羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达

羊膜培养液体外抑制兔角膜上皮细胞血管内皮生长因子的表达【摘要】　　目的探讨羊膜培养液对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactorVEGF）表达的影响方法刮除并收集新鲜兔角膜上皮细胞，传代培养接种于35mm培养皿及自制的羊膜培养皿上实验分为4组，Ⅰ组对照组无血清的DMEM培养液，Ⅱ组去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组将细胞直接接种于无上皮羊膜作用48h后用Trizol法提取各组样本的总RNA进行RTPCR一步法反应检测各组VEGFmRNA表达并与βactin比较结果正常角膜上皮细胞中有VEGF基因表达，在Ⅲ，Ⅳ组中表达受到明显抑制（P＜

0.01，n=5）结论羊膜培养液明显抑制VEGFmRNA在角膜上皮细胞中的表达【关键词】羊膜；角膜新生血管；血管内皮生长因子；角膜上皮细胞　　Abstract　AIM:Todetectthesuppressioneffectsofculturesupernatantofhu__namnioticmembraneontheexpressionofvascularendothelialgrowthfactorVEGFinrabbitcornealepithelialR____lls.METHODS:Thenor__lR____llswereculturedfor7daysuntiltherewereconfluen__sonthecultures.The__llsweresubculturedtoplastic3groupsⅠⅢⅠwascontrolandnakedamnioticmembraneⅣgroupculturesrespectively.ThenoneofplasticgroupⅡgroupwasculturedbyculturesupernatantofhu__namnioticmembranewithoutepitheliallayerasitsmedium;anotherplasticgroupⅢgroupwasculturedbyculturesupernatantofhu__namnioticmembranewithepitheliallayerasitsmedium;theothertwogroupsⅠandⅣgroupwerestillculturedbyDMEMfreefromFBScomponents.After48hoursthetotalRNAsofthesecultureswereextractedanddetectedbyRTPCR.RESULTS:TherewereexpressionsofVEGFmRNAfromⅠgroupandⅡgrouphowevertheexpressionsweresignificantlysuppressedinⅢgroupusingculturesupernatantofhu__namnioticmembranewithepitheliallayerasitsmediumandⅣgroupR__cultereddirectlyonnakedamnioticmembrane（P＜

0.01n=5）.CONCLUSION:AmnioticmembranetransplantationispartlythroughdepressingthemRNAexpressionofVEGFincorneal__llstoredu__thecornealneovascularizationofinjuriedcornealsu_____.Andit__ybeanefficientmethodofcuringcornealneovascularizationinclinic.　　KEYWORDS:amnioticmembrane;cornealneovascularization;vascularendothelialgrowthfactor;cornealepithelial__ll　　0　引言　　正常的角膜无血管，角膜新生血管（cornealneovascularizationCNV）常由损伤及各种炎症__诱导产生严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；随着新生血管的长入，角膜的免疫赦免地位丧失虽然目前有多种方法用于治疗角膜新生血管，但均未获得满意疗效临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用

[1]，虽然已知羊膜的细胞外基质及可溶性细胞因子可能参与这一作用机制

[23]，然而具体作用机制仍不明最近研究表明，羊膜培养液可明显地抑制角膜新生血管化

[4]，为进一步理解这一作用机制，我们应用可能释放多种细胞因子的羊膜培养液，对角膜上皮细胞中血管内皮细胞生长因子（VEGF）表达的影响进行研究　　1　材料和方法　　

1.1　材料　　羊膜取自于健康剖腹产孕妇的胎盘，无菌条件下钝性剥离羊膜，用含有抗生素的PBS液（1×105U/L青链霉素）清洗羊膜3次，将羊膜上皮面向上贴附于无菌的醋酸纤维素膜上，放入15cm的玻璃培养皿中加入DMEM培养基+甘油（V/V，1∶1）混合液，80℃低温冰箱冷冻保存使用时，将羊膜置于室温解冻PBS液水化30min，用

2.5g/L胰蛋白酶+

0.2g/LEDTA混合液在37℃消化30min，用细胞刮刀轻轻刮除羊膜的上皮层后，用PBS液漂洗3次，剪成4cm×4cm大小备用将35mm培养皿的底钻掉，消毒后备用将剪好的去掉上皮的羊膜的基底面向上，包于35mm培养皿上用手术缝线固定将羊膜为底的培养皿置于60mm培养皿中，加入少量DMEM培养基（含有150mL/L胎牛血清），于CO2细胞培养恒温箱中过夜取经无菌处理的新鲜羊膜，用

