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贵阳腐霉类枯草菌素蛋白酶基因的原核表达【摘要】目的实现贵阳腐霉PythiumguiyangenseSu类枯草菌素蛋白酶subtilisin-likeproteasePr1基因在大肠杆菌中的活性表达,验证已获得的基因序列YP1977是否属于subtilisin-likeprotease基因家族成员方法1提取贵阳腐霉总RNA,以已获得的序列YP1977为模版设计引物,利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增Pr1基因ORF片段;2构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白基因ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,转化表达菌株E.coliER2566,IPTG诱导菌株表达Pr1蛋白酶结果成功构建含有Pr1基因ORF序列、绿色荧光蛋白ORF序列的重组质粒pTWIN1-Pr1-EGFP,实现了Pr1基因在大肠杆菌中的活性表达结论证明已获得的DNA序列是贵阳腐霉的一个Pr1基因的编码区【关键词】灭蚊;枯草杆菌蛋白酶类;逆转录聚合酶链反应;基因,真菌;贵阳腐霉;类枯草菌素蛋白酶;原核表达[Abstract]O__ective:ToverifyifaDNAfragmentweobtainedfromPythiumguiyangenseSubeforeistheORFofasubtilisin-likeproteasePr1ofP.guiyangenseafungalpathogenofmosquitoes.Methods:Aprokaryoticexpressionsystemwasestablished:ThetotalRNAofP.guiyangensewasextractedatthetimepointofmostabundantexpressionofPr1andcDNAwasobtainedwithreversetranscriptionPCR.Thesu__ectsequen__wascloned.Apla__idpTWIN1-Pr1-EGFPcontainingthesequen__aswellasanEGFPgenewasconstructedandtransformedintoER2566__lls.ThegeneexpressionwasobservedafterIPTGinduction.Results:Greenfluores__n__proteinexpressedandPr1activityincreasedinER2566__llsafterthetransfor__tion.Conclusions:ItsprovedthattheDNAfragmentisreallyORFofaPr1geneofP.guiyangenseandthatthemethodforverificationofclonedgeneisefficient.[Keywords]mosguitocontrol;subtilisins;reversetranscriptasepolymerasechainreaction;genesfungal;PythiumguiyangenseSu;subtilisin-likeprotease;prokaryoticexpression贵阳腐霉PythiumguiyangenseSu是由贵阳医学院苏晓庆教授分离得到的一株具有自主知识产权的可以高效地、特异地杀灭蚊幼虫的水生丝状真菌,可以有效切断经蚊虫传播疾病的途径[1]通过研究发现,与其它昆虫病原真菌一样,P.guiyangense菌株在侵染孑孓体壁过程中也会分泌蛋白酶(Pr
1、Pr2蛋白酶)、几丁质酶和脂酶等水解酶尤其是Pr1蛋白酶能降解昆虫体壁,在贵阳腐霉侵入孑孓体内过程中应该起重要作用,是贵阳腐霉等昆虫病原菌重要的毒力因子[2]为了采用基因工程培育贵阳腐霉优良菌株,对该菌的胞外蛋白酶进行研究,并于2004年克隆了一长1519bp的疑是Pr1蛋白酶的DN__段YP1977,为了进行验证,构建了Pr1-EGFP融合基因,再将该融合基因转化大肠杆菌,对其中Pr1蛋白酶的表达进行观察1材料与方法
1.1菌株与质粒贵阳腐霉由贵阳医学院生物防治课题组保存E.coliER
2566、pTWIN1购自NEB公司
1.2YP1977片段的引物合成根据软件预测分析已获得的基因片段YP1977,确定其含有一个可能的ORF阅读框,以此阅读框为模板,使用软件PrimerPremier
5.0设计引物SL15′-CC__TCGAGGACCCATTCCGAAAGTCCAAGA-3′和SL2(5′-CGGGATCCTACAACCGTCCTCCTAACAC-3′),在上游引物SL1的5’端加上了保护碱基CCG和XhoⅠ酶切位点序列,在下游引物SL2的5’端加上了保护碱基CG和BamHⅠ的酶切位点序列由__生工生物技术有限公司合成
1.3总RNA的提取 参照Chomczynski[3]等方法修改后提取RNA,分别提取诱导了24h、36h、48h、60h的贵阳腐霉菌丝体RNA,等量混合备用
1.4RT-PCR扩增Pr1基因ORF片段 根据RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒说明书操作合成cDNA第一链,以贵阳腐霉基因组cDNA为模板,使用上述引物SL1和SL2进行PCR扩增反应程序为95℃变性,5min;35轮循环(94℃,45s;59℃,1min;72℃,1min;72℃延伸,10min;4℃保存
1.5绿色荧光蛋白基因(EGFP)ORF序列的克隆以质粒pEGFP-C1为模板,根据GenBank中已知的绿色荧光蛋白(EGFP)编码基因的序列,设计一对引物P1(5′-A__ATATGGTGA__AAGG__GAG-3′)和P2(5′-CC__TCGAGTGACTTGTACA__TCGTC-3′),在上游引物P1的5’端加上了保护碱基AG和NdeⅠ酶切位点序列,在下游引物P2的5’端加上了保护碱基CCG和XhoⅠ的酶切位点序列PCR扩增,
