二甲双胍治疗后多囊卵巢综合征大鼠子宫内膜Hoxa10的表达及意义

二甲双胍治疗后多囊卵巢综合征大鼠__内膜Hoxa10的表达及意义__李晓冬马毓梅__英王玮郝桂敏蔡建辉【关键词】胰岛素；多囊卵巢综合征；__内膜　　【Abstract】AIM:TostudytheproteinexpressionsofHoxa10insulinINSandinsulinre__ptorINSRintheendometriumofpolycysticovariansyndromePCOSratbeforeandaftertherapywithmetformin.METHODS:Fiftyfourfe__leSDratsaged85dweredividedintocontrolgroupn=20PCOSmodelgroupn=17andmetformintreatmentgroupn=17randomly.Theratsinthelatter2groupswereindu__dbyPoretskysmethodforPCOSmodelingfollowedbyadministrationofpla__boormetforminrespectively.After14dtreatmenttheratsweresacrifi__dandtheexpressionsofHoxa10INSandINSRinendometriumweredetectedbyElivisionTMPlustwostepstaining.Serum____________andinsulinwerealsodetected.RESULTS:TheexpressionsofHoxa10andINSRweredecreasedPlt;

0.01P=

0.012intheendometriumofPCOSgroupbutthatofINSwasincreasedP=

0.

003.InthemetformintreatmentgroupHoxa10expressionwasraised（Plt;

0.01）andINSleveldeclined（P=

0.043）whichwerelowerthanthelevelsofcontrolgroupPlt;

0.01P=

0.

037.TherewaslittlechangeforINSR.Serum____________andinsulindeclinedaftermetformintreatmentPlt;

0.01P=

0.

048.CONCLUSION:INSresistan__anddecreasedendometrialre__ptivity__y　existintheendometriumofPCOSratswhichcanpartiallybecorrectedwithmetformin.　　【Keywords】insulin;polycysticovariansyndrome;endometrium　　【摘要】目的:探讨二甲双胍治疗前后多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠__内膜__中Hoxa10及胰岛素（INS）、INS受体（INSR）蛋白表达的变化.方法:选取85日龄SD雌性大鼠54只，随机分为

①对照组（20只）；

②PCOS组（17只）；

③二甲双胍治疗组（17只）.后两组先参照PoretskyL等方法__PCOS大鼠模型，造模成功后，PCOS组喂服安慰剂，治疗组喂服二甲双胍14d后断头处死各组大鼠并取材.采用免疫__化学ElivisionTMPlus两步法检测三组__内膜Hoxa10及INS，INSR蛋白的表达.并取外周血测定INS和睾酮含量.结果:PCOS组大鼠__内膜Hoxa10和INSR表达下降Plt;

0.01P=

0.012，INS表达增加P=

0.003；二甲双胍治疗后__内膜Hoxa10表达增加（Plt;

0.01），INS水平下降（P=

0.043），但均低于对照组水平Plt;

0.01P=

0.037；INSR无明显变化；治疗后血INS和血睾酮水平均下降Plt;

0.01P=

0.

048.结论:PCOS大鼠__内膜可能存在INS抵抗和容受性下降，治疗后可部分逆转此变化.　　【关键词】胰岛素；多囊卵巢综合征；__内膜　　0引言　　多囊卵巢综合征（PCOS）是育龄妇女常见的妇科内分泌疾病.主要以慢性无排卵、不孕为特征.胰岛素INS抵抗及由此而引起的高INS血症是PCOS的主要发病环节之一［1］.临床上针对高INS血症给予降INS治疗后PCOS患者的排卵率明显升高，但妊娠成功率不高.__内膜容受性与妊娠成功与否密切相关，但目前对于PCOS及其治疗的基础研究中对__内膜的观察还很少.本实验旨在观察高INS的PCOS大鼠模型在降INS药物治疗前后大鼠__内膜同源框基因Hoxa10及INS，INS受体INSR蛋白表达的变化以及血激素水平的变化，探讨降INS治疗对PCOS__内膜容受性的影响以及增强内膜容受性的可能途径，以期指导临床提高PCOS妊娠成功率.　　1材料和方法　　

1.1材料85日龄SD雌性大鼠54只，体质量（110±10）g（河北医科大学动物中心）；Hoxa10（Santacrui公司，sc17159），羊抗多克隆抗体，效价1∶50；INS（Neo__rkers公司，MS1378），鼠抗__b，效价1∶50；INSR（Neo__rkers公司，MS636），鼠抗__b，效价1∶50；ElivisionTMPlus免疫组化试剂盒（福州迈新试剂公司）；血睾酮和INS试剂盒（Beck__ncoulter公司）.　　

1.2方法　　

1.

