大鼠重症急性胰腺炎胰腺组织中NO生成及iNOS表达的变化

大鼠重症急性胰腺炎胰腺__中NO生成及iNOS表达的变化【摘要】目的探讨重症急性胰腺炎SAP时胰腺__一氧化氮NO和诱导型一氧化氮合酶iNOS表达的变化方法36只健康雄性Sprague-Dawley大鼠随机分为2组SAP组n=18以逆行胰胆管内加压注射5%牛磺胆酸钠的方法建立SAP模型;对照组n=18以同法注射等剂量生理盐水造模后

6、

12、24h每组随机处死大鼠6只，检测血淀粉酶、胰腺__病理__学改变、胰腺__NO水平及iNOS活性以及腺腺__iNOSmRNA表达的变化结果与对照组相比，SAP组在6h时间点上，胰腺__中NO水平、iNOS活性明显升高Plt;

0.01，免疫组化和RT-PCR结果也显示iNOS蛋白及iNOSmRNA表达增高Plt;

0.01;随时间延长，在12h和24h各指标到达高峰，24h仍维持在较高水平Plt;

0.01结论在SAP时，随着时间的延长，iNOS表达增高，从而产生高浓度的NO，加重胰腺__的损伤【关键词】重症急性胰腺炎;一氧化氮;诱导型一氧化氮合酶　Abstract:O__ectiveToinvestigatethechangesinthefor__tionofnitricoxideNOandtheexpressionofinduciblenitricoxidesynthaseiNOSinpancreatictissueinsevereacutepancreatitisSAPinrats.MethodsThirty-sixhealthy__leSprague-DawleySDratswererandomlyallocatedintosham-operatedgroupcontrolgroupandSAPgroupn=18each.ThemodelofSAPwasestablishedbyinjectionof5%sodiumtaurocholateintothecommoncholedocho-pancreaticductinSDrats.Thesamedosageofnor__lsalinewasgiventothecontrolgroupinthesameway.Theratswererandomlysacrifi__dat6h12hand24hrespectivelyn=6eachandtheirbloodsampleswerecollectedfor____yses.Thevariationofserumamylaselevelsandthepathohistologicalchangesofthepancreasweredetectedbycolorimetricmethod.TheexpressionofiNOSproteinsandiNOSmRNAinthepancreasweredeterminedbyimmunohistochemistryandreversetranscriptasepolymerasechainreactionmethodRT-PCRrespectively.ResultsTheNOlevelandtheactivityoftotaliNOSinthepancreasat6hsignificantlyincreasedintheSAPgroupascomparedtothecontrolgroupPlt;

0.

01.ImmunohistochemistryandRT-PCRalsorevealedanincreaseintheexpressionofpancreaticiNOSproteinandmRNAinthepancreasPlt;

0.

01.Eachparameterincreasedwithtimeandreachedthepeakat12handstillretainedahighlevelat24hPlt;

0.

01.ConclusionInSAPtheiNOSexpressionwasupregulatedwithtimeandthusthehighcon__ntrationofNOwasprodu__dwhichaggr__atedthelesionofpancreatictissue.　　Keywords severeacutepancreatitis;nitricoxide;induciblenitricoxidesynthase　　重症急性胰腺炎severeacutepancreatitisSAP临床表现凶险，常发生局部或全身并发症;目前对SAP的治疗虽有所进展，但如何防治SAP仍无特异手段，导致SAP的病死率居高不下近年来研究发现，一氧化氮nitricoxideNO在SAP的发生与发展过程中起着重要作用本实验通过制备大鼠SAP模型，探讨NO、诱导型一氧化氮合酶induciblenitricoxidesynthaseiNOS与胰腺__损伤的关系　　1材料和方法　　

1.1实验动物健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，体重200～250g，清洁级，由徐州医学院实验动物中心提供　　

1.2主要试剂和仪器牛磺胆酸钠Sig__公司，NO检测试剂盒南京建成生物工程研究所，iNOS免疫组化试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司，TIANScriptM-MLVRT-PCR试剂盒__捷瑞生物公司，iNOS及β-actin引物合成由__生工生物工程技术服务有限公司完成全自动生化分析仪美国Vitros公司　　

1.3方法　　

1.

3.1动物分组及SAP模型制备36只大鼠随机分为2组SAP组n=18采用Aho法

[1]，逆行胰胆管注射5%牛磺胆酸钠

0.1ml/100g制备SAP模型;对照组n=18处理方法同SAP组，以等量生理盐水替代5%牛磺胆酸钠于制模成功后第

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12、24h，每组分别随机选取6只大鼠，予以牵拉颈部处死心脏穿刺抽血，血清存于-20℃冰箱中保存备检;从胰腺相同位点分别取胰腺__立即放入液氮中，2h后转入-70℃冰箱中保存;部分胰腺__用10%中性甲醛固定24～48h，常规脱水、包埋　　

1.

