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人乙醇脱氢酶原核表达载体构建及产物活性测定(__:___________单位:___________邮编:___________)__钱晓伟,潘丹岷,谭湘陵【摘要】目的构建人乙醇脱氢酶alcoholdehydrogenaseADH原核表达载体,在表达菌BL21中进行体外原核表达并测定ADH蛋白的酶学性质方法用RT-PCR技术从人肝RNA中克隆ADH开放阅读框架序列,并与表达载体pET-5a连接、转化入宿主菌BL21中,并经培养、筛选、酶切和测序鉴定用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导表达菌并测定表达蛋白的酶学参数结果原核表达载体pET-5a-ADH构建成功;表达蛋白分子量在40kD左右;酶学测定表明表达蛋白是一种耐酸、耐高温的脱氢酶,钾离子和三价铁离子对其酶活性有促进作用,二价金属离子对其活性有抑制作用结论人ADH原核表达载体pET-5a-ADH成功构建,原核表达产物具有一定的ADH蛋白活性该研究为进一步了解ADH酶学性质,探讨酶活性多态性与疾病的关系打下基础【关键词】乙醇脱氢酶;原核表达;酶活性;人[Abstract]O__ective:Toconstructtheprokaryoticexpressionvectorofthehu__nalcoholdehydrogenaseADHgettheprokaryoticproductinvivoanddetectitsenzymicproperty.Methods:Thesequen__ofopenreadingframeORFofhu__nADHwasclonedbyRT-PCRfromhu__nliverRNA.ThenitwaslinkedtotheexpressionvectorpET-5aandthevectorwastransformedintohostbacteriumofBL
21.Thenculturingscreeningcuttingbyrestrictionenzymeandsequencingwereperformedforidentification.IPTGwasusedtoindu__expressioninBL21andsomeenzymicindexesofexpressedproteinsweredetected.Results:Theprokaryoticexpressionvectorwasconstructedsuc__ssfullyandthemolecularweightofexpressedproteinwasaround40KD.Theprokaryoticproducthadagreattoleran__inacidandhightemperatureenviro__ent.K+andFe3+hadastimulativeeffectonenzymicactivitybutdivalentmetalionhadarestraineffect.Conclusions:Thehu__nADHprokaryoticexpressionvectorissuc__ssfullyconstructedandtheADHproteinfromprokaryoticexpressionhasactivity.ThepresentstudyprovidesexperimentaldatatounderstandADHenzymicpropertyandtoexploretherelationshipbetweenpolymorphi__ofADHactivityanddisease.[Keywords]Alcoholdehydrogenase;Prokaryoticexpression;Enzymeactivity;Hu__n乙醇脱氢酶alcoholdehydrogenase,ADH和乙醛脱氢酶aldehydedehydrogenase,ALDH是乙醇代谢中的关键酶ADH催化乙醇转化为乙醛,然后ALDH把乙醛转化为乙酸,乙酸又经三羧酸循环途径,最终转化为二氧化碳和水排出体外研究发现,ADH和ALDH都是多个同工酶组成的大家族人类ADH基因位于4q21-25,可编码同源或异源二聚体的ADH同工酶目前已发现了7种亚型,分别为ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH
4、ADH
5、ADH6和ADH7,这些基因在人群中存在着广泛的多态性
[1]ADH是一种含锌的金属酶,其同工酶有20余种,常见ADH的亚基类型有5种,分别为α、β、χ、γ和π
[2]由于ADH存在着多态现象,因此乙醇代谢能力在人群中也存在着差异,不仅如此,ADH的多态性也与器官病变和疾病发生如肝硬化、心脏病等的易感性也相关
[3],甚至与乙醇依赖性也相关为进一步了解ADH的酶学性质,探讨ADH与疾病的关系,本文构建了人ADH原核表达载体,进行了体外表达,并测定了部分酶学参数1材料和方法
1.1材料与试剂人肝脏标本来自于肝癌患者手术切除的癌旁正常__Trizol、逆转录试剂盒、限制性内切酶、TaqDNA聚合酶等购自TaKaRa公司,NAD+氧化型辅酶Ⅰ购自__捷瑞公司
1.2方法
1.
