应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变

应用多重PCR技术检测慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变作者郑文娟　陈丽娟　吴雨洁　李丽　徐卫李建勇【摘要】　　免疫球蛋白重链可变区IgVH基因突变是慢性淋巴细胞白血病CLL最重要的独立预后因素之一，为探讨CLL患者IgVH基因突变状态，应用多重PCR技术检测9例CLL患者的IgVH基因，纯化PCR扩增产物后直接测序，应用IMGT/V-QUEST工具分析，明确有无IgVH突变及突变位置结果表明9例CLL患者皆扩增出395-465bp区域MIXI或290-360bp区域MIXII单克隆条带，测序结果显示5例患者有突变，IgVH基因分别为IGHV3-11*

03、IGHV3-9*

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01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，IgVH基因为IGHV3-53*

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03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01结论PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，解决传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏，值得在临床和科研中推广使用【关键词】多重PCR；IgVH；基因突变　　DetectionofIgVHMutationStatusinPatientswithChronicLymphocyticLeukemiabyMultiplexPCR　　AbstractIgVHmutationstatusisoneofthemostimportantindependentprognosticfactorofchroniclymphocyticleukemiaCLL.InordertoevaluateIgVHmutationstatusinpatientswithCLLIgVHmutationwasdetectedbymultiplexPCRin9CLLpatientsandpurifiedPCRamplificationproductsweredirectlysequencedIgHsomatichypermutationandmutationsitewereanalysedbyIMGT/V-QUEST.Theresultsshowedthat5patientshadmutatedIgVHandIgVHswereIGHV3-11*03IGHV3-9*01IGHV3-23*01IGHV4-59*01IGHV4-34*02respectively;whereas4othershadunmutatedIgVHtheseIgVHswereIGHV3-53*01IGHV3-23*03IGHV3-33*05andIGHV3-7*

01.ItisconcludedthatmultiplexPCRisarapidandeasymethodtodetectIgVHmutationstatusanditsolvesthelimitationsandpitfallsofroutinePCRanditisworthbeingextensivelyusedbothinclinicandscientificresearches.　　KeywordsMultiplexPCR;IgVH;genemutation　　慢性淋巴细胞白血病CLL是西方国家最常见的一种恶性淋巴细胞增殖性疾病，约占全部成人白血病的30%，主要发生在老年人，男女比例为

1.3-

2.0∶1我国发病率虽然低于西方国家，但随着人口的老龄化，发病率呈现逐年上升趋势CLL患者的临床病程和转归呈高度异质性，部分患者生存同年龄、性别匹配的正常人相同，而部分患者即使接受了早期的积极治疗仍很快死亡［12］因此，CLL预后因素的检测就显得尤为重要近来多个研究组［3-6］证实，免疫球蛋白重链可变区IgVH基因突变是最重要的独立预后因素之一本研究旨在应用多重RT-PCR技术研究CLL患者IgVH基因突变　　材料和方法　　研究对象　　随机选取我院血液科住院或门诊的CLL患者，共9例，其中男7例，女2例，中位年龄5536-77岁临床分期应用Binet分期，BinetA期2例、BinetB期5例、BinetC期2例所有患者进行外周血常规、骨髓细胞形态学和多参数流式细胞术细胞免疫分型检测，诊断与分期均根据《血液病诊断与疗效标准》［7］确定实验室检查:外周血WBC数gt;10×109/L，淋巴细胞比例≥50%，绝对值≥5×109/L，骨髓增生活跃或明显活跃，淋巴细胞数gt;40%，以成熟淋巴细胞为主；免疫表型CD10-、CD19+、CD5+、CD23+、CD20+和FMC7-，并排除其他疾病收集患者的外周血或骨髓标本，用淋巴细胞分离液收集单个核细胞　　IgVH基因的多重PCR检测　　RNA抽提及逆转录采取TRIZOL一步法抽提RNA，并予以逆转录逆转录反应体系RNA2μg，oligodT1μl

