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CTAB—硅珠法提取DNA实验流程前言:实验是要求非常严谨的过程每个一步骤都可能对后面的操作产生很大影响乃至影响后面的结果.一步错步步错每一个操作的失误都可能导致整个实验的失败.事实求是与踏踏实实的作风是每个做实验的人必备的基本品质.永远记住任何弄虚作假的行为都是可耻的.在这个充满学术腐败的科学界保持自己的纯真. 谨记
1.材料的采集采取植物的嫩叶可以用硅胶干燥保存也可以用冰袋主要是防止叶片组织的降解及叶片的褐化.用泡沫塑料箱子带回置于-70℃冰箱保存.
2.CTAB—硅珠法提取DNA实验流程各加入液体的配制
1、CTAB提取液2%(W/Vg/mol)CTAB;5%(W/Vg/mol)PVP;
1.4mol/lNaCl;20mmol/LEDTAPH=
8.0;l00mmol/lTris-HClPH=
8.0; 2%V/V巯基乙醇临时加入配制量500ml配制方法1计算所需组分量CTAB 10g 需热磁力搅拌PVP 25g NaCl
40.908g EDTA.Na
2.2H2O
3.7224g 调PH=8冷却为常温时母液Tris
6.057g 2称取CTAB10g,NaCl
40.908g,PVP25g置于500ml烧杯中3加入约300ddH2O双蒸水充分磁力搅拌溶解注意EDTA和PVP较难溶,加热溶解的同时用热磁力搅拌直至完全的透明为止4量取20mlEDTA
0.5mol/lPH=8,50mlTris-HCl1mol/lPH=8溶液于烧杯中,均匀混合5将烧杯溶液定容至500ml后,高温高压灭菌6室温保存
0.5mol/LEDTA配制组分浓度
0.5mol/lEDTA,PH=8配制量500ml配制方法1称取
93.06克EDTA.Na
2.2H2O,置于500ml烧杯中 2加入约400mlddH2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 3用NaOH调节PH值到8,约用10克固体NaOH 4在溶液冷却后,再用NaOH调节至PH=8 5加ddH2O将溶液定容到500ml 6高温高压灭菌后,室温保存NaOH溶液的配制组分浓度5mol/lNaOH配制量100ml配制方法1称取固体NaOH20克于容器中2加入ddH2O定容到100ml100mmol/lTris-HCl的配制组分浓度mmol/lTris-HCl,PH=
6.4配制量250ml配制方法1称取
3.025克Tris于250ml烧杯中. 2加入约200mlddH2O充分搅拌溶解. 3用浓盐酸调节PH值到
6.
4.所用浓盐酸约3ml 4将溶液定容至250ml 5用棕色瓶分装于4度冰箱中 6如使用,用水浴加热溶解.
2、氯仿-异戊醇的配制配制方法1简单的体积混合,既要求比例为241即可 2储存于棕色玻璃瓶子中 3置于4度冰箱以便日后使用3总的实验流程
3.1.总的DNA的提取
1. 在10ml离心管(eppendorf管)中加入4mlCTAB提取液及80ul巯基乙醇,在65℃水浴锅中预热
2. 取材料1-2g于研钵中,加入适量液氮迅速多次研磨成细粉状,转至预热的CTAB提取液中,用封口膜将离心管封密以防止巯基乙醇挥发.放回水浴中保温30分钟,保温过程中轻晃几次,保持摇匀.
3. 取出Eppenedorf管.置于冰上迅速冷却到室温,加入等体积的4ml氯仿-异戊醇
(241),轻微混合均匀且充分,使其彻底地混合成乳状液,然后4℃下离心12000rpm10min,轻轻将上清液吸取1ml于
1.5ml离心管,放于-20℃冰箱中备用.各加入液的用途
(1)去污剂CTAB可将细胞膜裂解,使DNA释放到提取液中,同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA能与DNase的辅助因子Mg2+结合,使DNase失去活性,不能降解从细胞中释放的DNA.
