急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义【摘要】目的观察Livin基因在急性白血病AL病人白血病细胞中的表达及其临床意义方法采用半定量逆转录聚合酶链反应RTPCR方法检测41例不同时期AL病人白血病细胞LivinmRNA的表达水平，以10例健康人作为正常对照结果AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率为

53.7%其中急性淋巴细胞白血病ALL和急性非淋巴细胞白血病ANLL病人LivinmRNA阳性表达率分别为

53.8%、

53.6%，二者比较差异无显著性，但均高于正常对照组

10.0%P=

0.

035、

0.017初治和复发AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率分别为

52.4%、

85.7%，明显高于对照组P=

0.

025、

0.004缓解组病人LivinmRNA阳性表达率为

15.4%，明显低于初治组和复发组P=

0.

004、

0.030，而与对照组相比差异无统计学意义白细胞计数≥50×109/L的初治白血病病人LivinmRNA的阳性表达率

77.8%，7/9明显高于白细胞计数lt;50×109/L的初治病人

25.0%，3/12P=

0.022，其表达水平也明显高于后者T=

6.50，Plt;

0.05结论LivinmRNA过度表达参与了AL的发病，可作为AL的诊断、复发及预后判断的指标之一LivinmRNA表达在AL细胞的增殖分化和或抗凋亡过程中发挥了重要作用，可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一，可作为治疗的一个潜在靶点【关键词】Livin基因;白血病;逆转录聚合酶链反应[ABSTRACT]O__ectiveToexplorethecorrelationbetweentheexpressionofLivingeneinacuteleukemicAL__llsanditsclinicalsignifican__.MethodsThelevelsofleukemic__llLivinmRNAin41ALpatientsand10healthycontrolsweremeasuredbysemiquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreactionRTPCRtechnique.ResultsThepositiveexpressionrateofleukemic__llLivinmRNAinthepatientswas

53.7%andthatofLivinmRNAinALL__llsandANLL__llswere

53.8%and

53.6%respectivelythedifferen__betweenthemwasnotsignificantbuthigherthanthatinnor__lcontrols

10.0%P=

0.

0350.

017.TheexpressionofLivinmRNAininitiallytreatedALpatientsandtherecurrentwas

52.4%and

85.7%respectivelywhichwassignificantlyhigherthanthatinnor__lcontrolsP=

0.

0250.

004.TheexpressionofLivinmRNAinpatientsatremissionwas

15.4%whichwaslowerthanthatininitiallytreatedandrecurrentpatientsP=

0.

0040.030buttherewasnostatisticalsignifican__ascomparedwithnor__lcontrols.BesidestheinitiallytreatedALpatientswithaleukocytecountofatleast50×109/LhadasignificantlyhigherLivinmRNAexpressionrate

77.8%7/9thanthatwithaleukocytecountoflessthan50×109/L

25.0%3/12P=

0.

022.InadditionthelevelofLivinmRNAintheformerwassignificantlyhigherthanthatofthelatterT=

6.50Plt;

0.

05.ConclusionOverexpressionofLivinmRNAinvolvesinthepathogenesisofacuteleukemiawhichcanbeusedasoneoftheparametersinthediagnosispredictionofrecurren__andprognosisofthedisease.TheexpressionofLivinmRNAplaysanimportanteffectontheproliferationanddifferentiationofAL__llswhich__ybeoneofthereasonsleadingtoinsensitivetochemotherapyofAL__llsandbeusedasapotentialtargetforthetreatmentofthedisease.　　[KEYWORDS]Livingene;leukemia;reversetranscriptasepolymerasechainreaction　　凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性近年发现的凋亡蛋白抑制因子IAP是一类重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生发展关系密切目前，人类IAPs家族中已发现有NIAP、XIAP、clAP

1、clAP

2、survivin、apollon、ILP2和Livin共8个成员，其抗凋亡功能远强于Bc12家族，在肿瘤的发病机制中起着重要作用其中clAP

1、clAP

2、survivin等多个IAP家族成员在白血病细胞中高表达，且与预后相关[13]Livin是IAPs家族中的一个新成员，有2种异构体Livinα和Livinβ，特异性表达于人的胚胎__及大多数人类实体瘤__，在分化成熟的正常__中无表达或低表达[46]，在肿瘤__中表达明显增高，与肿瘤的发生密切相关，可能成为肿瘤基因诊断和治疗的新靶点