0.5μg/l，5×Buffer8μl，dNTP40mmol/L2μl，AMV10U1μl，RNasin40U1μl，DTT100mmol/L1μl，加DEPC水至40μl，70℃10分钟；冰上至少10分钟；42℃，1小时；95℃，5分钟；冰浴5分钟，-80℃保存　　PCR引物IgVH片段由3个框架区frameworkFR和两个抗原互补决定区complementarity-determiningregionsCDR组成图1IgVH基因引物由InVivoScribe公司提供InVivoScribeUSA，定购该公司编号为5-101－0010的IGHSomaticHypermutationAssayforGelDetection试剂盒，其中有两种混合引物MIXI和MIXII，前者扩增领头区leader和JH之间的基因，后者扩增FR1与JH间的基因以GAPDH为内参照，上游引物3-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5，下游引物3-GAAGATGGTGATGGGATTTC-5，扩增片断为230bp　　PCR反应体系MIXI或MIXII45μl，TaqDNA聚合酶1U

0.25μl，cDNA模板5μl，共50μl反应体系反应条件是94℃7分钟后，94℃45秒；60℃45秒；72℃90秒扩增35个循环后，72℃10分钟以相同条件扩增试剂盒中提供的阳性和阴性参照2%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察到7例慢淋患者扩增出395-465bp区域MIXI单克隆条带，2例标本扩增出290-360bp区域MIXII单克隆条带　　PCR产物序列分析未纯化PCR原液由上海生工纯化后直接测序测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析http://imgt.cines.fr，明确有无IgVH突变及突变位置IgVH碱基突变率=错配碱基数÷可变区总碱基数，IgVH碱基突变率≥2%定为体细胞突变标准［45］　　结果　　9份标本皆先用MIXI进行扩增，其中7个扩增出395-465bp区域的单克隆条带标本号为

1、

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8、9，3号和6号标本未扩增出特异性条带，再用MIXII扩增，扩增体系和反应条件同MIXI，结果扩增出290-360bp区域的单克隆条带图2测序结果应用IMGT/V-QUEST数据库分析图35例患者有体细胞突变，3例处于BinetB期，2例处于BinetC期，IgVH基因分别为IGHV3-11*

03、IGHV3-9*

01、IGHV3-23*

01、IGHV4-59*01和IGHV4-34*02；4例无突变，2例BinetA期，2例BinetB期，IgVH基因分别为IGHV3-53*

01、IGHV3-23*

03、IGHV3-33*05和IGHV3-7*01IgVH突变分析见表1Table.IgVHmutationstatusanalysisof9CLLpatients（略）　　讨论　　CLL是淋巴细胞克隆性增殖为特征的高度异质性恶性血液系统疾病其预后的异质性使得CLL预后因素的检测就显得尤为重要，其中有无IgVH基因体细胞突变已被证实是目前为止与预后相关最为密切的因素CLL根据有无IgVH基因体细胞突变分成两种类型无IgVH基因突变型起源于生发中心前B细胞，为生发中心前期肿瘤，病情进展快、生存期短，临床分期多为晚期；IgVH基因突变型起源于记忆B细胞，为生发中心后期肿瘤，病程进展缓慢，生存期很长，临床分期多在早期［36］本组9例患者，4例无IgVH基因突变患者2例处于BinetA期，2例处于BinetB期；5例IgVH基因突变型患者3例处于BinetB期、2例Binet处于C期但9例患者至今皆只随访2年左右，病情尚无变化由于随访时间短，病例数少，IgVH突变情况无法与分期形成有效统计，这有待于我们在今后的研究中进一步增加病例数，延长随访时间，观察疾病进展情况以作出准确判断正常和恶性B细胞中最常见的VH家族是VH330%-50%和VH420%-30%，其次是VH110%-20%家族，占总数的75%-95%；在PrecursorB-ALL中VH6也多见［8］本研究中9例标本的IgVH基因有7例属于VH3，2例属于VH4，与报道相符但Tobin等［9］报道，IgVH基因突变型患者以VH3-21多见，无IgVH基因突变型患者以VH1-69多见但本组9例标本均未见以上两种IgVH基因类型每一个B细胞都有自己长度和序列特异的由可变区V、多变区D和结合区J片段重排形成的位于14q

