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细胞工程第一章1何谓细胞工程细胞工程是生物工程重要组成部分,它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法,按照人们的设计进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和__培养,以获得具有新性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物,并发展有关理论和技术方法的学2细胞工程的目的获得新性状、新个体、新物质3按涉及主要技术领域细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面4细胞工程按操作层次分细胞融合工程、染色体工程、胚胎工程、细胞质工程等几个方面5细胞工程分为植物__和培养技术;动物__和培养技术;干细胞培养技术细胞融合技术;细胞核移植技术;胚胎移植技术;6动物细胞工程内容1动物细胞培养技术2细胞融合与单克隆抗体3胚胎工程4干细胞与__工程5核移植技术与动物克隆6转基因动物与动物发生器7动物染色体工程7植物细胞工程内容1植物细胞培养技术2植物快速繁殖3植物单倍体诱导与育种4植物胚胎发育与人种种子5植物原生质融合技术6植物染色体工程与转基因8动物细胞培养技术的应用1)生产蛋白生物制品病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等
(2)获得大量自身的皮肤细胞,用于植皮
(3)用于检测有毒物质4)用于生理、病理、药理等方面的研究,为治疗和预防疾病提供理论依据9单克隆抗体将B型淋巴细胞与骨髓瘤细胞在仙台病毒的诱导下进行融合,所得杂交瘤细胞既保持了癌细胞大量繁殖的特点,又具有B型淋巴细胞产生抗体的能力书P77HAT选择原理杂交瘤技术10单克隆抗体制备技术意义
①在基础理论研究中具有重要意义
②在疾病诊断、治疗和预防方面,与常规抗体相比,具有产量高,特异性强,灵敏度高,优越性十分明显
③作为载体,运载抗癌药物,制成生物导弹11动物体细胞核移植技术将细胞核和细胞质用某种方法拆开,然后再把分离的不同细胞的细胞核和胞质重新组合成一个新细胞12干细胞定义现在发现哺乳动物的许多已分化__和器官中都保留了一些能够__形成该__或器官的未分化原始细胞,这些细胞称为干细胞13干细胞分化胚胎干细胞;造血干细胞;单能干细胞14染色体工程技术染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体的一种技术主要分为动物染色体工程和植物染色体工程15胚胎工程技术以生殖细胞和胚胎细胞为研究对象进行细胞工程操作的技术,主要技术包括体外受精、胚胎移植、胚胎切割等16植物细胞工程技术
一、快速繁殖技术
二、诱导增加或减少植物体内染色体组数的技术
三、体细胞杂交技术
四、植物细胞应用生产技术17外植体从健康植株的特定部位或__,如根、茎、叶、花、果实、胚珠、花药和花粉等,选择用于__培养的起始材料,称之为外植体愈伤__,小植株的定义18生物技术又称生物工程是指人们运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识,按照预先的设计,对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能,用来发展商业性__、产品生产和社会服务的新兴技术领域包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等四大领域19细胞工程技术的应用__植物快速培育与繁殖动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种利用动植物细胞培养生产活性产物、药品新型动植物品种的培育在医学器官修复或移植中的应用制备转基因动植物的生物反应器珍稀动植物资源的保存与保护在遗传学、发育生物学等领域的理论研究在能源、环境保护等领域的应用第二章1动物细胞工程是以动物细胞为研究对象,通过工程技术手段对细胞的遗传与生理特性进行改良与修饰,从而获得人类所需的产物或器官乃至个体的生物技术2动物细胞工程研究内容动物细胞与__、细胞融合技术与单克隆抗体、染色体工程与基因工程、干细胞与__工程以及胚胎工程等相关技术理论3动物学细胞培养的生物学特征1培养特征;2生长特征3遗传学特征4动物培养细胞特点
1.细胞较大,无细胞壁
2.倍增时间长,生长缓慢,易受污染
3.培养过程需氧量少,对机械搅拌力或剪切力敏感
4.动物细胞间主要以聚__形式存在