2.1原核表达载体pET-5a-ADH的构建根据Trizol说明书提取人肝总RNA,并逆转录形成cDNA根据人ADHGenBank登录号AF153821序列和原核表达载体pET-5a多克隆位点的内切酶分布,设计了一对带有BamHI和EcoRI酶切位点引物,引物序列分别为5’-CGGGATCCATGA__ACA__AGGAAAAGTA;5’-CGGAATTC__ATCTCTATT__CTCAAAAC下划线部分为酶切位点根据上述引物,预计扩增的PCR产物的长度为1158bp以逆转录cDNA为模板进行PCR扩增,条件为94℃5min、94℃45s、52℃45s、72℃45s、72℃7min;循环35次将PCR扩增产物和原核表达载体pET-5a分别用BamHI和EcoRI进行酶切后连接,将连接产物转化入表达菌BL21中,涂皿20h后挑取平皿生长的菌落,LB液体扩大培养,提取质粒,采用PCR进行阳性克隆筛选、并进行双酶切和测序鉴定
1.
2.2重组蛋白的诱导表达用含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB液培养阳性菌,在OD600为
0.6时加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),使其终浓度为
0.6mmol/L,37℃诱导培养7h,以不加IPTG的菌为对照组以煮沸裂解法破菌,对全菌蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,检测重组蛋白的表达情况
1.
2.3ADH酶学动力学研究辅酶NAD存在NADH和NAD+两种形式,它们分别在340__和260__处有最大吸收峰,因此对于以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类,均可通过测定光吸收值在340__处的变化,来定量测定反应中的酶活性
1.
2.
3.1温度对酶活性的影响将1份NAD+溶液与5份pH
7.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液混合配成基质液备用
[4]于测定管中加入30μl实验组酶液,对照管中加入30μl对照组酶液,再分别加入基质液600μl,混匀后置37℃水浴1min,然后分别向测定管和对照管中加入12μl乙醇溶液,轻轻摇匀,分别置于不同的温度30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、70℃、80℃水浴5min,在340__处记录测定每管吸光度,计算出测定管每min平均吸光度△A/min,按下列公式算出酶的活性,绘制酶活力-温度曲线,确定酶促反应的最适温度ADH活性U/L=△A/min×■×■×10■=△A/min×3400ADH的活性的国际单位U是以在每min内ADH催化产生1μgNADH的酶量定义为1个国际单位
1.
2.
3.2pH对酶活性的影响配制pH为
4.0的乙酸―乙酸钠缓冲液,pH为
5.
0、
6.
0、
7.
0、
8.0的磷酸氢二钠―磷酸二氢钠缓冲液,pH为
9.0的甘氨酸―氢氧化钠缓冲液将NAD+溶液分别与不同pH值的缓冲液按1∶5比例混合,配成基质液备用于测定管中加入30μl实验组酶液,对照管中加入30μl对照组酶液,再分别加入基质液600μl,混匀后置37℃水浴1min,然后分别向测定管和对照管中加入12μl乙醇溶液,轻轻摇匀,置于37℃水浴5min,在340__处记录测定每管吸光度绘制酶活力―pH值曲线,确定酶的最适pH值
1.
2.
3.3金属离子对酶活性的影响配制pH
4.0的终浓度为
5.0mmol/L的不同金属盐化合物(KCl、CaCl
2、M__l
2、CuCl
2、ZnCl
2、MnCl2和FeCl3)的缓冲液,将NAD+溶液分别与不同金属盐化合物缓冲液按1∶5比例混合,配成基质液备用于测定管中加入600μl的含金属盐化合物的基质液,对照管中加入不含金属盐的基质液,再分别加入30μl实验组酶液,混匀后置37℃水浴1min,然后分别向测定管和对照管中加入12μl乙醇溶液,轻轻摇匀,置于37℃水浴5min,在340__处记录测定每管吸光度2结果
2.1人ADH开放阅读框架片段的获得以人肝RNA为模板,用含BamHI和EcoRI酶切位点的引物进行PCR扩增,扩增产物用
1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,产物在电泳图谱上呈现出单一清晰的条带,其片段大小约为
1.1kb,与预期产物(1158bp大小一致,初步证实PCR产物为人ADH开放阅读框架片段(图1)
2.2原核表达载体pET-5a-ADH的构建与鉴定将实验中获得的阳性克隆扩大培养,提取质粒,PCR扩增后用
1.0%琼脂糖凝胶电泳分析,结果显示提取的质粒中含有目的基因约1000bp处的条带,见图2中泳道1,且目的基因成功亚克隆至原核表达载体中约4000bp同时将重组质粒用EcoRⅠ和BamHⅠ进行双酶切酶切所得的产物用
1.0%琼脂糖凝凝胶电泳进行分析图3电泳显示4kb和
1.1kb片段,与预期产物大小一致,从而初步表明ADH片段已成功克隆至pET5a-c载体中将重组质粒送测序,结果显示图4,该序列与GenBank所报道的序列完全一致,并且碱基无移码,表示原核表达载体pET-5a-ADH构建成功
2.3ADH的诱导表达提取诱导表达蛋白,并通过SDS-PAGE电泳检测分析结果如图5所示,与未诱导组相比,诱导组在40kD处出现了一明显条带如箭头所示,而未诱导组该条带不明显,说明IPTG能诱导出ADH蛋白,该蛋白的分子量为40kD左右,与文献报道相同
[5]
2.4ADH的酶学性质
2.