32、大约1250bpIgH基因IgH基因包括7个VH家族现已发现52个有功能的VH片段，30个无功能的VH片段、7个DH家族现已发现27个有功能的DH片段、6个JH家族现已发现6个有功能的JH片段不同V、D、J区的排列组合大约有2×106，而基因重组过程中的核苷酸的随机缺失和插入，使得排列组合的数目剧增，超过至gt;1012淋巴细胞的Ig分子要经过生发中心的体细胞高度突变才能成为成熟的B细胞因此生发中心或生发中心后期起源的成熟的B细胞恶性肿瘤中存在有体细胞突变，而这一过程同时扩大了Ig排列组合的数目［810］IgVH基因片段中FR序列相对保守，而CDR即使在同一VH家族中也高度不同，是生发中心期体细胞突变的高发区，尽管FR不易发生体细胞突变，但可发生核苷酸置换，尤其易发生在高度突变的B细胞现在在一些实验室开展的PCR技术检测IgVH基因是应用单个VH通用引物，与三个FR中的一个通常是FR3的序列互补，这种通用引物不能以相同效率扩增所有VH片段；而且由于体细胞突变并不是局限于CDR，也会发生在FR，如果FRs区域发生了基因突变，就会阻碍通用引物和FR的目的序列结合，导致克隆PCR产物检测失败由于IgH基因的多态性，CLLIgVH突变状态应用常规PCR方法检测所需引物众多，技术繁杂，标本需求量大，耗时久，费用高，在普通的实验室难以开展，且容易产生假阴性或假阳性结果因此虽然早在10多年前就提出IgVH体细胞突变与CLL预后有密切关系，但大部分实验室无常规开展此工作的条件本研究小组曾在1年前应用上述方法检测IgVH突变状态，在近30份标本中仅1份扩增出特异性片段，每份标本需进行36次PCR过程，由于其耗时低效而终止研究而本次研究采用多重PCR检测IgVH基因突变，简化了繁琐的实验过程，缩短了实验时间，而且由于InVivoScribe公司提供的试剂盒中提供阳性和阴性参照，减少了假阴性假阳性结果出现的几率，使实验结果更加可信多重PCR解决了传统PCR对IgVH基因突变检测的桎梏值得在临床和在科研中推广现在国内外大量实验证实，IgVH基因突变与ZAP-

70、CD

38、细胞遗传学异常、sCD

23、胸苷激酶、LPL等一系列CLL预后指标都有一定的相关性［611］我们将进一步进行IgVH基因突变与上述CLL指标的预后关系，以便共同评价预后，指导治疗【参考文献】　　1ShanafeltTDGeyerSMKayNE.Prognosisatdiagnosis:integratingmolecularbiologicinsightsintoclinicalpracticeforpatientswithCLL.Blood2004;103:1202-1210　　2ChiorazziNRaiKRFerrariniM.Chroniclymphocyticleukemia.NEnglJMed2005;352:804-815　　3陈丽娟（综述）李建勇（审校）.慢性淋巴细胞白血病IgVH基因突变研究进展.国外医学·输血及血液学分册2003;26:155-156　　4HamblinTJDavisZGardinerAetal.UnmutatedIgVHgenesareassociatedwithamoreaggressiveformofchroniclymphocyticleukemia.Blood1999;94:1848-1854　　5DamleRNWasilTFaisFetal.IgVgenemutationstatusandCD38expressionasnovelprognosticindicatorsinchroniclymphocyticleukemia.Blood1999;94:1840-1847　　6MontilloMHamblinTHallekMetal.Chroniclymphocyticleukemia:novelprognosticfactorsandtheirrelevanceforrisk-adaptedtherapeuticstrategies.Haematologica2005;90:391-399　　7张之南沈悌.血液病诊断及疗效标准.第二版科学出版社.北京:1998:228-236　　8vanDongenJJMLangerakAWBruggemannMetal.DesignandstandardizationofPCRprimersandprotocolsfordetectionofclonalimmunoglobulinandT-cellreceptorgenerecombinationsinsuspectlymphoproliferations:ReportoftheBIOMED-2ConcertedActionBMH4-CT98-

3936.Leukemia2003;17:2257-2317　　9TobinGThunbergUJohnsonAetal.SomaticallymutatedIgVH3-21genescharacterizeanewsubsetofchroniclymphocyticleukemia.Blood2002;99:2262-2264　　10MatthewsCCatherwoodMMorrisTCetal.RoutineanalysisofIgVHmutationalstatusinCLLpatientsusingBIOMED-2standardizedprimersandprotocols.LeukLymphoma2004;45:1899-1904　　11vantVeerMBBrooijmansAMLangerakAWetal.Thepredictivevalueoflipoproteinlipaseforsurvivalinchroniclymphocyticleukemia.Haematologica2006;91:56-63。