5.原代细胞一般繁殖50代左右退化死亡5细胞生长特征1体内细胞高度分化,形态特征明显,具特定生物功能,受神经、激素调控,细胞间相相互影响,生长环境稳定2体外失去原有__结构与形态,分化不明显,生物功能消失,易衰老死亡肿瘤细胞可无限传代6贴附型细胞举例上皮细胞型;成纤维细胞型;游走细胞型;多形型细胞;7贴附的含义一是细胞之间相互接触,二是细胞与细胞外基质结合利于细胞之间及与环境之间形成__,不同细胞间形成__8单层附壁培养指动物细胞培养中,大多细胞必须附着在固体表面生长,当细胞布满表面后即停止生长9贴附培养的优点1)贴壁培养比较容易更换培养基
(2)容易采用灌注培养,从而达到提高细胞密度的目的
(3)更有效地表达同一产品
(4)可以方便地调节培养液和细胞比例
(5)易于观察细胞生长状况10贴壁生长细胞一般生长过程游离期;吸附期;繁殖期;退化期11培养细胞的生长特点一)贴附二)接触抑制三)密度抑制12悬浮型细胞指细胞在体外培养时不必贴壁,可在培养液中悬浮生长13悬浮细胞的优点细胞生存的空间大而能大量繁殖,易于传代培养,可大规模培养但不利于细胞形态观察(白细胞、淋巴__细胞、杂交瘤细胞转化细胞系等)14细胞系由原代培养经初步纯化,获得的以一种细胞为主的能在体外__生存的不均一的细胞群体15细胞培养时期
(1)原代培养期从体内取出__接种培养到第一次传代阶段,一般持续1-4周特点细胞呈活跃__,可见细胞__,但不旺盛与体内原__在形态结构和功能活动上相似性大是药物测试很好的对象2)传代期当细胞增殖达到一定密度后,则需要分离出一部分细胞和更新营养液,否则将影响细胞的继续生存,这一过程叫传代初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系 特点在全生命期中此期的持续时间最长,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型3)衰退期特点此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖,最后衰退凋亡
16、“一代”细胞指从细胞接种到分离再培养的一段时间17一代”细胞生长周期潜伏期 指数增生期 停滞期18细胞生物学效应研究介绍
一、常规仪器显微镜相差显微镜(PH)、微分干涉显微镜(DIC)、普通光学显微镜(A)、荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、原子力显微镜、流式细胞仪等
二、研究内容细胞生长形貌表征;显微观察成像生长周期特征细胞计数法测得细胞周期生长活性测得MTT法、PI染色法、流式细胞术亚细胞结构变化流式细胞术代谢特征等蛋白质、核酸、细胞膜结构、活性氧测定等19动物细胞悬滴培养;培养瓶培养;旋转管培养;克隆培养法;细胞同步化培养;动物细胞大规模培养20常用的生物反应器1)柱状中空纤维反应器
(2)板框式中空纤维反应器
(3)中心灌流式反应器
(4)灌流微载体生物反应器
(5)旋转壁式反应器21细胞系由原代培养经初步纯化,获得的以一种细胞为主的能在体外__生存的不均一的细胞群体细胞株细胞系经过进一步的克隆化,得到的由一种细胞组成的细胞株原代培养与传代培养的概念与特点P41第三章1细胞融合的定义细胞融合(__llfusion,又称体细胞杂交,指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生形成新物种或新品种的技术2同核体基因型相同的细胞融合成的杂交细胞3异核体来自不同基因型的杂交细胞4自发融合同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并5诱发融合异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合6细胞融合的意义
1、有性杂交变无性杂交加快育种速度,这对于种质资源的__和利用具有深远的意义
2、理论上说任何细胞都有可能进行体细胞融合可打破远缘杂交的不亲和性培育远缘杂交新种,通过体细胞杂交而成为新的生物资源
3、创造新细胞质__,如细胞质雄性不育、抗除草剂
4、制备单克隆抗体、植物育种中的核质替换和细胞器的互作研究7细胞融合的常用方法生物法—仙台病毒法;化学法—聚乙二醇(PEG)结合高Ca2+、高pH诱导法;物理法—电融合诱导法;细胞融合的影响因素8PEG诱导融合的特点其优点是融合成本低,勿需特殊设备;融合子产生的异核率较高;融合过程不受物种限制其缺点是融合过程繁琐,PEG可能对细胞有毒害9PEG的作用机理Kao等认为,由于PEG分子具有轻微的负极性,故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键,从而在质膜之间形成分子桥,其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合;另外,PEG能增加类脂膜的流动性,也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能10病毒融合机理病毒被膜上的神经氨酸酶,它可降解融合细胞膜上的糖蛋白,使细胞膜局部凝聚在病毒周围,在高Ca2+、高pH条件下细胞膜可局部发生融合11物理法—电融合诱导法基本原理在直流电脉冲的诱导下,原生质体质膜表面的电荷和氧化还原电位发生改变,使异种原生质体黏合并发生质膜瞬间破裂,进而闭合成完整的膜形成融合体12动物细胞融合的影响因素
