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重症急性胰腺炎大鼠HMGB1表达与肠黏膜屏障损害的关系__栾正刚 张成 葛春林 马晓春 郭仁宣【摘要】目的观察大鼠重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitisSAP)时肠__中高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox-1proteinHMGB1)表达的变化及其与肠黏膜屏障损害的关系方法48只Wistar大鼠随机分为正常对照组(n=8)和SAP组(n=40)正常对照组麻醉后取材,SAP组分别于建模后
3、
6、
12、24和48h取材测定血浆D-乳酸、肠__髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平,应用RT-PCR方法检测SAP大鼠肠__中高迁移率族蛋白B1mRNA表达的变化,应用westernblot法检测SAP大鼠肠__中HMGB1水平的变化结果随着SAP病情进展,血浆D-乳酸与肠__MPO水平在24h达最高值,分别为(
16.41±
4.65)μg/mL和(
26.76±
3.63)U/g(Plt;
0.01)SAP6h时大鼠肠__HMGB1mRNA及HMGB1表达水平显著高于对照组,并于24h达峰值且持续至48h(Plt;
0.01)结论SAP大鼠肠__中HMGB1表达延迟且持续增高HMGB1作为晚期炎症介质参与了SAP大鼠肠黏膜屏障损伤的病理生理过程【关键词】重症急性胰腺炎·肠屏障·高迁移率族蛋白B1Relationshipbetweenhighmobilitygroupbox-1proteinexpressionandgutmucosalbarrierdysfunctionduringsevereacutepancreatitis【ABSTRACT】O__ective:Toinvestigatetherelationshipbetweenhighmobilitygroupbox-1protein(HMGB1)expressionandgutmucosalbarrierdysfunctionduringmurinesevereacutepancreatitis(SAP).Methods:Forty-eight__lehealth_____WistarratsweredividedrandomlyintoControlgroupandSAPgroups.Thecon__ntrationofpla__aD-lactateandtheactivityofmyeloperoxidase(MPO)intheintestinaltissueweredetermined.TheexpressionofHMGB1mRNAinintestinalmucosawasdetectedbyreversetranscriptionpolymerasechainreaction(RT-PCR)andtheactivityofHMGB1wasdeterminedbyWesternblot.Results:Pla__aD-lactateandMPOreachedapeaklevelat24h(
16.41±
4.65)μg/mLforPla__aD-lactateand(
26.76±
3.63)U/gforMPOrespectively(Plt;
0.01).ElevationofHMGB1andHMGB1mRNAexpressioninintestinalmucosawasfoundat6hourafterSAPHMGB1andHMGB1mRNAexpressionpeakedat24hoursandkeptrelativehighvaluesupto48hourcomparedwithnor__lcontrolgroup(Plt;
