蜡切片的IGSS染色
(1)以人HBsAg定位举例说明1片切常规脱蜡至水2lugol’液5min35%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min4用双蒸馏水冲洗干净
50.05mol/LpH
7.4TBS洗5min×26用
0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min
70.05mol/LpH
7.4TBS洗5min×181%卵白蛋白封闭15min9马抗HBsAg抗体1∶1000稀释37℃1-2h或4℃过夜
100.05mol/LpH
7.4TBS洗5min×2111%卵蛋白封闭10min121∶30稀释的PAG37℃45min
130.05mol/LpH
7.4TBS洗5min×214双蒸水5min×215在银显影液中避光显色3-5min,物理显影见后所述16双蒸水5min×217苏木素衬染18脱水透明封固结果光镜下见肝细胞胞浆内有膜状或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒背景干净2.冰冻切片的IGSS染色
(1)冰冻切片的IGSS染色作冰冻切片的组织动物试验组织可以先经过固定液灌注或浸泡固定也可不固定先做冰冻切片人的组织也可通过浸泡固定或不固定做冰冻切片这主要根据保存抗原性的需要而定固定过的组织可用20%蔗糖PBS
0.01mol/LpH
7.2浸泡2-4h或切片时用OCT包埋以减少冰冻切片过程中冰晶的形成如果切片还准备用于电镜包埋则可经过5%10%20%浓度逐级递增的蔗糖溶液在冰冻切片前可先入氟里昂22Freon-22骤冷这样可使组织的结构保存更好适用于电镜观察1冰冻切片2lugol’s液5min以下步骤同人肝HBsAg的染色方法3.半薄片的IGSS染色IGSS染色的半薄切片可以在光镜下直接观察阳性结果为电镜取阳性部位及观察打下良好的基础环氧树脂会防碍免疫组化染色经过饿酸处理后固定的组织同样也会影响抗原抗体反应因此半薄切片作IGSS染色剂应用以下处理1脱环氧树脂切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30-60min然后以无水乙醇洗5min×2再以95%80%70%酒精各洗5min然后入水2经饿酸固定过的切片入1%过碘酸10min
0.5μm厚时间可随切片厚薄增减除去饿酸然后蒸馏水洗5min×43切片用
0.05mol/LTBSpH
7.4洗10min4按石蜡切片第二步往下进行图3-3-8胶体金双标记法示意图
(三)彩色免疫金银法彩色免疫金银法colouredimmunogold-silver-staingIGSS简称CIGSS是Fritz1986在IGSS基础上发展起来的一种新方法其基本原理与彩色显影相似IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银而彩色显影剂本身则被氧化其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位金属银变成了银离子由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位所以不与组织发生非特异性吸附以人肝组织内HBsAg的CIGSS操作过程为例:
1.脱蜡至水
2.
0.1%胰蛋白酶37℃10min
3.lugol’s碘液5min
4.5%硫代硫酸钠1min
5.用
0.05mol/LpH
7.4TBS振洗5min×2
6.1%卵蛋白封闭10min
7.马抗人的HBsAg1∶1000稀释37℃1-2h或4℃过夜
8.
0.05mol/LpH
7.4TBS振洗5min×2
9.1%卵蛋白封闭10min
10.PAG1∶4037℃45min
11.
0.05mol/LpH
7.4TBS振洗5min×2
12.双蒸水洗5min×2
13.银显影见物理显影配方,3-5min避光
14.自来水冲洗
15.双蒸水振洗5min×2
16.2%铁氰化钾和1%溴化钾1min
17.双蒸水冲洗
18.彩色显影α-萘酚或菲尼酮2min
19.双蒸水冲洗
20.2%铁氰化钾和1%溴化钾1min
21.2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠5min
22.流水冲洗
23.缓冲甘油封固观察结果:光镜下见HBsAg阳性物质呈鲜艳的蓝色α-萘酚为成色剂或呈绿色菲尼酮为成色剂CIGSS的优点:
①阳性结果比黑色更鲜明;
②可以使弱信号得到放大;
③消除IGSS背景染色;
④信号/背景比值高;
⑤是开展免疫金银双标技术的新途径背景干净阳性结果清楚四免疫金及免疫金银技术的优点免疫金银技术是在免疫金基础上发展的新兴的先进的免疫细胞化学检测技术它比免疫荧光免疫酶标技术有许多独特的优点
1.制备简单制备胶体金所需要仪器设备及试剂一般实验室都具备市场上也容易购置制备方法简单易行2.标记简单抗体、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联抗体的生物活性可保持不变标记过程容易3.适用范围广胶体金银技术既能用于光镜也能用于透射及扫描电镜同时还可用于X线能谱分析在荧光显微镜上添置一块特制的滤板IGSfilterblock还可直接对胶体金颗粒进行观察金颗粒在荧光显微镜下呈现明亮的点状物定位准确敏感性高标本可长期保存4.特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用小较少受生物组织背景因素的影响在抗原或抗体的检测中显示出高度的特异性5.敏感性高由于金颗粒的电子密度很大特别适合透射电镜及扫描电镜因此免疫金银法用于电镜其检测抗原或抗体率远远超过酶反应物从而大大改进了免疫细胞化学技术在电镜水平上的分辨率光镜下金颗粒经过银显影后得到放大用于检测组织抗原时其敏感性比PAP法高200倍有人报道与放射免疫的敏感性相同我们检测乙型肝炎表面抗原时比ABC法高6倍是至今为止最为敏感的免疫细胞化学方法之一特别适合于检测石蜡切片标本中的微弱抗原
