cIAP2与Smac基因在白血病中的表达及其临床意义

c-IAP2与__ac基因在白血病中的表达及其临床意义【摘要】为了研究c-IAP2及其拮抗素__ac基因在白血病中的表达及对__急性白血病（AL）患者的预后意义，采用半定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测103例白血病患者c-IAP

2、__ac的mRNA表达水平，20名健康人为正常对照，K

562、Kg-1a细胞株为阳性对照结果表明c-IAP

2、__ac在初治AL中的表达较正常对照组明显升高，两者的表达为高度正相关，治疗缓解后c-IAP

2、__ac的表达明显下降，与初治AL组有明显差异（Plt;

0.05），复发后c-IAP

2、__ac基因的表达又复升高c-IAP2mRNA和__acmRNA在慢性粒细胞性白血病慢性期（CML-CP）组的表达率和表达水平均高于正常对照组，但无统计学意义（Pgt;

0.05）在初治AL患者中，c-IAP

2、__ac表达阳性的患者缓解率均低于表达阴性的患者结论c-IAP2mRNA、__acmRNA过度表达和急性白血病的发病呈正相关；c-IAP

2、__ac高表达的患者完全缓解率低，预后不良；c-IAP

2、__ac可作为急性白血病的发病、复发及预后判断的指标之一【关键词】白血病　　Expressionsofc-IAP2and__acGeneinLeukemiaandTheirClinicalSignifican__　　AbstractToinvestigatetheexpressionsofc-IAP2and__acinleukemiaandtheirprognosticsignifican__in_____patientswithacuteleukemiaAL，themRNAexpressionsofc-IAP2and__acin103AL_____patientsweremeasuredbysemi-quantityreversetranscriptionpolymerschainreactionRT-PCR.Other20_____swereselectedasnor__lcontrolsNC，K562andKg-1α__lllineswereemployedaspositivecontrol.Theresultsshowedthattheexpressionsofc-IAP2and__acindenovoALpatientswerehigherthanthoseinNC，whiletheydecreasedinpatientsatcompleteremissionCR.Inrelapsedpatients，theexpressionsofc-IAP2and__acincreasedagain.ThemRNAexpressionofc-IAP2and__acinCML-CPwerehigherthanthatofNC，butnostatisticalsignifican__wasfoundPgt;

0.

05.InALpatients，theCRrateofc-IAP2+and__ac+caseswerelowerthanthoseofc-IAP2-and__ac-cases.Itisconcludedthatoverexpressionofc-IAP1and__ac__yplayasynergicroleinthepathogenesisofAL，andthereisapositivecorrelationbeweenthem.Thec-IAP2and__acexpressionsareassociatedwithremissionrateinAL，whilethepatientswithhighlevelofc-IAP2or__ach__elowremissionrates.Itseemsthatc-IAP2and__acserveas__rkersofpoorprognosisinAL.　　Keywordsleukemia;c-IAP2gene;__acgene;apoptosis　　白血病为最常见的肿瘤之一，虽然骨髓移植和联合化疗改善了其预后，但一部分患者仍很难达到完全缓解或缓解后复发目前的研究显示，肿瘤的发生、发展与细胞凋亡的紊乱密切相关本研究应用RT-PCR研究白血病患者在初治、化疗缓解后、复发时c-IAP

2、__ac基因水平的变化，探讨c-IAP

2、__ac在白血病中表达的相互关系，对白血病发病机制及预后因素作初步探讨　　材料和方法　　病例选择　　研究对象包括86例__急性白血病（AL）患者初治急性白血病患者62例、复发9例、缓解15例和17例慢性粒细胞白血病（CML-CP）患者，20名健康人作为正常对照组（NC），K

562、Kg-1α细胞株作阳性对照患者均为我院血液内科2003年2月-2004年12月期间住院和门诊随访的病人，经过骨髓细胞形态学、__化学、免疫表型、融合基因、染色体等检查确诊，均符合FAB诊断标准初治的患者化疗1疗程后复查骨髓象判断是否完全缓解（CR），CR的判断标准参照张之南主编的《血液病诊断及疗效标准》　　单个核细胞的分离　　取骨髓液4ml，缓慢加至等量的淋巴细胞分离液上，1200×g离心20分钟，分离中间的单个核细胞，加入3ml