0.01).Conclusion:TheriseofHMGB1expressionmightplayanimportantroleintheintestinalmucosalbarrierinjuriesinSAP.HMGB1asalatemediatorwasinvolvedinthepathogenesisofSAP.【KEYWORDS】Severeacutepancreatitis·Intestinalmucosalbarrier·Highmobilitygroupbox-1protein 重症急性胰腺炎(severeacutepancreatitisSAP)发病凶险、并发症多、病死率高,是临床上常见的危急重症SAP时继发肠道屏障功能衰竭,肠腔内细菌及毒素可移位至胰腺和其他脏器,其中胰腺和胰周感染是SAP的主要死因[1-2]有研究表明,高迁移率族蛋白B1(highmobilitygroupbox-1protein,HMGB1)作为一种重要的晚期炎症介质,在炎症反应过程中表达升高较晚,维持时间较长,参与了感染性休克及多器官功能障碍综合征(multipleorgandysfunctionsyndromeMODS)的发生、发展过程[3]本研究通过观察大鼠SAP模型肠__内HMGB1的变化,研究其与肠黏膜屏障损害的关系,旨在从新的角度探讨SAP肠黏膜屏障损害的发生机制1 材料与方法
1.1 动物分组与SAP模型制备 健康雄性Wistar大鼠48只,体重270~330g,由中国医科大学实验动物学部提供随机分成6组,取其中1组为正常对照组,另外5组分别为SAP建模后
3、
6、
12、24和48h组大鼠术前12h禁食不禁饮2%戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉(1mL/kg),常规消毒后,腹部正中切口入腹腔,找到胆胰管,于其出肝门端以动脉夹暂时夹闭胆管,以5号针头注射器逆行刺入胆胰管内,于胆胰管入十二指肠端用小动脉夹暂时夹闭胆胰管,以
0.1mL/min速度匀速注入5%牛磺胆酸钠(
1.5mL/kg,Sig__公司产品),注射完毕后10min去除动脉夹,逐层关腹术后禁食,自由饮水,皮下注射生理盐水40mL/(kg·6h),行液体复苏正常对照组麻醉后取距回肠末端10cm左右小肠__,SAP组分别于建模后
3、
6、
12、24和48h取材部位同对照组腹主动脉采血,离心(3000r/min×15min)分离血浆,-80℃冻存待测无菌采取__,液氮速冻,-70℃贮存备用
1.2 观察指标
1.
2.1 小肠髓过氧化物酶活性测定 取待测__100mg加
0.5%HTAB2mL制备匀浆,超声粉碎(10s,3次)亚细胞成分,0~4℃40000r/min离心15min,取上清
0.1mL加反应液
2.9mL,保持温度25℃,立即于分光光度计460__波长下进行扫描,时长120s以第30s到第90s的吸光度的变化代表酶活力的改变1单位小肠髓过氧化物酶(myeloperoxidaseMPO)活力以25℃时分解1μmolH2O2来表示所有操作均在水浴中进行
1.
2.2 血浆D-乳酸水平测定 将血浆标本
0.6mL+50μL高氯酸,漩涡混匀,3000r/min离心10min,留取上清液
0.5mL加30μL
5.8mol/LKOH,混匀,3000r/min离心10min,除去高氯酸钾沉淀,留取上清液
0.4mL,分成2管(空白管和样品测定管),各
0.2mL每管加pH
9.5甘氨酸硫肼溶液(含2mg/mL的NAD+)
0.9mL;样品测定管加50μLD-LDH,空白管加50μL水,置37℃水浴90min;空白管调零后,在340__处测定样品测定管吸光度值[4]根据标准管吸光度值(标准品购于Sig__公司),计算各样品D-乳酸浓度
1.
2.3 肠__HMGB1水平检测 采用westernblot法检测取200mg肠__研磨粉碎后,加入1000μL新鲜配置的冷蛋白裂解液(50mmol/LTris-HClpH
7.
5、150mmol/LNaCl2mmol/LEDTA1%SDS),经4℃,12000r/min离心20min,取上清液,考马斯亮蓝法进行蛋白定量取40μg蛋白与上样缓冲液混合,煮沸5min,SDS-PAGE电泳分离样品后电转移至PVDF膜5%脱脂奶粉封闭过夜,加入1:400羊抗HMGB1抗体(SantaCruz)4℃孵育过夜后,加入二抗37℃孵育1h,显色采用凝胶成像分析系统(GDS-8000)测定各条带的吸光度值,以此代表蛋白的表达量
1.