(2)还原剂巯基乙醇它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.
(3)氯仿—异戊醇它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去,将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.
(4)RNase它可去除核酸中的RNA,只留下DNA.
3.2.总DNA的纯化操作步骤
1. 取出
1.5ml离心管,内含所取DNA,加入100ul硅珠悬浮液(此液要求先行涡旋再使用),使用涡旋振荡器大约15s,使之充分混匀,于室温静置10分钟,再振荡5秒,后离心8000rpm15s4度,去除上清液得到硅珠——核酸复合物.
2. 将复合物用镊子一次打两个,打成液状,使之完全分散,加入漂洗液1ml,再涡旋充分混匀,后离心8000rpm15s弃掉上清液.
3. 重复上一步一次.
4. 用70%的1ml乙醇将硅珠——核酸复合物漂洗两次.每次涡旋充分混匀后,离心8000rpm15s,弃上清液,打散,最后用1ml无水乙醇再漂洗一次,用涡旋混匀离心8000rpm15s,然后将离心管管口打开倒置在吸水纸上,再将沉淀置于真空冷冻干燥机中风干复合物10分钟.
5. 加入100ulTE缓冲液充分混匀后,于56度水浴中保温10分钟,然后离心12000rpm5min.取上清液即为所需的DNA.
6. 将余下的复合物再次完全打散(即涡旋),加入100ulTE缓冲液进行第二次重旋,并于56度水浴中保温10min,12000rpm5min,取上清液于步骤5管中共存.
7. 将两次二合一的上清液离心混匀14000rpm10min,取上清液存于-20℃冰箱中.仪器的使用真空干燥器 在使用前要求先预热30分钟,只打开1号阀门. 打开盖子平衡放入离心管,然后顺次开启2号——3号——4号——5号门.进行干燥处理5分钟. 关闭各阀门.顺序为5号——4号——3号——2号——1号阀门.各加入液的配制
1、硅珠悬浮液的配制
(1) 称取
1.2g硅珠粉,溶解于10ml无菌水中.
(2) 放入4℃冰箱备用.
(3) 使用时先涡旋使其混合均匀.
2、漂洗液的配制称取GuSCN(可能产生有毒气体,要求在通风橱中进行)120克溶解于100mlTris-HCl100mMPH
6.4中.要求在60℃水浴中溶解.
3、TE缓冲液的配制10×TE,500ml配制如下将100mMTris-Hcl(PH=
8.0)
6.057g与10mMEDTA(PH=
8.0)
1.8612g溶于400ddH2O中,调PH=
8.0,定容到500ml
3.
3.DNA样品浓度、纯度测定取4ulDNA水溶液用双蒸水稀释到400ul,用紫外分光光度计测定其D23Onm、D260nm、D280nm值.根据D260nm值估测浓度根据D260nm/D23Onm、D260nm/D280nm值估测其纯度.
(1)浓度计算公式对于双链DNA而言D260nm为50ug/ml DNA样品的浓度(ug/ml)=D260nm×稀释倍数×50/1000
(2) 纯度估测标准纯的DNA溶液其D260nm/D280nm=
1.8;D260nm/D23Onm>
2.0DNA浓度的精确测定 去除一定量的DNA,稀释成200ug/ul,配制少量
400、
200、100和50ng的λDNA.取标准λDNA和样品各1ul,进行
0.8%的琼脂糖凝胶电泳.紫外灯下比较样品DNA条带的亮度,并对DNA样品进行定量、调整样品的DNA的量与100ugλDNA的亮度相一致.总的DNA跑出来条带在紫外光下看应该是明亮的一条没有拖尾的现象若有的话可能DNA部分降解或提纯的不彻底含有的RNA较多.虽然SSR对模板的要求不是太严格具体能否扩出条带还须实验证明或重新提取.