4.1温度对ADH活性的影响ADH粗酶液在不同温度下保温测定酶活性,结果如图6所示,由图可知,温度从30℃升高到37℃,ADH活力在增加;从37℃升高到45℃ADH活力在降低;从45℃升高到70℃,ADH活力迅速上升;70℃以后,温度有下降趋势表明体外原核表达的ADH在70℃左右具有最高活力;同时也表明此来源的ADH耐高温
2.
4.2pH对ADH活性的影响pH对ADH活性的影响结果见图7从图7可以看出在pH
4.0时活力最高,随着pH的升高,其活性逐渐降低,在pH
6.0~
9.0之间变化不大,表明体外原核表达的ADH是一种耐酸的脱氢酶
2.
4.3金属离子对ADH活性的影响见表1由表1可看出K+、Fe3+对ADH酶活性有促进作用;二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用3讨论乙醇中毒、乙醇依赖及其相关问题是仅次于心血管疾病、肿瘤的第三大公共卫生问题,乙醇代谢的2种酶—乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶,存在着明显的种族差异和个体差异
[6]研究表明,ADH和ALDH的多态性不仅与乙醇耐受相关,还与疾病的发生相关,因而受到学术界的__Lizano等
[7]在对人红细胞体外消耗乙醇研究的基础上,应用电穿孔技术将ADH与ALDH联合包埋于小鼠红细胞中,用于对急性乙醇中毒小鼠进行处理结果表明,小鼠血中乙醇浓度较对照组低43%,乙醇消除量高达
0.39ml/min,较对照组高
0.19ml/min说明包被ADH和ALDH的红细胞可以作为潜在的载体系统消除摄入体内的高浓度乙醇已有报道PET32a-ZNFD原核表达载体的构建
[8],本研究采用pET-5a成功构建了表达人ADH的原核质粒,并表达出具有活力的ADH蛋白测定结果显示,该蛋白在体外的最适温度为70℃,说明体外原核表达的ADH蛋白具有耐高温特点,这与已经报道的血清
[4]、A__tobacterZ127
[9]、马肝和酵母的ADH最适反应温度分别为37℃、60℃、20℃和25℃不同测定结果还显示,体外原核表达的ADH是一种耐酸的脱氢酶,随着pH的升高,其活性逐渐降低;在pH
6.0到
9.0之间变化不大这些测定结果不同于已经报道的血清
[4]最适pH为
9.
0、A__tobacterZ127
[9]最适pH为
7.
0、马肝和酵母最适pH为
8.6~
9.0的ADH最适pH,该ADH可以在酸性环境中催化乙醇代谢___不同条件下的ADH具有不同的理化性质,还有待于进一步研究金属离子对这种蛋白的活性也有一定的影响,K+、Fe3+对ADH酶活性有促进作用,特别是Fe3+对活性的促进作用十分明显而二价金属离子对ADH有不同程度的抑制作用,可能是严重影响酶的构象造成活性降低根据文献报道,Zn2+是ADH的辅助因子,在本研究中添加的Zn2+可能过量,导致对ADH的活力产生了一定的抑制效应【____】
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