多重耐药大肠埃希菌基因分型及其与耐药表型的关系

多重耐药大肠埃希菌基因分型及其与耐药表型的关系__李彬，黄心宏，傅蔷，曹颖平，潘玉红【摘要】目的分析福州地区临床分离的多重耐药大肠埃希菌的基因型及其与细菌耐药表型的关系方法收集临床分离的多重耐药大肠埃希菌88株，采用KB法进行药敏试验，多重PCR法进行基因分型结果多重PCR法可将大肠埃希菌分为4个基因型，其中检出D型42株，B2型17株，A型17株，B1型12株4组基因型对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和妥布霉素的耐药率差别有统计学意义Plt;

0.05结论多重耐药大肠埃希菌对多种抗生素具有很高的耐药性基因分型以致病性较强的B2型与D型为主，应采取相应措施预防院内感染【关键词】大肠杆菌O157;药物耐受性;聚合酶链反应;基因型;序列分析大肠埃希菌是医院感染最常见的革兰阴性条件致病菌，可在医院环境中__存在，尤其当患者免疫力低下时，常引起泌尿系统、下呼吸道、胃肠道、手术切口及烧伤感染和菌血症，病死率高近年来医院获得性感染的发病率逐年上升，且由于抗生素的不合理应用和耐药基因的广泛播散，大肠埃希菌对抗生素的耐药问题日益突出，多重耐药临床分离株愈发常见笔者对临床分离多重耐药大肠埃希菌进行遗传分型，以期获得流行病学资料，便于进一步研究　　1材料与方法　　

1.1菌株收集检验科2008年8月-2009年2月临床分离的多重耐药大肠埃希菌共88株，标本来源包括痰、尿液、胆汁、创面分泌物、血液等多重耐药菌定义为对任何不同三种类型以上抗生素耐药的临床分离株

[1]　　

1.2仪器及试剂常规药敏纸片氨苄西林每片10μg、氨苄西林/舒巴坦每片20μg、阿米卡星每片30μg、环丙沙星每片5μg、左氧氟沙星每片5μg、亚胺培南每片10μg、复方新诺明每片25μg、妥布霉素每片10μg、哌拉西林/他唑巴坦每片100μg/10μg、头孢唑啉每片30μg、头孢呋辛每片30μg、头孢曲松每片30μg、头孢他啶每片30μg、头孢噻肟每片30μg、头孢吡肟每片30μg、头孢噻肟/克拉维酸每片30μg/10μg、头孢他啶/克拉维酸每片30μg/10μg均购自英国Oxid公司;基因分型引物、dNTPMix10mmol/L、Taq酶、琼脂糖、LoadingBuffer6×、__rker100～600bp均购自__生工生物工程技术服务有限公司MH琼脂、伊红美蓝琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司PCR扩增仪美国BIORAD公司;全自动细菌鉴定仪VITEK60型，法国梅里埃公司　　

1.3质量控制质控菌株为___临检中心的大肠埃希菌ATCC25922　　

1.4方法　　

1.

4.1菌株鉴定采用全自动细菌鉴定仪鉴定菌株　　

1.

4.2药敏试验采用KB法，判断结果参考美国临床和实验室标准协会CLSI标准

[2]　　

1.

4.3多重PCR引物参照文献

[3]煮沸法提取细菌DNA作为模板进行扩增反应体系为总体积20μL，引物各为1μmol/L，dNTPMix200μmol/L，Taq酶

2.5U，模板2μL循环参数为94℃5min→94℃30s→55℃30s→72℃30s，共30个循环，最后1次延伸时间为7min引物序列及产物长度见表1扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳后观察结果表1多重PCR引物序列　　

1.

4.4基因分型根据多重PCR扩增产物的电泳结果，按照图1进行分型

[3]　　chuA、yjaA和TspE

4.C2为多重PCR检测的目标基因;A、B

1、B2和D分别表示大肠埃希菌的四个基因型.　　

1.5统计学处理、采用WHONET

4.0软件分析数据根据遗传分型结果分为A、B

1、B

2、D四组，采用行列表资料的χ2检验对药敏结果的数据进行分析，Plt;

0.05为差别有统计学意义　　2结果　　

2.1多重耐药大肠埃希菌耐药谱分析多重耐药大肠埃希菌除对亚胺培南全部敏感外;对阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦耐药率lt;14%，可作为除亚胺培南之外的临床经验性用药首选;对其他常用抗生素的耐药率均gt;60%;其中头孢菌素、氟喹诺酮类耐药率高达80%以上表2　表2多重耐药大肠埃希菌药敏情况　　