(1)亲本细胞表面性质影响较大
(2)细胞种类不同,融合效果也不同
(3)细胞融合时需要适宜温度和运动状态
(4)细胞融合过程中,通常耗氧量较大,缺氧时经常不融合
(5)有些细胞融合时需要Ca2+,否则不融合,细胞蛋白质亦发生变化
(6)最适合的pH为
7.4~
7.8之间,在此范围之外,融合率均较低13单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子多克隆抗体由同一抗原诱导而产生的针对多个抗原决定族的抗体14单克隆抗体的应用1单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性,可以广泛地由于临床医学的疾病诊断,以提高疾病诊断的准确性2利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗,这不仅能大大降低生产成本,同时也增加了疫苗的安全性3单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗,是人类战胜癌症十分有望的潜在技术4单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究,从而推动现代医学的不断发展第四章1胚胎工程指在胚胎发育过程中进行的生物技术括胚胎移植、胚胎融合、胚胎分割、胚胎冷冻、胚胎____、胚胎细胞核移植、转基因操作2胚胎工程意义
(1)发挥优良母畜的繁殖潜力
(2)促进家畜改良的速度
(3)作为胚胎操作的基础
(4)保存遗传资源(罗伯特·爱德华兹)3超数排卵是指在母畜__周期的适当时间用人工的方法促使其有更多的卵泡发育成熟排卵的一项技术4体内获能直接从交配后的母畜__冲取__用于受精(BO液),冻存备用5体外获能高离子强度液(His)处理 钙离子载体、肝素6试管动物培养流程雌性供体的超排卵处理良种雄性供体人工去精——人工受精——采集受精卵——分类,体外培养或者胚胎冻藏——雄性受体的选择与胚胎移植——体内发育与后代降生7胚胎移植的目的
①发挥优良母畜的繁殖潜力
②促进家畜改良的速度
③作为胚胎操作的基础
④__保存冷冻胚胎,便于运输和保存遗传资源8胚胎融合又称胚胎嵌合,就是将两个不同品种或不同种除去透明带胚裸胚粘合在一起,或者各自一分为二,然后各取一半,融合成新的胚胎,移植给受体,产生具有杂交优势的新后代——嵌合体胚胎融合的意义 胚胎融合技术不仅为动物胚胎发育及遗传控制等研究提供了有效手段,而且业已证实,嵌合体后代可集不同品种或不同种动物的不同基因于一体,完全有可能把母代动物的优良遗传性能集中表现出来,从而形成具有高度__优势的杂合体另外,嵌合体母畜与公畜交配后,能产生具有正常繁殖力的后代所以胚胎融合不仅可成倍缩短家畜改良时间,而且也为创造新型的家畜品种提供新的技术手段9性别控制指通过人为干预或操作手段使母畜繁殖所需要的后代家畜性别控制主要有两条途径
①X与Y__的分离
②胚胎____10胚胎冷冻的原理低温能够抑制生物机体的生物化学活动动物胚胎的冷冻保存原理就是因为低温降低了胚胎内的变质反应速度并且温度越低,保存时间就越长11胚胎冷冻技术的意义
①为建立优良品种的胚胎库或基因库提供了条件
②便于胚胎运输和移植
③可避免或降低因活体运输而传播疾病的机会
④低温保存技术可__保存珍贵品种的遗传资源
⑤冷冻胚胎移植不受时间和空间等因素限制细胞复苏P68第五章1生命科学研究三大热门领域人类基因组计划(HGP);干细胞研究克隆技术2人类基因组计划的意义生物与医学基础研究;基因诊断、基因疗法、基因药物;带动一批高技术产业的发展;3干细胞(Stem__ll)即起源细胞在细胞的分化过程中,细胞往往由于高度化分而完全失去了再__的能力,最终衰老死亡机体在发展适应过程中为了弥补这一不足,保留了一部分未分化的原始细胞4干细胞几个主要特征1本身不是终末分化细胞;2能无限增殖__;3可连续__几代,也可在较长时间内处于静止状态;4干细胞__产生的子细胞只能有两种命运——保持为干细胞或分化为特定细胞5干细胞的用途治疗遗传性疾病和恶性肿瘤以干细胞为种子培育成某些__和器官,用于移植医学抗衰老,延年益寿6根据干细胞__发生的名称进行分类:胎胎干细胞 造血干细胞 骨髓间质干细胞 肌肉干细胞 成骨干细胞 内胚层干细胞 胰腺干细胞视网膜干细胞6干细胞按分化潜能分全能干细胞 多能干细胞 单能干细胞 7干细胞按发育状分胚胎干细胞 成体干细胞8胚胎干细胞与胚胎生殖细胞差异性
(1);来源不同;ES来源于囊胚内细胞团的多能性细胞,EG来源于原始生殖细胞的具有胚胎干细胞特性的多能性细胞
(2)细胞形态及体外培养条件方面存在差异;ES细胞集落呈相对扁平状,比较紧密,可以在无饲养层的情况下生长GE集落则接触更加紧密,呈现明显球状,必须在小鼠成纤维细胞饲养层及其他类型饲养层上,并用含有相关生长抑制因子的培养液生长 相似特性
