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CathepsinB、uPA和uPAR基因在肝细胞肝癌中的表达、相互关系及作用【摘要】目的:探讨肝细胞肝癌(HCC)__中__蛋白酶BCB、尿激酶型纤溶酶原激活物uPA及其受体(uPAR)基因的表达、相互关系及作用,并分析其机制方法:应用RT-PCR方法测定71例肝__标本,包括对照组(C)12例,HCC组34例和癌旁__(PTT)组25例的CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA表达,分析其间的相关性结果:HCC组CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA表达均明显高于C组和PTT组,差异有显著性(Plt;
0.01),PTT组与C组间差异均无显著性(Pgt;
0.05)CBmRNA与uPAmRNA(r=
0.805),CBmRNA与uPARmRNA(r=
0.786),uPAmRNA与uPARmRNA(r=
0.874)之间均存在显著的正相关关系(均Plt;
0.01)结论:肝癌__CBmRNA、uPAmRNA、uPARmRNA均呈现高表达,它们之间可能相互诱导,协同促使肝癌的侵袭和转移【关键词】癌肝细胞__蛋白酶B尿纤溶酶原激活物尿纤溶酶原激活物受体Expression,relationshipandeffectofgeneofcathepsinB,urokinase-typepla__inogenactivator(uPA)anditsre__ptor(uPAR)inhepato__llularcarcino__XUChang-long*,ZHENGJun-jie,___Zhan-xiong,HUANGZhi-ming.*DepartmentofDigestiveMedicine,theSecondAffilatedHospitalofWenzhouMedicalCollege,Wenzhou,325027Abstract:O__ective:TodeterminetheexpressionrelationshipandfunctionofgeneofcathepsinBCB,urokinase-typepla__inogenactivator(uPA)anditsre__ptor(uPAR)inhepato__llularcarcino__,andtoexploretheireffectsandmechani__.Methods:TheexpressionofCBmRNA,uPAmRNAanduPARmRNAin71specimensofhu__nhepatictissue,includingcontrolC12,hepato__llularcarcino__HCC34andparatumortissueofhepato__llularcarcino__PTT25weredetectedwithreversetranscription-polymerasechainractionRT-PCR.TheexpressionofrelationshipamongCBmRNAuPAmRNAanduPARmRNAwereresearched.Results:TheCBmRNAuPAmRNAanduPARmRNAinHCCwereverysignificantlyhigherthanthoseinCandinPTT(allPlt;
0.01);therehadnosignificantdifferen__betweenPTTandCallPgt;
0.
05.ThereweresignificantcorrelationbetweentheexpressionofCBmRNAanduPAmRNA(r=
0.805),CBmRNAanduPARmRNA(r=
0.786),uPAmRNAanduPARmRNA(r=
0.874)(allPlt;
0.01).Conclusion:TheCBmRNA,uPAmRNAanduPARmRNAshowstronglyexpressioninHCCandthey__yindu__eachotherpromotecooperativelyinvasionandmetastasisofHCC.Keywords:hepato__llularcarcino__;cathepsinB;uPA;uPAR;neopla__invasiveness;neopla__metastasis基底膜和细胞外基质是肿瘤细胞侵袭的第一道屏障目前研究发现,__蛋白酶BCathepsinB,CB对基底膜和细胞外基质的降解是恶性肿瘤侵袭转移的关键步骤之一
[12],尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase-typepla__inogenactivator,uPA)与其受体(urokinase-typepla__inogenactivatorre__ptor,uPAR)构成的uPA/uPAR系统介导的纤溶酶系统可能在其中发挥核心作用
[3],而它们在肝细胞肝癌(hepato__llularcarcino__,HCC)演进过程中的变化特点、相互关系鲜见报道本研究应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测肝细胞肝癌__中CB、uPA和uPAR基因表达,分析其间的相关性,探讨它们在HCC侵袭转移中的作用和机制1材料和方法
1.1试剂与仪器CB、uPA、uPAR、β-action基因引物序列采用PrimerPremier
5.0自行设计,由北京赛百盛基因技术有限公司代为合成,并用高效液相色谱法(HPLC)确认合成产物的纯度Trizol总RNA提取试剂盒(LifeTechnologies公司生产)PE2400PCR扩增仪(Perkin璄mer公司生产)
1.2标本采集及分组取自2002-2004年温州医学院第
一、第二附属医院手术切除的肝__所有标本离体30min内经
0.1%DEPC清洗后装入冻存管,置-140oC液氮储存箱保存待用分为
①对照组(control,C组)12例(肝外伤手术标本,病理证实为正常肝__)
②肝细胞肝癌癌旁__组(paratumortissueofhepato__llularcarcino__,PTT组)25例(临床诊断为肝癌,根治性手术切除的癌旁__,距肝癌原发灶5cm以上,病理确认为晚期肝硬化)
③HCC组34例(临床诊断为肝癌,根治性手术切除的标本,病理确认为HCC)
1.3逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测CB、uPA、uPAR基因取50mg标本__,制成匀浆,冰浴下加入Trizl提取总RNA;采用M-MuLV按标准程序进行逆转录;续PCR扩增基因引物序列为
①CBmRNA:正链5′瑼CA__CCGACCTACAAACAG′负链5′瑿CAGTAGGGTGT__CATTCT′产物为239bp
②uPAmRNA正链5′瑼TCA__TTCACAACAGTCAT′,负链5′瑼GAATTCACCACCATCGAGA′,产物为474bp
③uPARmRNA正链5′瑿AGACTT__TGTGTGACCTCA′,负链5′瑼ATAACAACAACACAACA__GG′,产物为184bp