2.2基因分型采用多重PCR分析88株多重耐药大肠埃希菌，根据PCR产物片段大小结合图1的判读标准进行基因分型得出结果图2本研究中的大肠埃希菌检出D型占总数

47.73%42/88;其次为A和B2型，各占

19.32%17/88;B1型最少，占

13.63%12/88，说明次实验收集到的多重耐药大肠埃希菌中，大多数存在较强的致病力　　

2.3不同基因分型的药敏情况将88株多重耐药大肠埃希菌以不同基因型分为A、B

1、B

2、D4组，并对其对15种抗生素的耐药情况进行统计分析发现，4组对阿米卡星、头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和妥布霉素的耐药率差别有统计学意义Plt;

0.05A和B2型对阿米卡星的耐药率为0，较B1和D更为敏感;B2和D型对头孢他啶和头孢曲松的敏感性不如A和B1型;D型对头孢噻肟最为敏感，B2对妥布霉素最敏感表3表3不同基因分型对药物耐药率比较　　3讨论　　笔者采用文献

[3]方法对大肠埃希菌进行快速分型该法快速、高效、准确，可在很短的时间内将大肠埃希菌分为4种主要的亲缘群体，分别是A、B

1、B2以及D型Clermont等在对230株大肠埃希菌进行基因分型时发现该菌主要为B2型，其致病性最强;其次为D型的致病性稍弱;而体内共生的大肠埃希菌主要是A型

[3]本组多重耐药大肠埃希菌中B2型占

19.32%;D型检出比例更高，占

47.72%，表明在多重耐药的大肠埃希菌中致病力较强的两种亚型B2和D型共占

67.04%，较国内文献报道的73%略低

[4]Zhang等人报道尿路感染的大肠埃希菌中B型占69%，并推断肠道外感染的大肠埃希菌其约2/3为B2亚型

[5]，与本研究中D型占多数的比例不同，可能是标本组成不同造成差异，也可能是地区差异的缘故，因需进一步研究研究还发现，A型感染占

19.32%，与B2型占的比例相同，由于此型常见于人体内共生菌的亚型

[3]，是否这些临床分离菌属于患者体内共生菌异位感染还有待进一步研究　　本组多重耐药临床分离菌株药敏结果显示，其对大部分β内酰胺类、喹诺酮类和氨基糖苷类耐药，而对哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星敏感性较高;其中对亚胺培南的敏感性为100%尽管亚胺培南对该组细菌具有高敏感性，但因其__昂贵，临床上并不将其作为治疗的首选用药，因而临床上可选用哌拉西林/他唑巴坦和阿米卡星作为经验性用药结合基因分型研究与药敏结果分析发现各种基因型药物敏感性存在一些差异，即多重耐药大肠埃希菌的四种基因型虽然对大多数抗生素的耐药情况大致相同，但肠外致病较强的B2型和D型在对三代头孢类抗生素的耐药性均较A型和B1型强氨基糖苷类抗生素对需氧革兰阴性杆菌具有强大的抗菌活力，但耐药菌株可以通过钝化酶破坏其分子结构造成细菌耐药本组B2型较其他基因型对阿米卡星的敏感性较好，有待进一步探究　　通过根据基因分型结果能明确感染的病原生理学，判断医院感染或是感染复发

[6];明确不同基因型的亲缘种群与毒力的关系，提示感染致病菌来源肠道内或肠道外的感染与不同的基因片段相关

[5]，并可作为筛选致病菌的工具，作为感染暴发的筛查和流行病学调查【____】1]戴自英.多重耐药菌感染在临床上的重要意义[J].中华传染病__1999172;77

78.　　

[2]ClinicalandLaboratoryStandadsInstitute.Perfor__n__standardsforAntimicrobialsus__ptibilitytesting;18thInfor__tionalSupplement[S].2008M100S

18.　　

[3]ClermontOBonacorsiSBingenE.Rapidand______determinationoftheEscherichiacoliphylogeneticgroup[J].ApplEnvironMicrobiol20006610:4555

4558.　　

[4]刘玲郑铃陈建玲.福州市饮食行业从业人员肠道大肠埃希菌耐药及产E__L状况[J].福建医科大学学报2008421:65

69.　　

[5]代杰志陆茜蔡成松等.大肠埃希菌的分型研究[J].中国微生态学__2008205:443

445.　　

[6]ZhangLXFox__nB__rrsC.BothurinaryandrectalEscherichiacoliisolatesaredominatedbystrainsofphylogeneticgroupB2[J].JClinMicrobiol20024011:3951

3955.　　

[7]刘丁府伟灵.细菌基因分型技术及其在医院感染中的应用[J].中华医院感染学__20031310:995

998.。