2.4 肠__HMGB1mRNA的表达 取小肠__80mg,以异硫氰酸胍一步法提取细胞总RNA(TaKaRa公司试剂盒)用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术对转录产物进行扩增以三磷酸甘油醛脱氢酶(gly__raldehydes3phosphatedehydrogehaseGAPDH)作为内参对照以目的基因与内参对照的比值为基因表达的相对含量扩增产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳后照相大鼠HMGB1序列[5](扩增片段为680bp):5′-ATGG__AAAGGAGATCCTA-3′(正义链);5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3′(反义链)大鼠GAPDH序列[6](扩增片段为309bp):5′-TCCCTCAAGATTGTCA__AA-3′(正义链);5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′(反义链)
1.3 统计学处理 数据均以x±s表示,SPSS
10.0统计分析软件进行处理,采用单因素方差分析和q检验,P≤
0.05为差异有统计学意义2 结果
2.1 血浆D-乳酸水平变化 SAP3h时血浆D-乳酸水平较正常对照组上升不明显;在SAP建模后6h时血浆D-乳酸水平(
9.72±
3.26)μg/mL,与正常对照组(
3.94±
1.51)μg/mL比较,明显上升,Plt;
0.01;SAP24h时达最高值(
16.41±
4.65)μg/mL,48h时仍显著高于对照组(表1)
2.2 肠__MPO活性变化 正常对照组大鼠肠__MPO活性较低,SAP6和12h时其活性均显著高于正常对照组(Plt;
0.01)SAP大鼠肠__MPO活性于24h时达最高值,并持续至48h(见表1)
2.3 肠__HMGB1水平的变化 正常情况下大鼠肠__中有少量的HMGB1表达与正常对照组相比,SAP组肠__中可见HMGB1表达增高SAP6h肠__中HMGB1表达明显增高,12h呈现进一步升高趋势,24~48h维持在较高水平(见表
1、图1)
2.4 大鼠肠__HMGB1mRNA表达变化 正常情况下大鼠肠__有较低的HMGB1mRNA表达,与正常对照组比较,SAP6h和12h肠__中HMGB1mRNA表达增高,SAP24h时肠__HMGB1mRNA表达明显增高并持续至48h(见表
1、图2)3 讨论 SAP时肠黏膜屏障功能受到损害,导致细菌和内毒素的移位,从而引发肠源性感染和内毒素血症,严重时可促使多器官功能衰竭发生[7]Ammori等[8]发现SAP患者肠黏膜通透性明显增加SAP时肠黏膜屏障受到损害,主要通过肠系膜淋巴结—胸导管—体循环途径发生细菌及内毒素移位,细菌移位至胰腺可导致胰腺坏死__继发感染,进入血循环可进一步__活化单核巨噬细胞,释放更多的细胞因子和炎性介质,从而发生全身炎性反应综合征,进一步诱发MODS,最终导致死亡HMGB1较TNF-α、IL-1β等早期炎症介质分泌延迟且持续时间较长故被称作“晚期”炎症介质[5,9]HMGB1为细胞核内非组蛋白在创伤应激或严重感染、脓毒症等病理情况下可大量表达并分泌至胞外参与了脏器损伤过程[10-11] 本研究结果显示,SAP建模后6~12h,大鼠肠__中HMGB1表达才明显增高,于SAP建模后24h,大鼠肠__中HMGB1水平达峰值并持续至48h有资料表明HMGB1呈时间-剂量依赖性增加肠上皮通透性[12],而这必将加剧肠源性细菌与内毒素移位在SAP大鼠肠__HMGB1延迟并持续增高的同时,反映肠__炎症细胞浸润程度的MPO活性亦显著的升高,说明SAP大鼠肠__中有大量中性粒细胞浸润和过量的活性氧自由基生成当肠道屏障通透性增加,肠道中细菌产生的D-乳酸可吸收入血,因而血中D-乳酸水平升高可反映肠黏膜损伤程度和通透性的改变本研究结果显示,随着HMGB1表达的升高,SAP大鼠血浆D-乳酸水平持续升高,提示肠黏膜通透性持续增加因此,我们推测SAP时,大鼠肠__HMGB1表达上调在肠黏膜损伤中具有重要意义SAP时TNF-α、IL-1β等早期炎症介质迅速合成释放,但是难以做到早期预防性治疗本研究结果显示SAP时HMGB1作为晚期炎症介质介导了肠黏膜屏障功能不全的发生与发展【____】
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