[7]本研究旨在观察Livin基因在各类急性白血病AL病人中表达水平的变化，并探讨其临床应用价值　　1对象与方法　　

1.1研究对象　　AL病人41例，男16例，女25例;年龄19～80岁，中位年龄52岁其中急性非淋巴细胞白血病ANLL28例M2者10例，M3者4例，M4者6例，M5者8例，急性淋巴细胞白血病ALL13例L1型5例L2型8例初治病人21例，复发7例，缓解13例缓解病人中2例系由初诊病人转化而来所有初诊ALL病人采用VDP长春新碱、柔红霉素、___或VDCP长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、___化疗方案诱导治疗;ANLL病人采用HA高三尖杉酯碱、阿糖胞苷或DA柔红霉素、阿糖胞苷化疗方案治疗，M3病人采用全反式维甲酸atRA或atRA与三氧化二砷As2O3合用，或以atRA为主，联合应用小剂量DA或HA方案诱导分化治疗以上所有病人的诊断及治疗均参照张之南等

[8]主编的《血液病诊断及疗效标准》选择10例健康人作为正常对照，男4例，女6例;年龄21～57岁，中位年龄

41.5岁　　

1.2标本处理　　无菌操作取EDTA抗凝的骨髓液2mL，Ficol液相对密度

1.077分离单个核细胞，细胞比例大于80%，锥虫蓝拒染率大于99%，取约6×106个细胞，用PBS液洗涤2次，加Trizol液1mL，混匀后-20℃保存，待提取RNA　　

1.3细胞总RNA提取　　按Invitrogen公司试剂盒说明书的步骤操作紫外线分光光度计测定RNA纯度A260/A280gt;

1.6，同时进行RNA定量测定在15g/L琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取RNA完整　　

1.4cDNA合成　　取RNA5μg，OLigodTprimer

0.5g/L1μL，用DEPC处理水补至12μL，于70℃下放置5min冰上骤冷后，加5×缓冲液4μL，RNA酶抑制剂20U，10mmoL/LdNTPs2μL，37℃5min后加入RevertAidMMuLV逆转录酶200U，反应体系20μL，42℃反应1h，70℃下放置10min终止反应　　

1.5PCR扩增　　

1.

5.1引物设计实验中所用引物根据GenBank提供的LivinmRNA序列Livinα___

139317.1;Livinβ___

022161.2，由__生工公司设计合成Livinα正义链5′TGTCAGTTCCT__TCCGGTCAA3′，反义链5′C__ACG__ACAAAGACGATG3′，其目的基因的长度为298bpLivinβ正义链5′TGGGAAGAACCGGAAGAC3′，反义链5′CACG__ACAAAGACGATG3′，其目的基因的长度为263bpβactin正义链5′CTGGGACGACATGGAGAAAA3′，反义链5′AAGGAAG__TGGAAGAGT__3′，目的基因长度为500bp　　

1.

5.2PCR反应PCR反应体系包括20μmol/L的Livin正、反义链引物各

0.5μL，10mmol/L的dNTPs

1.6μL，10×缓冲液2μL，TaqDNA聚合酶1U，RT产物1μL，其余以DEPC水补足至20μL预实验确定产物与循环之间呈线性关系PCR条件95℃预变性5min，1个循环;然后94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环;最后72℃延伸10min同时行βactin测定作为内参照　　

1.6PCR产物分析　　取PCR产物10μL与LoadingBuffer2μL混合，在15g/L琼脂糖凝胶中电泳，80V、25min阳性结果可见

500、298和263bp处各有一条亮带，分别为βactin、Livinα和Livinβ紫外线透射仪观察并照相，照片经MetamorphI__gingSight软件进行分析并读取吸光度值，取Livin/βactin吸光度比值进行半定量，代表mRNA表达水平各标本重复2次，取平均值　　

1.7统计学处理　　用SPSS

11.5和PPMS

1.5

[9]统计软件进行统计学处理实验数据以率和中位数四分位数间距表示，组间比较采用χ2检验、Fisher’s精确概率检验或秩和检验　　2结果　　

2.1AL细胞中LivinmRNA的表达　　41例AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率为

53.7%22/41其中ALL病人的阳性表达率为

53.8%7/13，ANLL病人阳性表达率为

53.6%15/28，二者均高于对照组的10%1/10，差异有统计学意义P=

0.

035、

0.017但ALL与ANLL比较无统计学差异ALL、ANLL病人及对照组Livin/βactin的半定量结果分别为

0.171　

0.