1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,回收试剂盒、目的条带该片段以XhoⅠ和NdeⅠ双酶切后连接到质粒pTWIN1上
1.6重组表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP的构建 PCR产物纯化试剂盒回收RT-PCR产物OPr1片段,BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收后的片段,与经过相同酶切的大肠杆菌绿色荧光表达载体pTWIN1-EGFP连接,构建表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP见图
11.7转化大肠杆菌采用常规技术活化E.coliER2566,制备其__态细胞,并将重组质粒转入该__态细胞[4,5]
1.8Pr1基因在大肠杆菌中表达后的活性检测 参照Kim[6]等人的方法,挑取重组表达质粒阳性克隆接种于含有100mg/LAmp的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜,
1.0%接种量转接于等体积含有100mg/LAmp的LB液体培养基中,37℃振荡培养至OD600达到
0.5~
0.7加入IPTG(终浓度为1mol/L)诱导Pr1基因的表达,30℃振荡培养1~4h收集菌体,超声波破碎细胞(80W、工作8s,15个循环),取上清液,用专一性底物[Suc-Ala2-Pro-Phe-PNA]检测Pr1蛋白酶活性,并进行SDS-PAGE检测蛋白产物所有实验皆以未转化的E.coliER2566作对照,其中对Pr1蛋白酶活性检测的OD值进行t检验2结果
2.1贵阳腐霉总RNA的提取根据贵阳腐霉产Pr1蛋白酶曲线,收获诱导培养了24h、36h、48h和60h的贵阳腐霉菌丝体,提取其RNA,等量混合-70℃备用本实验提取的RNA用紫外分光光度计测得OD260/OD280=
1.91,符合RNA纯度的要求,RNA电泳结果如图2所示28SrRNA/18SrRNA比例约为2/1,带清晰,满足RNA完整性的要求因此,该总RNA符合反转录合成cDNA的要求
2.2RT-PCR扩增Pr1基因ORF片段 利用引物SL1和SL2,以Pr1基因的cDNA链为模板,PCR产物OPr1大小约1000bp(图3),符合预期要求
2.3RT-PCR扩增产物OPr1测序结果BLAST比对等序列分析结果显示,本次RT-PCR扩增产物OPr1的核苷酸序列和已知序列YP1977中预测的ORF序列是一致的,含有334个氨基酸,并有起始__子和终止__子,是一个完整的蛋白读码框更重要的是含有组氨酸残基(His)和丝氨酸残基(Ser)2个活性位点,这2个活性位点是分解昆虫表皮蛋白的重要活性中心
2.4重组表达质粒pTWIN1-Pr1-EGFP的筛选、鉴定经过蓝白斑初筛选后,挑取白斑单菌落,过夜活化后,提取质粒pTWIN1-Pr1-EGFP以此质粒为模板,SL1和SL2为引物,PCR扩增含有Pr1基因ORF序列的DN__段,电泳检测PCR产物,PCR产物大小约1000bp(图4)
2.5融合基因Pr1-EGFP在大肠杆菌中的活性表达
(1)诱导表达的菌株在离心管中,经长波紫外线(300__)照射后,肉眼可见明亮的绿色荧光,见图5所示;
(2)挑选重组质粒pTWIN-Pr1-EGFP转化E.coliER2566的8个阳性转化菌落,参照St.Leger等[7]的方法,利用特异性短肽底物在其中检测出远高于未转化菌株的Pr1蛋白酶活性(表1);
(3)SDS-PAGE电泳图谱上约60kDa处出现清晰的诱导表达条带,其中,EGFP融合蛋白分子量约27kDa,Pr1分子量约33kDa,与预期的相符,如图6所示表1表达菌株E.coilER2566中Pr1蛋白酶活性OD410__·min-1·ml-1 3讨论Prl蛋白酶属于枯草杆菌类蛋白酶家族subtilisinfamily,广泛存在于昆虫病原真菌中它由病原真菌在昆虫表皮形成的附着胞分泌,能降解昆虫体壁,是帮助病原真菌入侵昆虫宿主的重要蛋白酶之一St.Leger[7]等发现,Pr1蛋白酶是昆虫致病的决定因素,并通过金龟子绿僵菌转化该菌导致Pr1a基因的高效表达,使转化后的金龟子绿僵菌毒力明显提高,杀虫时间缩短了25%,作物损失减少了40%同时,他们还证明了在昆虫血淋巴中高浓度的Pr1a蛋白酶会引起昆虫酚氧化酶的过度表达,成为导致昆虫死亡的第2个原因[8]因此,Pr1蛋白酶基因被用作昆虫病原真菌基因工程改良的突破口该酶及其基因成为国内外研究的焦点[9~11]本实验选择技术较成熟的大肠杆菌表达系统从3个方面验证了它就是贵阳腐霉的一个Pr1蛋白酶基因的编码区[12]
(1)使用NEB公司的pTWIN1表达系统,并且选用EGFP作为标记基因,融合在Pr1基因的N端,构建成Pr1-EGFP融合基因诱导表达后的菌株,不经紫外线照射,肉眼即可看到离心沉淀后的菌株呈现淡淡的绿色,在紫外线(300__)照射下,可看到明亮绿色荧光,标志着Pr1-EGFP融合基因的成功表达
(2)对转化的大肠杆菌中的Pr1蛋白酶活性进行了检测分别挑取8个阳性单菌落,诱导表达后,超声波破碎,取上清液利用专一性短肽底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA测定Pr1蛋白酶活性经统计学分析证明,转化菌株的1蛋白酶活性远高于未转化的对照菌株
(3)采用SDS-PAGE电泳,进一步确认Pr1蛋白酶的表达已知EGFP融合蛋白分子量约27kD,Pr1分子量约33kD,二者分子量总和应为60kD从电泳图看出,表达菌株诱导
1.5h后在60kD附近就有Pr1-EGFP融合蛋白分子带当诱导4h后,该蛋白的表达量进一步增多电泳结果与预期的相符上述结果说明OPr1在大肠杆菌中成功表达Pr1蛋白酶,证明所获取的片段OPr1是Pr1蛋白酶基因的编码区,这就为采用该基因转化贵阳腐霉,使其超表达提高该菌毒力打下基础【____】
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