2.PCR扩增SSR-PCR扩增反应体系
1、10ul反应体系调温高压灭菌水H2O
5.45ul
5.45ul×a
5.45ul×a×b10×Buffer 1ul 1ul×a 1ul×a×b2mM-dNTP 1ul 1ul×a 1ul×a×b25mu-MgCl2 1ul 1ul×a 1ul×a×br-Taq
0.05ul
0.05u×al
0.05ula×bPrimer+
0.25ul
0.25ul×a
0.25ul×a×bPrimer-
0.25ul
0.25ul×a
0.25ul×a×bDNA模板 1ul 说明a个反应量=不同模板n+2,b为引物数+
22、作程序及其注意事项1 分装各型枪头.2 分装各型离心管.3 顺次用碳笔标明引物号,小master顺序号及总master顺序号.、4 收取冰块半盘,将取出各液放于冰上.5 配总master,先计算好a×b6 d-NTP和MgCl2要求加样前先轻微涡旋混匀, Taq酶要求在冰箱口取用.7 配master的顺序H2O——Buffer---dNTP---MgCl2---Taq8 轻涡旋总Master9 分装C个引物个小Master10 向C个小Master加入C个引物11 将含引物的C个Master涡旋混匀12 将N个模版点加到N×C个小离心管中,各含1ulDNA13 将各小Master,每9ul加入到含1ulDNA的离心管中14 时刻注意更换枪头,防止交叉感染,尽量不要将枪头放在液面下.15 将扩增好的DNA进行溴酚蓝点样,每离心管8ul
3、各加入液的配制
(1) 引物的稀释1 每管引物先1000rpm3min进行离心,将附在管壁上的粉末或膜状物离心到底部,小心打开盖子.2 加入经高温高压的灭菌水.针对不同的引物加入不同的量3 使最终浓度都为10um/L
(2) 溴酚蓝的配制1 将
0.125克溴酚蓝,20克蔗糖溶解为50ml的ddH2O2 再进行过滤3 放于4℃冰箱中储存
(3) Buffer的配制1)1×TEBuffer组成浓度10mMTris-HCl 1mMEDTAPH=
8.0配制量500ml配制方法量取下列溶液于500ml烧杯中 1MTris-HCl BufferPH=
8.0 5ml
0.5MEDTA PH=
8.0 1ml 向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌;室温保存.2)10×TEBuffer组成浓度100mMTris-HCl 10mMEDTA PH=
8.0配制量1000ml配制方法量取下列溶液于1升烧杯中1MTris-HClBufferPH=
8.0100ml;
0.5MEDTA PH=
8.020ml向烧杯中加入约800mlddH2O均匀混合;将溶液定容到1升后,高温高压灭菌;室温保存.1MTris-HCl的配制组分浓度1MPH=
7.
47.
68.0配制量500ml配制方法称取
6.057克Tris置于500ml烧杯中;加入约400ml的ddH2O充分搅拌溶解;按下表量加入浓盐酸调节所需PH值PH值 浓盐酸量
7.4 35ml
7.6 30ml
8.0 21ml将溶液定容到500ml;高温高压灭菌后,室温保存.PCR反应体系
1、本实验样品所采用的反应程序
2、PCR扩增仪的操作1)先通过观察哪个指示灯是空的扩增仪2)右旋打开盖子,按顺序摆放并用手柄轮压实3)做旋盖好盖子至刻度处4)打开操作程序,选好人名反应体系并逐一确定5)掌握扩增仪时间2:30降温需30分钟聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEPAGE操作流程及注意事项
1、涂胶1) 将有耳玻片(耳朝下)泡于反硅化剂中,新液25分钟,旧液30分钟.2) 涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴,轻而匀的沿一个方向涂三次,静10分钟.3) 到时间取出.打开通风橱风干30分钟.