0.84％氯化胺，吹打混匀，静置5分钟，裂解混入的红细胞，900×g离心5分钟，弃去上清液，用PBS液洗涤2遍，-80℃保存待用　　细胞总RNA的提取　　用TRIZOL提取细胞总RNA在紫外透射仪上显示有28S、18S（部分可见到5S）两条rRNA，说明提取的RNA完整　　cDNA合成　　细胞总RNA2μl，50U/μlRNasin

0.5μl，5×逆转录反应缓冲液3μl，10mmol/LdNTP

1.5μl，50μg/ml随机引物1μl，AMV逆转录酶15U，25mmol/LM__l

20.5μl42℃反应90分钟，95℃5分钟后终止反应　　引物设计　　c-IAP2正义引物:5’-TCCTA__T__AGATTCGTTC-3’；反义引物:5’-GGTAACTG__TTGAACTTGAC-3’扩增片段746bp__ac正义引物5’-CCTGTGT__GGTTCCTATT__-3’；反义引物5’-TGATTCCTG__GGTTATAGAG-3’扩增片段399bp　　PCR反应　　反应体系包括逆转录产物2μl，10pmol/μl上、下游引物各

2.5μl，10mmol/LdNTP

0.5μl，10×PCR反应缓冲液

2.5μl，25mmol/LM__l

21.5μl，TaqDNA聚合酶

1.25U，其余以DEPC水补足至25μlc-IAP2的扩增条件为94℃2分钟，1个循环，94℃45秒，54℃45秒，72℃45秒，35个循环最后72℃延伸10分钟__ac的扩增条件为94℃40秒，54℃60秒，72℃60秒，32个循环最后72℃延伸10分钟　　PCR产物分析　　扩增产物经2％琼脂糖电泳（98V，50分钟）后，紫外透射仪下观察并照相，并在读胶仪EagleEyeⅡ上进行扫描定量以相关基因与内对照β-actin的比值代表其mRNA表达水平　　治疗方案　对于初治AML患者采用标准DA化疗方案（阿糖胞苷、柔红霉素）诱导缓解复发AML患者分别采用AME（阿糖胞苷、米托蒽醌、足叶乙甙）、IA（阿糖胞苷、去甲氧柔红霉素）等化疗方案M3患者采用全反式维甲酸（ATRA）或ATRA与三氧化二砷（As2O3）合用或以ATRA为主，联合应用小剂量DA（阿糖胞苷、柔红霉素）、HA（阿糖胞苷、高三尖杉酯碱）方案诱导分化治疗复发、难治的M3应用三氧化二砷治疗对于ALL患者选用化疗方案VITP（长春地辛、异环磷酰胺、吡喃阿霉素、___）治疗对于CML患者应用羟基脲和小剂量化疗加干扰素治疗　　统计学处理　　结果用SPSS

10.0统计软件进行统计学处理分别应用t检验、χ2检验和相关分析Plt;

