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DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1.溶液I—溶菌液溶菌酶它是糖苷水解酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-14糖苷键,因而具有溶菌的作用当溶液中pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制葡萄糖增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解EDTA
(1)螯合Mg2+、Ca2+等金属离子,抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用(DNase作用时需要一定的金属离子作辅基);
(2)EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境2.溶液II-NaOH-SDS液NaOH核酸在pH大于5,小于9的溶液中,是稳定的但当pH>12或pH<3时,就会引起双链之间氢键的解离而变性在溶液II中的NaOH浓度为
0.2mo1/L,加抽提液时,该系统的pH就高达
12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性SDS SDS是离子型表面活性剂它主要功能有
(1)溶解细胞膜上的脂质与蛋白,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜
(2)解聚细胞中的核蛋白
(3)SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R+-蛋白质的复合物,使蛋白质变性而沉淀下来但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用,所以在以后的提取过程中,必须把它去除干净,防止在下一步操作中(用RNase去除RNA时)受到干扰
3.溶液III--3mol/LNaAc(pH
4.8)溶液NaAc的水溶液呈碱性,为了调节pH至
4.8,必须加入大量的冰醋酸所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液用pH
4.8的NaAc溶液是为了把pH
12.6的抽提液,调回pH至中性,使变性的质粒DNA能够复性,并能稳定存在而高盐的3mol/LNaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之前者是因为中和核酸上的电荷,减少相斥力而互相聚合,后者是因为钠盐与SDS-蛋白复合物作用后,能形成较小的钠盐形式复合物,使沉淀更完全4.为什么用无水乙醇沉淀DNA?用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法乙醇的优点是可以任意比和水相混溶,乙醇与核酸不会起任何化学反应,对DNA很安全,因此是理想的沉淀剂DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在,当加入乙醇时,乙醇会夺去DNA周围的水分子,使DNA失水而易于聚合一般实验中,是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合,其乙醇的最终含量占67%左右因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇(因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇昂贵)但是加95%的乙醇使总体积增大,而DNA在溶液中有一定程度的溶解,因而DNA损失也增大,尤其用多次乙醇沉淀时,就会影响收得率折中的做法是初次沉淀DNA时可用95%乙醇代替无水乙酵,最后的沉淀步骤要使用无水乙醇也可以用
0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA一般在室温下放置15-30分钟即可5.在用乙醇沉淀DNA时,为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达
0.1~
0.25mol/L?在pH为8左右的溶液中,DNA分子是带负电荷的,加一定浓度的NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷,减少DNA分子之间的同性电荷相斥力,易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀,当加入的盐溶液浓度太低时,只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合,这样就造成DNA沉淀不完全,当加入的盐溶液浓度太高时,其效果也不好在沉淀的DNA中,由于过多的盐杂质存在,影响DNA的酶切等反应,必须要进行洗涤或重沉淀6.加核糖核酸酶降解核糖核酸后,为什么再要用SDS与KAc来处理?加进去的RNase本身是一种蛋白质,为了纯化DNA,又必须去除之,加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀,再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物,使沉淀更加完全也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀,去除RNase在溶液中,有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果7.为什么在保存或抽提DNA过程中,一般采用TE缓冲液?在基因操作实验中,选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用磷酸盐缓冲系统(pKa=
7.2)和硼酸系统(pKa=
9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围pH,可作DNA的保存液,但在转化实验时,磷酸根离子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3PO42沉淀,在DNA反应时,不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同,有的要求高离子浓度,有的则要求低盐浓度,采用Tris-HCl(pKa=
8.0)的缓冲系统,由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存在金属离子的干扰作用,故在提取或保存DNA时,大都采用Tris-HCl系统,而TE缓冲液中的EDTA更能稳定氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开,异戊醇的作用是消除抽提过程中出现的泡沫氯仿是强蛋白质变性剂,抑制RNA酶的活性,除去蛋白质污染基因组DNA-CTAB法CTAB法原理植物DNA提取经典方法CTABhexadecyltrimethylammoniumbromide十六烷基三甲基溴化铵是一种阳离子去污剂具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中
0.7mol/LNaClCTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提去除蛋白多糖酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热且离心时温度不要低于15℃.基因组DNA-CTAB法CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HClpH
8.0提供一个缓冲环境防止核酸被破坏;EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子抑制DNase活性;NaCl提供一个高盐环境使DNP充分溶解存在于液相中;CTAB溶解细胞膜并结合核酸使核酸便于分离;β-巯基乙醇是抗氧化剂有效地防止酚氧化成醌避免褐变使酚容易去除基因组DNA-CTAB法CTAB提取缓冲液的改进配方PVP聚乙烯吡咯烷酮是酚的络合物能与多酚形成一种不溶的络合物质有效去除多酚减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合有效去除多糖.基因组DNA的提取核酸分离纯化采用吸附材料吸附的方式分离DNA时应提供相应的缓冲体系采用有机酚/氯仿抽提时应充分混匀但动作要轻柔离心分离两相时应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取核酸分离纯化蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性SDS异硫氰酸胍等高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离纯化多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯1/2体积氯苯可以与多糖的羟基作用从而去除多糖.用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000含
1.2MNaCl冰浴20min.核酸分离纯化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:β-巯基乙醇抗坏血酸半胱氨酸二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP聚乙烯吡咯酮PEG聚乙二醇它们与酚类有较强的亲和力可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸其它的杂质均被洗掉达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAcpH
5.23M用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子抑制DNasepH值为
8.0可防止DNA发生酸解基因组DNA提取常见问题DNA中含有蛋白多糖多酚类杂质DNA在溶解前有酒精残留酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留原因对策重新纯化DNA过吸附柱去除蛋白多糖多酚等杂质重新沉淀DNA让酒精充分挥发增加70%乙醇洗涤的次数2-3次加入RNase降解RNA问题一:DNA样品不纯抑制后续酶解和PCR反应.DNA提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈DNA被机械打断外源核酸酶污染反复冻融尽量取新鲜材料低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时可增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中避免反复冻融问题二:DNA降解.DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜幼嫩的材料动植物要匀浆研磨充分;G+菌酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时时间适当延长对于动物细胞细菌可增加PK的用量.增加吸附的时间或低温沉淀小心操作问题三:DNA提取量少.。