④β-action正链5′瑿AGCTACAGCTTCACCACCA′,负链5′璆TCACCTTCACCGTTCCAGT′,产物为696bp电泳结束后取出凝胶,用I__ge__sterVDS成像系统摄影,图像分析软件TotallabV101行灰度扫描分析以目的基因与β-actin的PCR产物条带灰度值之比作为其mRNA水平的相对量RT-PCR反应体系中未加入逆转录酶的作为空白对照
1.4统计学处理方法采用SPSS
13.0软件完成多组样本均数比较进行方差齐性检验,组间比较用单因素方差分析,方差齐性者用LSD法,方差不齐者行Games-Howell法2结果
2.1三组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的表达情况RT-PCR实验显示,HCC组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的产物条带亮度明显高于PPT组和C组,PPT组与C组的条带亮度差异不大(见图
1、
2、3);HCC组CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA的条带光密度比值均高于C组和PTT组,差异有显著性(均Plt;
0.01)PTT组与C组比较三指标差异均无显著性(均Pgt;
0.05),见表
12.2CBmRNA,uPAmRNA和uPARmRNA表达的相关性分析将全部71例肝__RT-PCR实验的CBmRNA、uPAmRNA和uPARmRNA表达做相关分析表明,CBmRNA与uPAmRNA(r=
0.805),CBmRNA与uPARmRNA(r=
0.786),uPAmRNA与uPARmRNA(r=
0.874)之间均存在显著的正相关关系(均Plt;
0.01)3讨论CB属半胱氨酸蛋白水解酶,能在酸性环境中分解蛋白质,__肿瘤细胞生长,参与肿瘤血管生成,溶解基底膜、细胞外基质和结缔__[1,2],还可激活uPA
[4]uPA是一种由内质网膜系统合成的丝氨酸蛋白水解酶uPAR是uPA的特异性受体,广泛存在于体内多种血细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞及某些肿瘤细胞上uPA只有和uPAR同时表达时,才能发挥作用uPAR可在细胞表面浓集uPA,而uPA又可上调uPAR的表达
[5]在uPAR的参与下,uPA对纤溶酶原的激活为正反馈逐级放大效应CB、uPA及其激活的其他蛋白水解酶促进细胞外基质(包括层黏连蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖和IV型胶原等)和血管基膜的降解
[6]uPAR与玻黏蛋白(vitronectinVN)及整合素相互作用,增强细胞黏附,参与uPA__传导和细胞趋化,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤血管生成
[78]本研究结果显示,肝癌__中CB、uPA和uPAR基因皆呈现高表达,表明恶性肿瘤的侵袭转移是一个多种细胞外基质降解酶参与的复杂变化相关性分析显示,随着CBmRNA表达的增强,uPAmRNA和uPARmRNA的表达也相应地增强,其间存在高度的正相关关系,表明它们对细胞外基质的酶解是相互__、协同促进的,其可能是由于CB高表达诱导、激活uPA
[4],uPA又上调uPAR的表达
[5],进而促进uPA介导的纤溶酶系统降解细胞外基质和基底膜的连续过程而导致侵袭与转移Sameni等
[910]采用免疫荧光法对人类神经胶质瘤和乳腺癌细胞表面CB对IV胶原降解图像的分析也表明,CB既可以直接降解肿瘤细胞外基质,又可以通过激活蛋白水解级联的下游蛋白酶uPA,间接促进肿瘤细胞外基质降解有实验显示,细胞表面存在膜联蛋白II异四倍体(annexinIIheterotetramerAIIt)结构,它是一种细胞表面结合蛋白,既能与CB前体结合,又能与单链和双链的成熟CB结合,在多种恶性肿瘤__中表达上调,尤其是转移性癌细胞的表面;肿瘤细胞表面的AIIt可能提供一种对接平台或媒介,把CB和uPA等以及能被它们水解的底物连接到几近闭合的细胞表面,促进细胞外基质蛋白的降解,导致恶性肿瘤的侵袭转移
[11]【____】
[1]PodgorskiISloaneBF.CathepsinBanditsrolesincan__rprogression[J].BiochemSocSymp20037022:263-
276.
[2]RoshySSloaneBFMoinK.Peri__llularcathepsinBand__lignantprogression[J].Can__rMetastasisRev2003222-3:271-
286.
[3]__cchioneEEpifanoOStefaniniMetal.Urokinaseredistributionfromthesecretedtothe__ll-boundfractioningranulosa__llsofratpreovulatoryfollicles[J].BiolReprod2000624:__5-
903.
[4]HalangkWLerchMMBrandt-NedelevBetal.RoleofcathepsinBinintra__llulartrypsinogenactivationandtheonsetofacutepancreatitis[J].JClinInvest20001066:773-
781.
[5]MontuoriN__ttielloA__nciniAetal.Urokinase-mediatedposttranscriptionalregulationofurokinase-re__ptorexpressioninnon__all__lllungcarcino__[J].IntJCan__r20031053:353-
360.
[6]AgnantisNJGoussiaACBatistatouAetal.Tumor__rkersincan__rpatients.anupdateoftheirprognosticsignifican__[J].InVivo2004184:481-
488.
[7]MontuoriNVisconteVRossiGetal.Solubleandcle__edformsoftheurokinase-re__ptor:degradationproductsoractivemolecules[J].ThrombHaemost2005932:192-
198.
[8]RabbaniSA__zarAP.Theroleofthepla__inogenactivationsysteminangiogenesisandmetastasis[J].SurgOncolClinNAm2001102:393-
415.
[9]SameniMMoinKSloaneBF.I__gingproteolysisbylivinghu__nbreastcan__r__ll[J].Neoplasia200026:495-
504.
[10]SameniMDosescuJSloaneBF.I__gingproteolysisbylivinghu__nglio____ll[J].BialChem20013825:785-
788.。