0.05有统计学意义　　结果　　正常对照组和AL患者组中c-IAP2mRNA的表达c-IAP2mRNA在正常人中的表达率为

0.0%（20例全部阴性），基因相对表达水平（c-IAP2/β-acitn）为0，平均水平为0；在初治的AL患者62例中，c-IAP2mRNA的阳性率为

58.1%（36/62），表达水平为0-

1.471，平均水平为

0.494，其表达水平较正常对照组明显升高，差异具有显著性（P=

0.000）复发组的阳性率为

66.7%（6/9），表达水平0-

1.325，平均表达水平为

0.554，与正常对照组比较明显升高，差别有显著性（P＝

0.010）；较初治AL组表达水平高，但无统计学意义（P＝

0.741）在15例缓解组中，c-IAP2mRNA的阳性表达率为

20.0%（3/15），表达水平0-

1.571，平均表达水平

0.202，与正常对照组相比表达水平高，但无统计学意义（P＝

0.___）；然而，表达水平低于初治AL组，且差别有显著性（P＝

0.044）电泳结果见图1　　正常对照组和AL患者组中__acmRNA的表达　　__acmRNA在正常人中的表达率为

5.0％（1/20），基因相对表达水平为0-

0.462，平均水平为

0.031在初治AL组__acmRNA的阳性率为

74.2％（46/62），表达水平为0-

1.982，平均表达水平为

0.554，高于正常对照组，有显著性差异（P＝

0.000）在复发的9例患者中，__acmRNA表达阳性者为7例（

77.8%），平均表达水平为

0.583，高于正常对照组，差别有显著性（P＝

0.003），比初治AL组高，但无统计学意义（P＝

0.158）在15例缓解组中，__ac　mRNA的阳性表达率为

26.7％（4/15），表达水平为0-

1.263，平均水平为

0.244，与正常对照组相比较表达水平高，但无统计学意义（P＝

0.07）；但其表达水平低于初治AL组，且差别有显著性（P＝

0.009）电泳结果见图2　　AL患者c-IAP2和__acmRNA表达水平的相关分析　　c-IAP2和__ac双阳性的患者33例（

53.2%），双阴性的12例（

19.4%），__ac+/c-IAP1-或__ac-/c-IAP1+的患者17例（

27.4%），对初治的62例AL患者的c-IAP2和__acmRNA表达水平进行直线相关分析，发现两者的mRNA水平成正相关（r＝

0.472，P＝

0.000）　　c-IAP2和__acmRNA在CML中的表达　　我们应用RT-PCR检测了17例CML慢性期患者的c-IAP2和__acmRNA的表达，其中慢性期c-IAP2的表达阳性率为

5.9％（1/17），表达水平0-

0.230，平均表达水平

0.019，高于正常对照组，但无统计学意义（P＝

0.332）__acmRNA在CML慢性期的表达率为

17.6%3/17，表达水平0-

0.930，平均表达水平

0.112，也高于正常对照组，但无统计学意义（P＝

0.479）　　c-IAP2和__acmRNA的表达与缓解率的关系　　62例初治AL患者中51例可进行疗效评估（3例早期死亡，5例未治疗，3例治疗过程中自动出院）其中，c-IAP2＋组缓解率为

62.1%18/29），c-IAP2-组缓解率为

90.1％（20/22）c-IAP2-组的缓解率高于c-IAP2＋组，进行χ2检验分析发现，差别有显著性（χ2＝

7.674，P＝

0.006）__ac＋组的缓解率为

60.0％（21/35），明显低于__ac-的缓解率

87.5％（14/16），两组之间有显著性差异（χ2＝

5.472，P＝

0.019）　　讨论　　凋亡抑制蛋白（IAP）是一族在人类进化过程中相当保守的凋亡抑制蛋白，所有IAP成员都含有1-3个杆状病毒凋亡抑制重复蛋白（baculovirusIAPrepeat，BIR）结构，与抗凋亡作用密切相关c-IAP2是IAP家族的主要成员，定位于11q22-23，含有3个BIR结构域和一个ring结构域及一个card结构c-IAP2抑制凋亡的作用机制是直接抑制caspase家族成员介导的蛋白酶级联反应过程中的位于下游的caspase-

3、caspase-

7、caspase-9及caspase-9前体的活性__ac/DIABLOsecondmitochondrialactivatorofcaspase/directIAPbindingproteinwithlowPI则是一种新发现的促凋亡蛋白，其基因位于12号染色体长臂，由7个外显子组成__ac发挥促凋亡作用的机理是和IAP结合，解除IAP对caspase的抑制作用在正常__中c-IAP2在肾、小肠、肝、肺中高表达，而在中枢神经系统中表达最低［1］__ac在正常__睾丸中表达水平最高，在心、肝、肾、脾、前列腺、卵巢中也有较高表达，但在脑、肺、胸腺以及外周血粒细胞中则低表达在人类肿瘤__中，c-IAP2和__ac的表达也很为广泛Tamm等［2］曾研究了c-IAP2在60多种肿瘤细胞系中的表达情况，c-IAP2广泛表达于各种肿瘤细胞中，3452%种肿瘤细胞株中都有不同程度的表达Adrain等［3］则发现__acmRNA也在肿瘤细胞中广泛表达，包括源于单核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞及上皮样细胞的肿瘤细胞系，同时，在