2、封胶1) 将两玻片对贴于橡胶框中,放平,用力拧死,夹住橡胶管.2) 溶废琼脂胶,分两次第一次50秒,第二次10-20秒,防止沸出.3) 用小细长枪头通透加胶枪头,便于加样通畅,少起气泡.4) 吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴,将两面玻片充分封死,防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳,静止凝胶15分钟.(有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片,利于胶流下)
3、灌胶1 用长细枪头透开加胶枪头2 从中间加入,每次不要全部打完,留一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.3 插梳子时两端平整,梳子紧贴玻板,梳齿头部不可有气泡.4 拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透,然后平行用力拔出.5 在插梳子15分钟内跟踪观察,适当下按,保证孔的深度.6 等待2小时,以便胶充分凝固.
4、吹孔1) 向中间槽加入1倍粗制TBE,要淹没过内玻片约1厘米.2) 拔梳子,小心平稳,均匀平衡.3) 调1000p枪到300-600ul,进行吹孔,将小孔内沉淀物吹打干净,加样中再视时吹孔.
5、加样1) 用细长专用枪加入DNA
0.5ul.2) 一手托另一臂的肘,以保证加样手不抖.3) 一定垂直加到孔中去,不脱尾,不吸水,不靠壁,干净利落.4) 加完一次.在放于桌旁的吸纸上,将细枪头上余液吸干.5) 首、中、尾各留1到2个孔,两面胶孔的Marker不完全一样,以便区分.6) 加Marker
0.15ul一般取
0.3ul每孔注如一半,可用两个孔.
6、跑胶1 向两侧槽中加入粗制TBE,至U管线处.2 打开电源,稳压到120V3 电泳2h左右4 当样品跑到底部2cm处,关闭电源.
7、撬玻片1) 刀片不伸入过深.刀片平行于玻片,稍用力.2) 将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中,还有梳子.3) 清理琼脂胶,放于烧杯中.4) 胶玻片放于盘中,银染.各加入液的配制
1、反硅化剂的配制1) 量取500mlddH2O.2) 用冰乙酸把ddH2OPH调至
3.
5.3) 再加Bind-silica 2ml.4) 用热磁力搅拌器搅拌均匀.
2、TBE电泳母液(10×)的配制1) 分别称取54克Tris碱,
27.5克硼酸,20ml
0.5mol/EDTA(PH=
8.0)2) 将各组分别加入1升烧杯中,用ddH2O定容到1升.3) 在电泳时使用1倍工作液,按14与水混合.4) 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.5) 盛于玻璃瓶,在室温保存.
3、聚丙烯酰胺的配制(8%)组分浓度80%配制量500ml配制方法量取210克尿素,1克甲叉,39克丙烯酰胺,放入500ml烧杯中.加入少量水及10×TBE50ml,用搅拌器搅拌均匀,用微波炉加热四次(约20秒)助热溶解,透明无杂质.用双蒸水定容,溶后于4度冰箱保存.(有杂质需过滤)
4、灌胶液的配制对于使用的灌胶要在8%胶中加入东西.取35克8%胶液,向其中加入175ul10%APS和35ulTEMED;缓慢混合,不可使其产生气泡.(10%APS取1g过硫酸铵,加入10ml高温灭菌水)银染操作步骤
(1) 取下带胶玻璃板,用ddH2O冲两次,每次2分钟.
(2) 用固定液固定10分钟.
(3) 用ddH2O清洗两次,每次2分钟.
(4) 加AgNO3溶液,银染6到7分钟.
(5) 用ddH2O清洗两次,每次2分钟.
(6) 加入显影液,静候20到30分钟至显出图像为止.
(7) 用自来水冲洗,贴上顺序标签.
(8) 拍照近景端平,保持标签清晰.各加入液的配制
1、显影液的配制量取50ml30%NaOH(15g)、10ml
0.756%四硼酸钠和10ml甲醛,用双蒸水定容到1升;在室温保存.
2、固定液的配制称取200ml无水乙醇和10ml纯乙醇,加入2升烧杯中,用ddH2O定容道2升
3、AgNO3的配制量取AgNO3原液2500ul;将250mlddH2O和2500ulAgNO3加入胶玻片上.(AgNO3原液的配制50ml中含AgNO
37.5g浓度为
0.15g/ml)。