3.2血清淀粉酶的测定用全自动生化分析仪，采用碘比色法测定血清淀粉酶　　

1.

3.3胰腺__病理学观察胰腺__常规浸蜡、包埋，3μm厚度切片，苏木精-伊红染色光镜下×100每张切片随机选取10个高倍镜视野，从水肿、感染、出血和坏死4个方面评价胰腺__损伤的程度参考Kusske标准

[2]，由2位专业病理医师双盲阅片;各项最低分为0，最高分为4分;取各项积分总和为最终得分　　

1.

3.4胰腺__NO的检测取冰冻胰腺__100mg，加入生理盐水，制备成10%的__匀浆，低温离心3000r/min10min，取上清液，根据试剂盒说明书完成NO含量的检测NO活性单位以μmol/g表示同时用考马斯亮蓝G-250测定__蛋白　　

1.

3.6胰腺__iNOS免疫__化学测定严格按照试剂盒说明操作一抗兔抗大鼠工作浓度1∶100以PBS代替一抗作为空白对照以细胞出现棕黄色颗粒作为阳性反应高倍镜下×400，每张切片随机选5个视野每个视野在阳性表达及背景各取5个点的灰度值，以两者之差的绝对值作为阳性表达的灰度，计算每个视野的灰度平均值，再计算5个视野的平均值作为该片的灰度表达值采用LEICAQWINSTANDARDV23图像处理与分析系统完成图像分析　　

1.

3.7iNOSmRNA的RT-PCR检测引物序列为iNOS140-F:5′-T__CCT__AGACTGGATTTG-3′AA79218，iNOS140-R:5′-TCCT__CAGATGTGGGTCTTC-3′AA79219;β-actin452-F:5′-ACCACAGTCCAT__CATCAC-3′AA79226，β-actin452-R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′AA79227以BandScan

5.0软件对条带进行分析，以目的基因iNOSmRNA的扩增量/内参β-actin的扩增量表示iNOSmRNA的相对表达量　　

1.4统计学处理采用Sig__Stat

2.03对实验数据进行统计分析数据以±s表示组间比较采用t检验;组内各时间点的比较采用单因素方差分析OneWayANOVA，两两比较采用q检验New__n-KeulstestPlt;

0.05认为差异有统计学意义　　2结果　　

2.1血清淀粉酶的变化SAP组血清淀粉酶6h开始明显升高Plt;

0.01，随时间的增加而逐渐升高，24h达到高峰Plt;

0.01;SAP组各时间点血清淀粉酶水平均明显高于对照组Plt;

0.01见表1表12组造模后各时间点血清淀粉酶的变化　　

2.2病理__学变化与对照组比较，SAP组各时间点病理改变显著，制模后6h可见点状坏死灶，间质水肿，伴中性粒细胞浸润，小叶结构紊乱，腺泡细胞颗粒样或空泡样变性;制模后12h可见片状凝固坏死，大量中性粒细胞分布于间质，红细胞分布于间质或片状存在于胰腺__内;制模后24h胰腺__大片坏死，伴大量中性粒细胞浸润，腺叶排列紊乱，坏死区腺泡结构消失，腺泡萎缩，有胞核的溶解和消失病理损害评分SAP组与对照组同时间点相比显著增高Plt;

0.01;SAP组12h和24h较6h明显增高Plt;

0.01，24h到达高峰，12h和24h相比差异无统计学意义Pgt;

0.05见图1及表2图12组大鼠造模后各时间点胰腺__病理学变化苏木精-伊红染色，×100A.对照组;B.SAP组6h;C.SAP组12h;D.SAP组24h表22组大鼠造模后各时间点胰腺病理__学评分变化　　

2.3胰腺__NO水平的变化对照组各时间点NO水平没有明显变化;SAP组6h相对于对照组已有明显升高，随着时间的增加在12h到达高峰Plt;

0.01，24h仍维持较高水平，但12h和24h2组NO水平差异无统计学意义Pgt;

0.05见表3表32组大鼠造模后各时间点胰腺__NO水平的变化　　

2.4iNOS活性的变化SAP组iNOS活性在6h相对于对照组已明显升高，12h和24h到达高峰Plt;

0.01，12h和24h之间差异无统计学意义Pgt;