(1)在一定条件下可相互转变,均可分化为包括神经细胞、造血干细胞和心肌细胞在内的各种细胞
(2)ES在一定条件下可以诱导分化为包括生殖细胞在内的三个胚层的所有细胞类型ES细胞可分化为原始生殖细胞和__、卵子,__和卵子受精后,其胚胎又可分离得到EG和ES9造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源,它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中10造血干细胞作为干细胞研究与应用的突破口
1.造血细胞是细胞增殖分化的最佳模型
2.造血干/祖细胞及各系血细胞的表面标志较为清 楚,细胞表型特征可进行定量分析,且可分选
3.造血干细胞增殖及向各系分化的重要诱导因 子、受体、__转导、微环境等因素较为清楚
4.造血细胞发挥功能可相对游离,不需“生物支架”、 神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺,因 此便于直接应用于临床第六章1什么是克隆技术?为无性生殖或无性繁殖,即由同一个祖先细胞__而形成的纯细胞系,这个细胞系每个细胞的基因彼此是相同的克隆技术在现代生物学中被称为“生物放大技术”,2克隆技术分类分子水平上的克隆----基因克隆 细胞水平上的克隆----细胞克隆 个体水平上的分子克隆----动物克隆/植物克隆3动物克隆不经过有性生殖过程,而是通过核移植生产遗传结构与细胞核供体相同动物个体的技术叫动物克隆4动物克隆技术包括细胞核移植技术 卵裂球培养 胚胎分割技术5核移植技术所谓核移植技术就是利用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到另一个细胞中,或者将两个细胞的细胞核(或细胞质)进行交换,从而可能创造无性杂交生物新品种的一项技术6核移植克隆哺乳动物的技术一般操作程序主要包括1核受体、核供体的处理和制备2核移植3重组胚的体外或体内培养4核移植胚胎移入__母畜(寄母)等7核供体细胞的准备 供体细胞核首先必须是完整的二倍体,必须保持有供体动物完整的基因组;其次,供体细胞核必须能够在受体细胞质的作用下,产生细胞分化过程的倒转,变得如同刚刚受精的合子一样,能重新完成从受精到发育成一个正常动物个体的全过程8胞质内注射是用一个外径5~8μm的注核针吸取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的方法 透明带下注射则是把供体细胞核注射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中,核移植后用电__进行细胞融合9激活原理通过电__、钙离子载体等方法,使卵母细胞从MII期中解放出来,并转到“受精”的状态10核移植技术的应用1.制备转基因克隆动物,进行生物药物生产;2.培育优良畜种,扩大良种种群;3.开展异种动物克隆,拯救濒危动物;4.与干细胞技术结合,开展治疗性克隆5.利用核移植技术,研究生物学的基本问题 11一克隆羊多利(Dolly)这一成果的重要生物学意义第一,它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着全能性第二,多利的成功提示我们可以进一步做到在培育体细胞成为核供体之前,利用“基因靶”技术精确地诱发核基因的遗传改变或精确地植入目的基因,再用选择技术准确地挑选那些产生了令人满意变化的细胞作为核供体,从而生产出基因克隆体第三,多利羊的诞生及生长表明,利用克隆技术__哺乳类动物的最后技术障碍已被突破,在理论上已成为可能12克隆羊的技术一般步骤第一步取妊娠期的6岁母绵羊(FinnDorset白品种母羊)的乳腺细胞作核供体细胞,用饥饿法使其进入休眠状态而使全部基因具有活性第二步注射_____,促使母羊(SottishBlackfa__黑面母绵羊)排卵,28~33小时取其未受精卵,快速去核,放入10%FCS、1%FCS和
0.5%FCS连续5天,使其进入G0期做受体细胞第三步乳腺细胞与无核卵放入同一培养皿中,在微电流的作用下,将乳腺细胞融入卵中,形成一个含有新的遗传物质的卵细胞第四步新的卵细胞植入羊的结扎的输卵管内,6天后发育为桑椹胚或囊胚(8~16个细胞)第五步将此早期胚胎移入假孕母羊__中,产下多利即为6岁母羊的__品,也为白色13克隆技术存在的问题理论问题分化的体细胞克隆对遗传物质重编(细胞核内所有或大部分基因关闭,细胞重新恢复全能性的过程)的机理还不清楚;克隆动物是否会记住供体细胞的年龄克隆动物的连续后代是否会累积突变基因在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决实践问题克隆动物的成功率还很低生出的部分个体表现出生理或免疫缺限即使是正常发育的“多莉”,也被发现有早衰迹象伦理道德克隆技术(尤其是在人胚胎方面的应用)对伦理道德的冲击使公众对此有强烈的反应,也限制了克隆技术的应用。