(五)在IGSS染色中常见技术问题和对策1.背景染色产生的原因
(1)第一抗体或金标抗体稀释度不合适一般容易犯抗体使用过浓的毛病错误地认为抗体越浓越好结果适得其反应该先作方阵滴定优选最佳稀释倍数既可避免非特异染色又可节省抗体
(2)使用1%卵白蛋白封闭和在抗体稀释液加入牛血清白蛋白可以减少非特异吸附降低背景染色
(3)显色的器皿必须彻底清洗化学试剂必需用三蒸馏水配制
(4)乳酸银和硝酸银的显色要在避光的环境中反应,醋酸银则可在有光的环境中显色
(5)显色时切片应垂直放置在银显影液中使过多的银颗粒下沉如水平放置易沉淀于切片上
(6)控制反应时间显影液中加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度避免形成过多的还原银非特异地吸附在切片上一般加入明胶1%-2%效果比较满意反应时间根据室温而定室温25℃左右显色时间10-15min室温在20℃以下显色时间20-30min左右
(7)洗涤:使用TBS时最好加入
0.05%-
0.1%的TritonX-100或Tween80可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白质防止出现背景的非特异染色2.背景染色已发生应如何消除
(1)2%硫代硫酸钠1%铁氰化钾对半混合加在切片上至背景无色为止
(2)2%铁氰化钾1%溴化钾混合作用1min水冲洗然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色至背景干净为止
(3)
0.1%重铬酸钾加入
0.25%浓硫酸在显微镜下控制脱色时间至阳性结果清楚无背景为止然后用5%硫代硫酸钠漂白注意时间不要过长以免阳性结果被脱掉
(4)用
0.3%-1%的H2O2处理切片也可消除背景的银颗粒但必须在显微镜下控制脱色时间防止把阳性结果脱掉3.彩色显影背景过染的处理方法彩色免疫金银法在胶体金技术中是一个很大的突破它的优点是结果鲜明对比度好但是在彩色显影过程中时间过长背景可有一些着色彩色显影的时间控制很重要一旦过染可用下列方法处理
(1)纯酒精滴到切片上3-5s立即冲掉水洗充分地把酒精洗掉如果洗不彻底造成阳性结果脱色
(2)75%的酒精滴到切片上1min立即冲掉脱色不能时间过长过长后阳性结果全部脱掉
(六)物理显影液及缓冲液的配制1.缓冲液的配制
(1)
0.05mol/LpH
7.4的TBS配制Tris三羟甲基胺基甲烷
12.1gNaCl
17.5g加双蒸水1900ml然后用浓HCl调至pH为
7.4再加双蒸水至2000ml
20.02mol/LpH
8.2TBS配制Tris
4.84gNaCl
17.5gBSA
2.0gNaN
31.0g双蒸水1900ml充分搅拌至溶质完全溶解用浓HCl调pH至
8.2再加双蒸水至2000ml
2.银显影液的配制1乳酸银显影液的配制110%阿拉伯胶水溶液60ml2枸橼酸缓冲液pH
3.510ml3对苯二酚1g加双蒸水20ml溶解4乳酸银水溶液100mg加水10ml注意在暗处显影2硝酸银显影液的配制110%阿拉伯胶水溶液60ml枸橼酸缓冲液pH
3.510ml2对苯二酚
1.7g水溶液30ml3硝酸银40mg水溶液2ml12两液完全溶解临用前加入硝酸银溶液在暗处显影3硝酸银显影液的配制1双蒸水60ml枸橼酸缓冲液pH
3.510ml2对苯二酚
1.0g水溶液30ml3硝酸银35mg水溶液2ml12两溶液完全溶解临用前加入硝酸银溶液在暗处显影4彩色显影液的配制
10.2N氢氧化钠的异丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚或菲尼酮2500mg碳酸钠25mg溴化钾50mg亚硫酸钠加双蒸水25ml12两液1∶10混合室温下彩色显影5醋酸银显影液115%阿拉伯胶60ml柠檬酸缓冲液10mlpH
3.52对苯二酚
1.7g溶于20ml蒸馏水中3醋酸银100mg溶于蒸馏水10ml中用前123依次混合不需要避光在室温下显影
3.柠檬酸缓冲液的配制柠檬酸C6H8O7·H2O
25.5g柠檬酸三钠Na3C6H5O7·2H2O
23.5g加双蒸水100ml溶解即成pH
3.5
4.氢氧化钠NaOH无水乙醇饱和溶液的配制8g氢氧化钠加入100ml无水乙醇振摇溶解即成
七、现状与展望免疫金技术是Faulk和Taylor在1971年建立的为了增强它的敏感性及对比度,1981年Dascher等人建立了免疫金银法1986年Fritz等人建立了彩色免疫金银法,由于彩色免疫金银法操作很复杂,至今未被人们广泛应用免疫金技术是免疫组织化学方法中最敏感的方法之一,由于制备简单,标记简单,无毒,在免疫组织化学中得到广泛应用,尤其是同Biotinavidin凝集素,ConA及SPA的结合,大大拓宽了应用的范围,胶体金无毒性,用不同大小颗粒的胶体金对脑水肿,肺水肿动物模型的示踪研究取得了重大突破,为早期治疗脑水肿及肺水肿的发生提供了理论依据免疫金技术由于它电子密度高这一独特的优点,这一方法的建立,大大推动了免疫和DNA,RNA分子杂交电子显微镜技术的发展,还可以利用不同大小颗粒的胶体金进行电镜标栖的免疫单标记、双标记及三标记当今单克隆抗体大量的出现,结合免疫金技术建立了多种快速检验技术,如早孕、乙型肝炎等诊断试剂盒,肉眼观察阳性结果,在以后的免疫诊断和研究中将有更广泛的应用和更大的发展参考文献
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