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IFN-γ上调的单核细胞表面MHC-I类链相关分子促进NK细胞活化__王惠明王沂芹阮志华傅晓岚徐文岳赵婷婷吴玉章【摘要】 目的:研究IFN-γ诱导上调表达的单核细胞MHC-I类链相关分子MICs分子对NK细胞的活化作用方法:采用密度梯离离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC)以免疫磁珠法从PBMC中特异性分选单核细胞及NK细胞以细胞因子IFN-γ、TNF-α__单核细胞后再将单核细胞与NK细胞共培养以流式细胞术(FCM)检测NK细胞表面CD69分子及胞内IFN-γ表达以51Cr释放试验检测NK细胞对K562细胞的杀伤效应结果:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs表达;IFN-γ__的单核细胞能促进异体NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达能增强NK细胞对K562细胞的杀伤效应;单核细胞的这种效应至少部分依赖于IFN-γ上调的MICs分子因为用抗MIC抗体封闭或用细胞小室阻断细胞接触可以明显地抑制NK细胞的活化结论:IFN-γ上调人单核细胞表面MICs分子介导了NK细胞的活化【关键词】单核细胞IFN-γMHC-I类相关分子NK细胞 活化的淋巴细胞(含NK、T、NKT细胞)分泌的细胞因子γ干扰素(IFN-γ)不仅具有直接的抗病毒作用更具有强大的免疫调节和修饰功能目前认为IFN-γ能广泛地作用于体内包括淋巴细胞在内的多种细胞对于单核细胞IFN-γ一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化;另一方面IFN-γ还能诱导单核细胞产生系列细胞因子[12]机体单核细胞正常情况下处于免疫静息状态但在适宜的条件下它可以通过转化为DC或者分泌大量细胞因子来参与或调节免疫应答最近研究发现单核细胞与NK细胞或T细胞之间存在着对话机制并且IFN-γ及细胞间的直接接触是介导单核细胞与淋巴细胞相互作用的关键因素[3]NKG2D是同时表达于人类NK细胞及CD8+T细胞表面的活化受体对于NK细胞它直接启动活化__;对于CD8+T细胞它提供重要的共____[4]MHC-I类链相关分子MIC是最早发现并且研究最多的NKG2D受体的配体MIC是一种应激诱导表达的分子当细胞处于热休克、氧化、感染等状态时MIC分子即被诱导表达于细胞表面细胞表面的MICs作为一种应激“标记”分子能够被NK细胞或CD8+T细胞表面的NKG2D受体识别并__或共__NK细胞或CD8+T细胞活化最终清除异常细胞研究发现MICs分子低水平的表达于某些正常__细胞如肠上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞表面单核细胞表面未见MICs表达[5]NKG2D还在NK细胞、T细胞、DC及其他__细胞中起着重要的“桥梁”作用[6]但NKG2D是否也在单核细胞与NK细胞对话中发挥作用?IFN-γ作用的单核细胞是否通过MIC-NKG2D促进NK细胞活化?我们对此进行了探讨 1材料和方法
1.1材料FITC标记抗人CD3(OKT3)、CD14(61D3)、CD69(FN50)、IFN-γ(4S.B3)单克隆抗体(__b)、纯化及生物素化抗人NKG2D1D11__b、PE标记抗人CD56__bNCAM、抗体的各同型对照抗体均购于eBioscien__公司;小鼠抗人MICs__bclone159207购于Ramp;D公司;FITC标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG二抗购自北京中山生物技术有限公司小鼠抗人CD14免疫磁珠(CD14__gneticParticlesCloneMфP9)、磁性细胞分离架购于BDBioscien__Pharmingen公司;人重组干扰素-γ(IFN-γ)、重组干扰素-α(IFN-α)购自PeProtech公司;人淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)购自天津TDB生物技术发展中心;胎牛血清购自HyClone公司;FACSCalibur流式细胞仪购于BD公司
1.2方法
1.
2.1人PBMCs的分离及单核细胞、NK细胞的分选健康志愿者外周血用生理盐水作等倍稀释后按标准密度梯度离心法分离PBMCs单核细胞及NK细胞采取阴性分选和阳性分选相结合的序贯分离法按说明书操作进行先从PBMCs中分选CD14+细胞再从其CD14-组分中去除CD3+细胞最后从CD3-CD14-组分中分选CD56+细胞即为CD3-CD56+NK细胞取少量细胞分别行CD
14、CD3/CD56流式细胞术(FCM)检测确定CD14+及CD3+CD56-细胞的纯度(gt;90%)
1.
2.2细胞株培养人红白血病细胞K562由本研究所保存培养于含100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液中
1.