2.1动物模型制备与分组将大鼠随机分为对照组（20只），PCOS组（17只）和二甲双胍治疗组（17只）.对照组大鼠经皮下给予注射用水1mL，2次/d.后两组参照Poretsky等［2］的方法，经皮下注射绒毛膜_____

3.0U及INS6U，2次/d，22d后检测__涂片和血激素水平符合PCOS模型，给动物分别喂服安慰剂和二甲双胍（按人与大鼠的公斤体质量折算系数计算剂量），1次/d，14d后断头处死各组大鼠，取躯干血，分离血清，测定血清INS和睾酮水平.打开腹腔，观察双侧卵巢和__的大体形态并以100mL/L多聚甲醛固定石蜡包埋.　　

1.

2.2光镜下形态学观察取卵巢及__石蜡包埋__，4μｍ连续切片8张，常规HE染色光镜观察.　　

1.

2.3免疫组化检测__内膜Hoxa10及INS，INSR的表达取__切片，常规脱蜡至水、ElivisionTMPlus两步法，DAB显色，苏木素复染，中性树胶封片，光镜观察.INSR需抗原修复.Hoxa10，INS和INSR阳性__分别为细胞质、细胞质、细胞膜呈棕黄色颗粒.对腺上皮细胞和间质细胞分别计分.免疫组化半定量方法参考Mccarthy方法按染色强度（i）分为弱淡黄、中黄、强棕黄三等，并分别记为1，2，3分.观察切片，计算各染色强度的细胞所占百分比（Pi）.每张染色片的蛋白表达评分（H）=∑i±1×Pi.H值范围为0～4；0分为所有细胞均无染色，4分为所有细胞均为强染色，0～4之间为不同程度的蛋白表达水平.Hlt;1为阴性.所有切片均由2名有经验的病理科医师采用双盲法评估算分.对少数不易判断的切片重新共同阅片而定.　　

1.

2.4激素测定Ac__ss免疫分析系统定量检测血清INS和睾酮水平.　　统计学处理:所有数据均以x±s表示，采用SAS

6.12统计软件进行数据统计分析.多组间比较采用单因素方差分析（onewayANOVA），组间比较采用q检验，以Plt;

0.05为有统计学意义.　　2结果　　

2.1卵巢的大体和形态学变化对照组大鼠卵巢色泽红，可见黄体.镜下除多个黄体外，可见不同发育阶段的卵泡，优势卵泡颗粒细胞层数8～9层.PCOS组卵巢表面较苍白体积增大见不到或仅见少量黄体形成.镜下见卵泡扩张，卵母细胞或放射冠消失颗粒细胞层数减少至2～3层，部分卵泡闭锁.治疗组卵巢色红，可见到黄体.镜下可见多个黄体及各级卵泡.卵泡囊性扩张减少或消失，颗粒细胞层数增多，优势卵泡内可见到卵池液、卵丘图1ACE.　　

2.2__内膜的形态学变化各组__内膜腺体形态明显不同.对照组大鼠__内膜腺体为多个腺体簇状排列腺腔大而多褶腺上皮中可见分泌泡.PCOS组__内膜腺体数目减少为单个腺体分散排列，腺腔小而直.治疗组__内膜腺体数目增多，出现簇状排列，但腺腔多小而直，部分可见到皱褶和分支图1BDF.　　A对照组卵巢；B对照组__内膜；C多囊卵巢综合征组卵巢；D多囊卵巢综合征组__内膜；E治疗组卵巢；F治疗组__内膜.　　图1三组卵巢及__内膜的病理观察HE×200（略）　　

2.3免疫组化染色结果显示三种抗体在各组__内膜均有表达，但具体表达强度明显不同图2，表

1.统计分析表明，PCOS组腺上皮Hoxa10表达水平明显低于治疗组和对照组Plt;

0.01治疗组低于对照组Plt;

0.

01.INS表达水平在PCOS组明显升高P=

0.003，治疗组降低P=

0.043但仍高于对照组P=

0.

037.INSR在PCOS组和治疗组表达明显降低P=

0.012Plt;

0.05，但PCOS组和治疗组之间无明显差别.　　

2.4激素水平的变化PCOS组的血睾酮和血INS水平均较对照组明显增高Plt;

0.01，治疗组INS与PCOS组相比明显降低Plt;

0.01但仍高于对照组水平Plt;

0.

01.治疗组血睾酮与PCOS组相比有所下降P=

0.048但仍高于对照组水平Plt;

0.01，表

1.　　3讨论　　PCOS患者多表现为不孕以往对于它的研究多集中于降低激素水平和促排卵治疗方面.人们对于PCOS大鼠也多观察其外周血及卵巢的变化但在临床上发现当激素水平得到改善、促排卵成功后仍没有满意的妊娠结局因此推测内膜结构和功能的改变也起着很重要的作用.近年来研究［3］发现__内膜不仅是卵巢激素作用的靶器官，也具有表达许多因子和受体以调节自身的功能，从而影响妊娠结局.　　HOX基因是近年来发现的一类在胚胎发育方面发挥重要作用的基因，其家族成员Hoxa10位于人类染色体7p