2.5g/L胰蛋白酶+

0.2g/LEDTA混合液在37℃消化30min以细胞刮刀将羊膜的上皮层细胞成分刮掉，将去上皮成分的4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中作用48h后取其上清液待用取经无菌处理的新鲜羊膜，保留其上皮层，将4cm×4cm大小羊膜3块浸泡于制备好的无血清DMEM细胞培养基30mL中作用48h后取其上清液待用　　

1.2　方法　　兔处死后，立即将眼球取出，共30眼用加有双抗的生理盐水漂洗3次，用剪刀取下透明的角膜部分，浸于生理盐水中，漂洗1次用手术刀片去掉角膜的内皮层，其余__上皮面向上移入

7.5cm玻璃平皿中，加入

2.5g/L胰蛋白酶+

0.2g/LEDTA的混合液，37℃下消化25min后，用刀片将角膜的上皮层轻轻刮下，离心收集上皮细胞接种到25mL培养瓶中，以含150mL/LFBS的DMEM培养基培养，2～3d换液1次培养7d致形成融合性生长，用

2.5g/L胰蛋白酶+

0.2g/LEDTA的混合液消化后，分别传代接种于35mm培养皿和单纯去上皮羊膜为底物的培养皿组用含150mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养传代细胞形成70%融合性生长后，将各组中的培养液换为无血清的DMEM培养液继续培养12h以去除其它活性成分的影响实验分为4组，即Ⅰ组对照组无血清的DMEM培养液，Ⅱ组去上皮的羊膜培养液，Ⅲ组未去上皮的羊膜培养液，Ⅳ组将细胞直接接种于无上皮羊膜每组设5个平行孔12h后，接种于35mm培养皿的Ⅱ组中加入去上皮的羊膜培养上清液作为培养液向Ⅲ组中加入未去上皮的羊膜培养上清液作为培养液，其余2组仍用无血清的DMEM培养基培养，培养48h后，去除各样本中的多余培养液，并向每个35mm培养皿样品中加入Trizol提取液1mL，最终RNA沉淀物加入DEPC水20μL充分溶解，80℃冷冻保存PCR引物由TaKaRa宝生物工程大连有限公司设计并合成用灭菌水配成20μmol/L的溶液4℃保存引物序列VEGF130bp，SenseTATTCAA__CTTCCT__GTG，AntisenseTGAGGTTTGATCC__AT；βactin320bpSense__TGTCCCTGTAC__CTCTG，AntisenseT__CGATGGTGATGACCTGG，将RTPCR反应产物各取5μL，加样于20g/L浓度的琼脂糖凝胶中进行电泳，80V电压下电泳35min照相记录结果经扫描通过QuantiScan分析软件处理，以内参照βactin为基准分析计算各条带的相对含量（图1）　　2　结果　　正常角膜上皮细胞有VEGFmRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析结果显示VEGFmRNA在无血清的DMEM培养基培养组（Ⅰ组）和去上皮的羊膜培养液组（Ⅱ组）中均有表达，在以未去上皮的羊膜培养液组（Ⅲ组）及单纯去上皮羊膜底物培养皿接种组（Ⅳ组）中表达均受到了明显的抑制（P＜

0.01，n=5）　　3　讨论　　角膜新生血管（neovascularizationNV）常由损伤、炎症、感染、多次角膜眼表手术及各种病理原因所致，这包括各种热化学烧伤及各种炎症__随着眼表重建术的广泛开展，一些严重结角膜疾病所致眼表损伤后的角膜新生血管，已经逐渐成为困扰人们的主要问题新生血管的形成，为创面的愈合提供了有利的条件，然而大量的新生血管在损伤愈合后，会使角膜失去其特有的光学特性，严重的角膜新生血管化会导致视力下降甚至视力丧失；新生血管的长入使角膜失去相对免疫赦免地位，增加了角膜移植手术排斥反应的发生几率目前虽有多种治疗方法，但效果均不理想因而寻找简单、有效的治疗方法，是目前眼科面临的课题之一临床上羊膜角膜移植及羊膜移植眼表重建，均显示其有抑制角膜新生血管的作用