2.3单核细胞/NK细胞共培养纯化的单核细胞按
2.5×108个/L接种于24孔培养板中根据实验需要加或不加50mg/LTNF-α或1000mg/LIFN-γ培养24h后用无血清RPMI1640液洗细胞2次再以含100mL/LFCS的RPMI1640完全培养液悬浮并按2×108个/
0.5L/孔接种细胞于48孔板内;纯化的异体NK细胞用RPMI1640完全培养液悬浮并调整细胞密度为4×108个/L按每孔
0.5mL接种于单核细胞培养板内使总体积为1mL如果要阻断NK细胞与单核细胞的直接接触可先在单核细胞培养板内放入细胞小室再将NK细胞加于小室中;如要作抗体阻断试验可在共培养体系中加入抗MICs__b159207或抗NKG2D阻断抗体继续培养24h
1.
2.4NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达分析收集共培养细胞用流式洗液洗细胞2次后将各组细胞等分成相应管数每管细胞悬液体积约50μL采用PE-CD56/FITC-CD69或PE-CD56/FITC-IFN-γ双色流式检测简述如下:如检测NK细胞CD69表达在细胞悬液中加入PE-CD56/FITC-CD69单克隆抗体或其同型对照抗体4℃避光孵育20min流式洗液洗细胞1次再以10g/L多聚甲醛悬浮细胞即可上机检测;如作NK细胞胞内IFN-γ染色先在细胞悬液中加入PE-CD56__b或其同型对照抗体4℃避光孵育20min流式洗液洗细胞1次再以细胞固定液固定细胞10min用细胞通透液洗细胞2次后用50μL流式洗液悬浮细胞加入FITC-IFN-γ__b或其同型对照抗体4℃避光孵育20min细胞通透液洗细胞1次后再以10g/L多聚甲醛悬浮细胞上机检测
1.
2.5NK细胞51Cr释放试验K562的标记:以100μCiNa2(51CrO4)(中国同位素公司)标记1mL细胞数为5×106个的靶细胞37℃孵育90min再以RPMI1640液洗细胞3次按不同效靶比(E∶T)值将标记好的K562细胞加入至NK/单核细胞共培养体系中并使终体积数为200μL天然释放孔不含效应细胞最大释放孔加入100μL20g/LTritonX-100每孔设复孔数为350mL/LCO
2、37℃条件下孵育4h离心后吸取每孔上清用FT-603型γ闪烁计数仪测定每份上清的cpm值特异性溶细胞活性由特异性释放百分数表示按下述公式计算:特异性释放率=[(实验孔cpm-自然释放对照孔cpm)/(最大释放对照孔cpm-自然释放对照孔cpm)]×100% 2结果
2.1细胞因子IFN-γ对人单核细胞MICs表达的上调作用活化淋巴细胞分泌的细胞因子TNF-α与IFN-γ一样也参与了淋巴细胞与其他细胞如DC的相互作用[7]TNF-α与IFN-γ对单核细胞MICs表达的影响尚不清楚在此一并研究了TNF-α及IFN-γ对纯化的人单核细胞表面MICs表达的作用新鲜分离的人单核细胞表面低水平或阴性表达MICs分子经IFN-γ__24h后单核细胞表面MICs分子明显上调细胞因子TNF-α不能轻微上调单核细胞表面MICs表达(图1)
2.2IFN-γ__的单核细胞对NK细胞的活化作用进一步研究IFN-γ及TNF-α__后的单核细胞活化NK细胞的能力结果显示无论是新鲜分离还是在体外培养24h后的单核细胞都不能促进NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达也不能促进NK细胞杀伤NK敏感的K562细胞;TNF-α作用后的单核细胞能微弱的促进NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达对NK细胞的细胞毒作用亦有一定增强作用;当单核细胞与IFN-γ共培养24h后单核细胞对NK细胞有很强的活化作用表现为NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达、NK细胞对K562的杀伤活性均明显增强(图2) 图1细胞因子TNF-α与IFN-γ对人单核细胞MICs分子表达的影响(略) 图2IFN-γ__后的单核细胞促进NK细胞活化(略) A:IFN-γ__后的单核细胞与异体NK细胞共培养后NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达明显增强而TNF-α__后的单核细胞无此效应;B:IFN-γ而非TNF-α__后的单核细胞与NK细胞共培养后NK细胞对K562的杀伤活性明显增强.