293、Jurket、HeLa、MCF-7等多种细胞株中也发现有__ac的表达［4］在我们的研究中，c-IAP2和__ac基因在两种白血病细胞株Kg-1α、K562也都表现出异常高的表达水平在初治AL组，c-IAP2　mRNA的表达率和表达水平明显高于正常对照组，且有显著性差异（Plt;

0.05）；其拮抗素__acmRNA的表达率和表达水平也明显升高，两者表现为高度正相关，提示c-IAP2和__ac基因的异常高表达和白血病的发病密切相关而在17例CML中c-IAP2和__ac基因的表达水平均高于正常对照，但无统计学意义（Pgt;

0.05），我们认为在CML的发病过程中两者并不起主要的作用AL经治疗达到完全缓解后，c-IAP2和__acmRNA的表达明显下降，与正常对照组无显著性差异，而在9例复发患者，两者的表达水平再次升高，明显高于正常对照组和缓解组，而与初治组无明显差异，所以我们认为，可以通过对c-IAP2和__ac基因表达的监测来判断急性白血病的病情变化，它们表达水平的增高是AL患者复发的高危因素前面已经提到，__ac发挥促凋亡作用是通过和IAP作用，它解除IAP对caspase-

9、

3、7的抑制作用，进而引起这3种caspase相继被激活并发生caspase的级联放大反应，从而使凋亡得以延续但是，__ac并不引起正常的细胞发生凋亡，同时不能对抗bcl-2对凋亡的抑制作用［

3、5］在我们的研究中发现，__acmRNA在急性白血病细胞中的表达明显增高，和c-IAP2呈高度正相关我们认为，白血病的患者出现抗凋亡和促凋亡基因的协同升高，是因为__ac在细胞凋亡中起到了解除IAP对凋亡的抑制作用，在正常细胞中它不诱发凋亡c-IAP2mRNA的表达的升高，可能是通过某种__的__而引发__ac表达的相应的升高，以抑制c-IAP2的过度表达，因此__ac基因在AL中的表达升高是c-IAP2表达升高的一种伴随现象在研究中我们还发现c-IAP2和__ac表达阴性患者的完全缓解率高，而表达阳性患者的完全缓解率低，预后不良因此我们认为，c-IAP2和__ac还可以作为判断预后的重要指标关于c-IAP2高表达造成CR率低的原因，我们认为可能是c-IAP2高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降所致抗肿瘤药物杀伤癌细胞多数是通过凋亡路径来实现的，肿瘤对抗癌药物的耐药是由于凋亡__的缺失［6］目前已知多种凋亡抑制因子可以降低肿瘤细胞对化疗的敏感性，如bcl-2和c-IAP1的高表达的肿瘤细胞对抗癌药物耐药，由此我们推测，c-IAP2的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素综合前述，c-IAP2和__ac在初治AL表达增高，缓解后表达减少或转阴，复发时再次增高同时，c-IAP2和__ac表达阳性的患者缓解率低，且易复发因此，c-IAP2和__ac可作为判断白血病患者预后的__因素【____】　　1YoungSS，ListonP，XuanJY，etal.Genomicorganizationandphysical__pofthehu__ninhibitorsofapoptosis:HIAP1andHIAP

2.__mmGenome，1999;10:44-48　　2TammI，Kornblau__，SegallH，etal.Expressionandprognosticsignifican__ofIAP-Familygenesinhu__ncan__rsandmyeloidleukemias.ClinCan__rRes，2000;6:1796-1803　　3AdrainC，CreaghEM，__rtinSJ.Apoptosis-associatedreleaseof__ac/DIABLOfrommitochondriarequiresactivecaspaseandisblockedbyBcl-

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