15.3，是参与__内膜殖分化和__内膜容受性建立的重要指标［4］在人正常月经周期的分泌中期着床期和晚期，__内膜Hoxa10表达显著升高［5］，而基因表达降低或丧失将导致生育力下降.Hoxa10的表达受性激素的调节［6］.曾有人［7］利用ISHIKAWA细胞进行研究发现，雄激素可以降低细胞Hoxa10的表达，雌孕激素上调内膜水平Hoxa10的表达.　　A PCOS组Hoxa10；B治疗组Hoxa10；C PCOS组INS-R；D治疗组INS-R；E PCOS组INS；F治疗组INS.　　图2多囊卵巢综合征组（PCOS）及治疗组的__内膜Hoxa10，胰岛素受体（INS-R）及胰岛素（INS）的表达ElivisionTMPlus两步法×200（略）　　表1各组__内膜Hoxa

10、胰岛素INS、胰岛素受体INSR的表达及血睾酮、血INS的变化（略）　　aPlt;

0.05bPlt;

0.01vs对照组；cPlt;

0.05dPlt;

0.01vsPCOS组；eP=

0.048vsPCOS组.PCOS:多囊卵巢综合征.　　我们所采用的是高INS的PCOS模型，同时血中雄激素呈现高水平多种研究表明INS抵抗与PCOS的发病有密切关系，INS水平的变化也同样影响__内膜的改变［8-9］.根据我们的实验结果推测高水平的INS干扰了PCOS大鼠__内膜正常的生理活性，__内膜INS受体水平降低或敏感性下降，INS代偿性增加，INS不能发挥正常的活性，表现为内膜水平的INS抵抗现象.同时PCOS大鼠排卵障碍，无孕激素产生，雄激素水平升高，使内膜水平的HOXA10明显受到抑制，表现为__内膜容受性下降.因此推测PCOS大鼠__内膜INS抵抗和容受性降低也是PCOS大鼠生育能力下降的一个潜在因素.　　　　二甲双胍是近年来临床采用的针对PCOS高INS水平治疗的常用药物［10］.我们的结果显示在应用二甲双胍治疗后，PCOS大鼠外周血INS和雄激素水平比治疗前明显下降，并以INS下降更为显著.在__内膜方面也有变化，表现为INS水平下降，Hoxa10水平上升，排卵功能恢复，但INS受体水平变化不明显，INS抵抗现象和容受性得到改善.因此其容受性的提高可能与__对INS敏感性的增加有关.但经二甲双胍治疗后，Hoxa10的表达水平并没有完全恢复到正常，考虑PCOS时的__内膜功能异常不仅仅与INS抵抗有关，而是由多因素参与的，故仅应用降INS治疗并不能完全纠正这种内膜缺陷，但如何有效增加__内膜容受性尚有待进一步研究.　　【____】　　［1］TanSHahnSJanssenOE.Insulinresistan__syndromeandpolycysticovarysyndrome:Implicationsfordiagnosisandtreatment［J］.Pa__inervaMed2005474:211-

217.　　［2］PoretskyLClemonsJBogovichK.Hyperinsulinemiaandhu__nchroionicgonadotropinsynergisticallupromotethegrowthofovarianfollicularcystsinrats［J］.Metaboli__，1992418:903-

910.　　［3］__liqueoMClementiMGablerFetal.Expressionofsteroidre__ptorsandproteinsrelatedtoapoptosisinendometriaofwomenwithpolycysticovarysyndrome［J］.FertilSteril，2003，80Suppl2:812-

819.　　［4］DaftaryGSTaylorHS.PleiotropiceffectsofHOXA10onthefunctionaldevelopmentofperiimplantationendometrium［J］.MolReprodDev2004671:8-

14.　　［5］KimJJFazleabasAT.Uterinere__ptivityandimplantation:Theregulationandactionofinsulinlikegrowthfactorbindingprotein1IGFBP1HOXA10andforkheadtranscriptionfactor1FOXO1inthebaboonendometrium［J］.ReprodBiolEndocrinol2004162:34-

40.　　［6］MyleneMWLimHSchustDJ.Geneexpressionprofilingrevealsprogesteronemediated__llcycleandimmunoregulatoryrolesofhoxa10inthepreimplantationuterus［J］.MolecularEndocrinol2003174:610-

627.　　［7］__rmikDSelamBTaylorHS.RegulationofHOXA10expressionby____________invitroandintheendometriumofpatientswithpolycysticovarysyndrome［J］.JClinEndrocrinolMetab2003881:238-

243.　　［8］Giudi__LC.EndometriuminPCOS:ImplantationandpredispositiontoendocrineCA［J］.BestPractResClinEndocrinolMetab2006202:235-

244.　　［9］BersteinLMKvatchevskayaJOPoroshinaTEetal.Insulinresistan__itsconsequen__sfortheclinicalcourseofthediseaseandpossibilitiesofcorrectioninendometrialcan__r［J］.JCan__rResClinOncol200413011:687-

693.　　［10］SahinYYirmibesUKelestimurFetal.AygenE.Theeffectsofmetforminoninsulinresistan__clomipheneindu__dovulationandpregnancyratesinwomenwithpolycysticovarysyndrome［J］.EurJObstetGynecolReprodBiol20041132:214-

220.。