[1]，然而具体作用机制仍不十分明确最近，我们的研究表明

[4]，培养羊膜的上清液可明显地抑制角膜新生血管化，并观察到其可能通过抑制血管内皮细胞的生长和迁徙来抑制角膜新生血管形成另外，Tseng等

[5]的一项研究显示，羊膜基质可以抑制角膜和角膜缘成纤维细胞中TGF家族及其受体的表达，提示羊膜可以调控培养于其上角膜细胞的基因表达与行为我们对体外培养的角膜上皮细胞研究发现，血管活化因子VEGF在正常角膜上皮细胞中均有表达，提示兔角膜上皮细胞可能参与了角膜新生血管的形成或调控血管内皮细胞生长因子VEGF可__多种血管内皮细胞的生长、增殖、迁徙移行，并__血管基质细胞分泌细胞外基质，__新生血管增生

[6]参与调控多种新生血管形成与增殖，如角膜新生血管化、视网膜下新生血管化的形成及在各种肿瘤的新生血管化的形成中均起着非常重要的作用其在活跃的新生血管__及器官，活性也明显增强在临床中，Tseng等

[5]提倡使用保存的羊膜作为移植物，保存的羊膜上的上皮细胞经过反复处理其所具有的作用会大大下降，而临床羊膜移植物一般自然溶解可能需要2wk左右这样一段时间，羊膜细胞中产生的那些抗炎抗血管形成的物质会被消耗掉但据临床观察，用保存的羊膜进行移植一样也可获得较好的疗效为了说明这种现象，我们设计了Ⅳ组，即将兔角膜上皮细胞直接培养在去掉上皮层的羊膜上羊膜已冷冻保存6mo，考察其对角膜上皮细胞中VEGFmRNA表达影响我们发现其与前几组比较，VEGF的表达则受到了明显的抑制这可能与羊膜基底膜和致密层的生物学特性有很大关系羊膜的基底膜主要由Ⅳ型胶原，Ⅶ型胶原和层粘连蛋白组成虽然基底膜中Ⅳ型胶原的α2链与结膜基底膜相同，而无角膜上皮基底膜中Ⅳ型胶原的α5链，但层粘连蛋白1，层粘连蛋白5，纤维连接蛋白和Ⅶ型胶原的成分与角膜基质中的成分是相同的

[2]因此，羊膜的基底膜提供了一个远比其它媒介物质更接近正常眼表成分的微环境，这不但可以促进角膜上皮的生长，而且基底膜中的细胞外基质成分具有抗新生血管形成及抗炎的作用，这也可能是___Ⅳ组的角膜上皮细胞中VEGF的表达受到明显抑制的原因　　由于羊膜细胞（尤其是羊膜上皮细胞）能够产生大量的生长因子及抗炎、抗血管生成因子成分，具有抗炎、抗新生血管的作用，因此，我们建议可以在羊膜移植中尽量保留其上皮细胞成分，也许这更有利于羊膜移植后的眼表功能重建另外，羊膜培养液对角膜新生血管的抑制作用可能为目前眼科临床提供一种简单，有效的治疗方法【____】　　1　TsengSCGPrabhasawatPBartonKetal.Amnioticmembranetransplantationwithorwithoutlimbalallograftsforcornealsu_____reconstructioninpatientswithlimbalstem__lldeficiency.ArchOphthalmol1998;116

（4）:431441　　2　FukudaKChika__TNakamuraMetal.DifferentialdistributionofsubchainsofthebasementmembranecomponentstypeIVcollagenandlamininamongtheamnioticmembranecorneaandconjunctiva.Cornea1999;181:7379　　3　HaoY__DHHwangDGetal.Identificationofantiangiogenicandantiinflam__toryproteinsinhu__namnioticmembrane.Cornea2000;193:348352　　4　马翔HaydeeBazan李军.羊膜培养液抑制角膜新生血管的实验研究.中华眼科__2003;3912:753756　　5　TsengSCLiDQ__X.SuppressionoftransforminggrowthfactorbetaisoformsTGFre__ptortypeIIandmyofibroblastdifferentiationinculturedhu__ncornealandlimbalfibroblastsbyamnioticmembrane__trix.J__llPhysiol1999;1793:325335　　6　A__noSRohanRKurokiMetal.Requirementforvascularendothelialgrowthfactorinwoundandinflam__tionrelatedcornealneovascularization.InvestOphthalmolVisSci1998;391:1822。