2.3MICs及细胞直接接触在单核细胞活化NK细胞中的作用IFN-γ能诱导单核细胞MIC上调表达IFN-γ作用后的单核细胞能活化NK细胞单核细胞表面MIC分子在NK细胞活化中的作用如何?对此进行了研究首先进行MIC抗体阻断试验:1000mg/LIFN-γ__单核细胞24h后在NK细胞/单核细胞共培养体系内加入饱和剂量5mg/L的抗MICs__b159207或者加入相等剂量的的同型抗体结果显示加入同型对照抗体后NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达明显升高(图3A)NK细胞对K562的杀伤活性也明显增强(图3C);但加入饱和剂量的抗体159207后NK细胞表面CD69及胞内IFN-γ表达、以及NK细胞对K562的杀伤活性大幅下降(图3A、C)较静息的NK细胞仅有微弱提高这说明IFN-γ诱导的表面MICs分子在单核细胞活化NK细胞中发挥着重要作用用transwell小室进一步证实了细胞间直接接触在单核细胞活化NK细胞中的作用从(图3)中可以看出用小室隔离单核细胞及NK细胞后NK细胞活化标志CD69及胞内IFN-γ表达较NK/单核细胞混合条件下明显减低(图__)NK细胞的细胞毒活性也明显减弱(图3C)这些结果提示NK细胞与单核细胞的直接接触及单核细胞表面的MICs分子可能是IFN-γ介导NK/单核细胞相互作用的关键环节 图3单核细胞活化NK细胞依赖MICs分子及细胞间的直接接触(略) A:IFN-γ预先__的单核细胞与NK细胞共培养当加入抗MICs抗体159207阻断后NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达受抑制;B:IFN-γ预先__的单核细胞与NK细胞共培养当以细胞小室阻断细胞直接接触后NK细胞CD69及胞内IFN-γ表达受抑制;C:IFN-γ预先__的单核细胞与NK细胞共培养当加入抗MICs抗体159207阻断(左)或以细胞小室阻断细胞直接接触后(右)NK细胞对K562细胞的杀伤活性变化. 3讨论 完整的免疫应答包括天然免疫应答和适应性免疫应答2方面淋巴细胞和非淋巴细胞是免疫应答的主要物质基础免疫应答的效应主要由淋巴细胞来发挥和体现非淋巴细胞则起着不可缺少的辅助和调节的作用事实上免疫细胞之间的__和相互作用十分紧密而复杂在淋巴细胞之间、淋巴细胞与非淋巴细胞之间均存在着不同的“对话”机制免疫细胞之间的“对话”方式主要有二种一是通过释放化学介质(主要是细胞因子)传递信息;二是通过细胞之间的直接接触进行交流对免疫细胞相互作用的研究此前主要集中在NK细胞与DC、T细胞与DC、NK细胞与T细胞几个方面对于单核细胞对免疫应答的调节则__不够 体内IFN-γ来源于淋巴细胞在免疫应答的早期和晚期主要分别由NK细胞和活化的T细胞产生除了发挥直接的抗病毒功能IFN-γ对免疫应答也起着关键的调节作用很早就发现IFN-γ对单核-巨噬细胞的生化、形态及功能有修饰和调节的作用它能直接活化巨噬细胞能促进髓样DCs分泌IL-12和向TH1极化对于单核细胞IFN-γ一方面可以影响其向DC或巨噬细胞分化;另一方面IFN-γ还能诱导单核细胞产生系列细胞因子如IL-
15、IL-
12、TNF-α、IL-
6、M-CSF等[12]既往研究发现IFN-γ介导了单核细胞与淋巴细胞之间的交互活化这种交互作用依赖细胞间的直接接触但其具体分子机制不清[3]我们的研究显示来源于淋巴细胞的IFN-γ能上调单核细胞表面MICs表达MIC则介导了NK细胞的活化 MICs基因位于人类第6号染色体MHC-I类基因区域与经典的MHC-I类分子却只有30%相同序列MICs无抗原提呈功能作为一种应激分子它广泛表达于处于应激或恶变的细胞表面某些正常细胞表面或胞质内也存在MICs表达此前发现单核细胞胞质而非胞膜存在MIC蛋白表达[5]细胞因子TNF-α、IFN-α对单核细胞MICs表达无类似的影响这提示单核细胞可能是IFN-γ发挥免疫调节作用的一个很重要的靶细胞而IFN-γ则可能是是淋巴细胞与单核细胞之间的主要__分子事实上众多证据表明IFN-γ在淋巴细胞与单核细胞的“对话”中发挥着关键的作用 单核细胞、DC和巨噬细胞是免疫系统中专职的APC虽然巨噬细胞及大部分DC来源于单核细胞但它们之间的生物学性状差异十分明显在NKG2D配体的表达和调节上也是如此:单核细胞组成性表达MIC转录模板和蛋白GM-CSF、IL-4诱导的单核细胞源性DCmoDCs却无MICs的转录和蛋白合成;IFN-γ可以上调单核细胞表面某种MIC分子表达[7]I类IFN(IFN-α)或者是结核杆菌的感染可以诱导moDC表面MIC分子表达从而介导NK细胞[6]的活化;对于巨噬细胞目前发现LPS而非IFN-γ能够诱导小鼠巨噬细胞表达RAE-1[8]这种差异表明单核细胞的分化也影响着MIC分子的表达和调节但其中的具体机制不清楚单核细胞及moDC在IL-15的表达调节上也有明显不同单核细胞IL-15与MIC分子一样受IFN-γ而非IFN-α调节而IFN-α则能促进moDC表达MIC和IL-15[9]基于以上研究结果我们认为在抗原提呈细胞(APCs)与淋巴细胞之间可能存在着一种以IFN为信使、以NKG2D为桥梁的交流对话机制【____】 [1]DelnesteYCharbonnierPHerbaultNetal.Interferon-γswitchesmonocytedifferentiationfromdendritic__llsto__crophages[J].Blood20031011:143-
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5429.。