102、

0.

0870.

117、

0.

0100.007，ALL与ANLL病人LivinmRNA表达水平均高于对照组H=

20.22，d=

14.

25、

14.61，Plt;

0.05图1为部分病人的电泳结果　　M__rker;

①、

②同一初治病人Livinα、β;

③、

④同一缓解病人Livinα、β;

⑤、

⑥同一复发病人Livinα、β;

⑦、

⑧正常对照　　图1不同阶段白血病病人LivinmRNA的表达　　

2.2AL病人不同时期LivinmRNA的表达　　初治组和复发组病人Livin阳性表达率分别为

52.4%11/

21、

85.7%6/7，均高于对照组P=

0.

025、

0.004缓解组病人Livin阳性表达率为

15.4%2/13，明显低于初治组和复发组病人P=

0.

004、

0.030，缓解组与对照组相比差异无统计学意义　　

2.3LivinmRNA表达与外周血白细胞计数关系　　将初治白血病病人按白细胞计数分为两组，白细胞计数≥50×109/L的白血病病人LivinmRNA阳性表达率

77.8%，7/9，明显高于白细胞计数lt;50×109/L的病人

25.0%，3/12P=

0.022;两组Livin/βactin半定量结果分别为

0.

0860.3__、

0.

0380.298，前者表达水平也明显高于后者T=

6.50，Plt;

0.05　　3讨论　　IAPs家族已发现8个成员，是__于Bcl2的抗凋亡蛋白IAPs的抗凋亡作用主要通过抑制凋亡蛋白酶的活性而实现　　Livin是LIN等

[6]根据IAPs同源序列，采用含有BIR序列的EST克隆，在人胚肾cDNA文库中发现的一个IAPs家族的新成员2001年ASHHAB等

[5]明确了Livin存在2个不同的异构体Livinα和Livinβ，分别由298和280个氨基酸组成基因定位于染色体20q

13.3Livin主要存在于细胞质中[56]Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Caspases结合，抑制Caspases3/7和Caspases9的活性，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用

[6]有研究报道Livin还可能通过分解__ac，阻止其对XIAP的拮抗作用，从而间接抑制Caspase来调控凋亡

[10]由于Livinα和Livinβ两种亚型结构上的差异，体外研究发现它们表现出不同的抗凋亡活性，虽然两者都能阻断TNFα与抗CD95抗体所诱导的细胞凋亡，但在阻断依托泊甙等降解DNA的抗癌药物所诱导的细胞凋亡中，Livinβ比Livinα有更强的阻断能力[1113]　　Livin在胎儿发育过程中的多种__高表达，在正常__的大多数终末__中除胎盘低表达或不表达[45]，而在如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤__中高表达[1112]　　ABE等

[13]的研究显示，Livin在骨髓增生异常综合征MDS及初治急性髓系白血病AML中表达均明显高于正常对照组，提示Livin在初治白血病中可抑制凋亡本文结果表明，大部分AL病人表达LivinmRNA，而且LivinmRNA表达阳性率和表达水平在AL病人中均明显高于正常对照组，认为Livin的异常高表达与AL的发病有密切关系，与有关文献报道一致

[13]本研究还对不同类型AL进行分析，结果显示ALL和ANLL中LivinmRNA的表达均高于正常对照组，各个亚型之间并无明显差异，推测LivinmRNA的过表达有可能是各类AL的共同发病机制本文结果还显示，初治及复发白血病病人LivinmRNA表达率高于对照组，而缓解组与对照组无差别，说明Livin表达在AL细胞的增殖分化和或抗凋亡过程中发挥了重要作用本研究还显示，Livin的表达水平在外周血白细胞数≥50×109/L的病人中高表达，而外周血白细胞数升高是AL预后不良的重要因素因此，Livin可以作为判断预后的重要指标之一Livin的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素，具体作用机制有待于进一步研究　　有研究结果显示，Livin过表达是白血病细胞耐药的根本原因

[14]本文结果也显示，LivinmRNA在初治AL病人表达率明显高于正常对照组，治疗缓解后其表达率明显下降，复发后表达率又再次升高，其原因可能与Livin高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降有关目前已有研究结果显示，采用RNA干扰技术对Livin基因表达进行干预后，细胞对诱导凋亡的药物和射线的敏感性增加

[11]由此可见，Livin基因有可能成为白血病治疗的一个潜在靶点【____】　

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