0.05见表4表42组大鼠造模后各时间点胰腺__iNOS活性的变化　　

2.5免疫__化学iNOS蛋白表达的变化iNOS蛋白在胰腺__中的阳性表达主要存在于血管内膜、平滑肌和胰岛细胞的细胞质中，以胰岛细胞的细胞质中为主

[3]对照组各时间点未见阳性表达SAP组造模后6h即可见胰岛细胞质内有淡棕黄色阳性表达，随着时间的延长在12h胰岛细胞质内棕黄色染色颗粒增加，颜色变深，阳性表达越来越明显，在24h表现为典型的棕黄色颗粒，阳性表达更加明显灰度值测定可见相对于6h，SAP组12h和24h阳性表达明显Plt;

0.01，以24h最为明显，但12h与24h之间差异无统计学意义Pgt;

0.05见图2及表5　　

2.6胰腺__iNOSmRNA表达的变化对照组未见iNOSmRNA的表达或表达非常微弱;SAP组各时间点iNOSmRNA的表达均明显高于对照组Plt;

0.01;SAP组6h即有明显表达，与6h相比12h表达最为明显，24h仍维持在较高水平Plt;

0.01见图3及表6图22组大鼠造模后各时间点胰腺__中iNOS的表达免疫组化SP法A.对照组×100;B.SAP组6h×400;C.SAP组12h×400;D.SAP组24h×400表52组大鼠造模后各时间点胰腺__iNOS蛋白表达的变化图3iNOSmRNA电泳结果M.__rker50～500bp;

1.对照组6h;

2.对照组12h;

3.对照组24h;

4.SAP组6h;

5.SAP组12h;

6.SAP组24h表62组大鼠造模后各时间点胰腺__iNOSmRNA表达的变化　　3讨论　　NO是一种具有扩血管作用的不稳定性体液因子因其半衰期极短仅为2～6s，且可自由地通过细胞膜发挥生物活性作用，因此被认为是一种理想的信使分子一氧化氮合酶NOS是NO合成过程中的关键酶，分为神经型NOSnNOS、内皮型NOSeNOS和iNOS3种类型作为NOS的主要分型，iNOS的作用主要体现在病理情况下，如感染、炎性细胞因子__等，而在正常生理情况下则几乎不表达

[4]　　对于NO在SAP发病中的作用，目前的报道不多且存在很多争议Ayub等

[5]发现，急性胰腺炎大鼠的血管内皮细胞、平滑肌细胞以及腹腔巨噬细胞iNOS表达增强，血清NO含量升高，因而推测NO参与了胰腺__的损伤过程;但Weidenbach等

[6]并未观察到此类改变，相反，发现水肿性胰腺炎大鼠在输注NO合成酶抑制剂后，胰腺血流减少且胰腺炎病情加重，因此推测NO对胰腺微循环有保护作用　　本研究中，我们借助SAP大鼠模型，通过对血清淀粉酶、胰腺病理损害、胰腺__中NO水平等相关指标的检测分析，提示NO水平的增高可能是SAP时胰腺__损伤的重要原因之一进一步的研究显示，SAP大鼠iNOS蛋白和mRNA基因表达增高，随观察时间的延长呈上升趋势，并与NO的增高具有时间上的一致性由此我们认为，SAP时，随着胰腺炎的发展和胰腺__损伤加重，iNOS表达增加，从而产生高浓度的NO;而高浓度的NO具有细胞毒性，反过来加重胰腺__的损伤其可能的机制为胰腺在正常时iNOS不表达或微量表达，而在胰腺炎发展过程中产生大量的细胞因子、中性粒细胞、内毒素、炎性介质等可激发iNOS的表达，从而产生高浓度的NO，过高浓度的NO加重了胰腺__的损伤【____】　

[1]AhoHJNevalainenTJ，NevalainenTJ.Experimentalpancreatitisintherat.Sodiumtaurocholate-indu__dacutehaemorrhagicpancreatitis[J].ScandJGastroenterol1980154:411-

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[2]KusskeAMRongioneAJAshleySWetal.Interleukin-10preventsdeathinlethalnecrotizingpancreatitisinmi__[J].Surgery19961202:284-

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[3]李柏峰，刘永锋.一氧化氮在大鼠胰腺缺血/再灌注中的变化及作用[J].中国医科大学学报，2005346:507-

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[5]AyubKSerracino-InglottFWilliamsonRCetal.Expressionofinduciblenitricoxidesynthasecontributestothedevelopmentofpancreatitisfollowingpancreaticischaemiaandreperfusion[J].BrJSurg2001889:11__-

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[6]WeidenbachHLerchMMGressTMetal.Vasoactivemediatorsandtheprogressionfromoede__toustonecrotisingexperimentalacutepancreatitis[J].Gut1995373:434-

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