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文本内容:
2019-2020年高中生物
4.2分子生物学技术学案苏教版选修1【课标要求】尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作和应用【教学目标】
1、了解分子生物学的进展
2、本课题通过尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作,使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法,理解PCR的原理,讨论PCR的应用【教学过程】知识点
一、分子生物学进展
1、的建立,奠定了现代分子生物学的基础,给整个生物学乃至整个人类社会带来了一场革命策略一经提出,世界各国的生物科学家便立刻意识到和的重大作用和深远意义使得生物技术中的生物转化环节不断优化,高产量的微生物菌株已不在局限于通过微生物的诱变或分离获得,完全可以通过来实现原核生物、真核生物的细胞已被用于大批量生产、等外源蛋白;植物和动物也可以作为天然的,用于生产新的或改造过的基因产物,此外,还大大简化了新药的开发和检测系统
2、基因工程技术取得重大进展在生物技术方面,许多成果已经转化为生产力,目前已投入生产的有血糖酶试剂盒(糖尿病)、(肾病)、(肝炎)等多种诊断试剂盒;在农业方面,成功的培育出了具有抗病毒、、、等特性的转基因植物,并且有许多产品已经批准进行大田试种;在动物基因工程方面,已经成功培育出、、、等多种转基因动物另外,利用哺乳动物作为“”表达外源物质的研究,也取得了可喜进展实验证实,转基因动物所获得的新特性可以遗传给后代,这就意味着“”可以不断增殖得以延续,这对的发展意义十分重大知识点
二、PCR技术
(一)有关DNA的基础知识回顾
1、基本组成元素;
2、基本组成单位(由一分子、一分子、一分子组成)
3、脱氧核苷酸链的形成通过形成构成彼此连接起来形成脱氧核苷酸链
4、DNA的空间结构
①DNA分子是由两条平行的(即一条链为3’-5’,另一条链为5’-3’)脱氧核苷酸长链盘旋而成的规则双螺旋结构
②脱氧核糖与磷酸交替连结,排列在,构成基本骨架;排列在链的内侧
③两条链上的碱基通过连结起来,形成碱基对
5、DNA分子的特性稳定性、多样性、特异性
6、DNA的复制
(1)概念由一个DNA形成两个完全相同的DNA的过程;
(2)时期;
(3)场所;
(4)条件模板、原料酶、ATP;
(5)复制特点从过程上看,从结果上看;
(6)精确复制的原因一是规则的双螺旋结构为复制提供了精确的模板,二是碱基互补配对能力保证了复制准确无误的进行
(7)复制的意义DNA分子通过复制使遗传信息从亲代传给了后代,从而保持了遗传信息的连续性
(二)PCR技术
1、概念实验技术
2、原理
(1)与细胞内的DNA复制的相同之处都需要、、、四种,都需要解链和链延伸
(2)与细胞内的DNA复制的区别体内解链是靠,体外解链是靠;体内的引物是,体外的引物是;体内的DNA聚合酶需在常温下发挥功能,体外的DNA聚合酶耐
3、结果使原来的DNA按进行扩增
4、特点对DNA的扩增快速、简便和专一
5、PCR的先决条件待扩增的DNA片段已知,以便设计出2个合适的
6、引物序列确定的依据被扩增的区域【补充】DNA复制需要引物的原因DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3ˊ端延伸DNA链
(三)PCR扩增的过程
1、反应需要的条件引物两种;反应物四种DNA聚合酶;模板DNA;离子条件溶液体系反应缓冲液【PCR技术的前提条件】待扩增的DNA片段3ˊ端核苷酸序列要已知,以便与合成出2个与两条3ˊ端核苷序列互补的引物
2、反应步骤
(1)变性在94℃高温条件下作为模板的;
(2)退火(也叫复性)反应体系的温度降至40--60℃,使得引物与作为模板的单链DNA上特定部位相互配对、结合【补充】当PCR反应体系的温度由变性后快速冷却到50℃左右时,引物与模板结合,一般不考虑解开的两个DNA模板链的重新结合,原因a.模板DNA比引物长得多而且复杂得多,不易重新结合;b.引物与模板间碰撞的机会远远多于模板互补链间的碰撞;c.加入的引物量足够大而模板链数量少
(3)链延伸反应体系的温度回升到72℃左右,在单链上4种按照原则连接在之后,使引物链延伸,形成互补的DNA双链
3、PCR的结果
(1)PCR的每一轮循环包括变性、复性和延伸三步,从第二轮循环开始,每次循环的产物也做模板参与反应,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸,这样,DNA聚合酶只能特定地复制处于2个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的DNA序列呈指数扩增
(2)PCR一般要经历三十多次循环,处于两引物间固定长度的序列数目为230【实验用具】
1、PCR仪
(1)作用自动调控,实现DNA的扩增
(2)替代者用3个恒温水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可
2、微量离心管总容积
0.5ml,实际是进行PCR反应的场所
3、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体,其上的枪头要用一次换一次【提醒】
1、为避免外源DNA等因素的污染,实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌
2、所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在—20℃储存
3、在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头必须更换
4、EB是一种致癌物,在实验过程中要做好防护工作,如戴塑料膜防护手套;在紫外灯下观察要戴上专用护眼镜
5、扩增不成功的原因漏加了PCR的反应成分;各反应成分的用量不当;PCR程序设置不当等
(四)PCR技术的应用
1、医学上可用PCR技术分析人的血液,对进行
2、对单细胞中的DNA进行扩增,用于遗传病的,并在此基础上进一步制备出无突变的DNA片段供遗传病患者时使用
3、法学上利用PCR技术直接分析血迹、精液、唾液或其他生物标本,可作为是否为作案人的重要辅助工具,也可以作为进行的手段之一
4、古生物学上可利用PCR技术分析几万年前的样品,追溯其生存年代或迁徙足迹
5、在农业生物技术中,可运用PCR技术检测是否已经目标生物等【巩固练习】()
1.PCR技术是现代分子生物学实验工作的基本方法之一,区别于细胞内的DNA复制,它利用的原理是什么A、DNA的半保留复制B、碱基互补配对C、转录和翻译D、DNA的热变性原理()2.多聚酶链式反应中,引物的作用是A、打开DNA的双链B、催化合成DNA子链C、提供模板D、使DNA聚合酶能够从引物的3ˊ端开始复制()
3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部A、
②③⑤④①B、
①⑤③②④C、
②③⑤①④D、
④②⑤③①()4.在PCR反应中,所使用的Tag聚合酶具备的特点是A、耐高温B、耐强酸C、耐强碱D、最适温度为37℃()5.下列操作过程的叙述中错误的是A、PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌B、PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在—20℃保存C、在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须熔化D、PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出后,迅速熔化()6.PCR仪实际上是一台自动调控温度的仪器,下列有关它调控不同温度的叙述中错误的是A、95℃,是DNA分子变形,解开螺旋B、55℃,使DNA分子恢复双螺旋结构,恢复活性C、72℃,使DNA分子开始复制,延伸D、72℃,使DNA分子复双螺旋结构,恢复活性
7.近10年来,PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段,其原理是利用DNA半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图一),在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验室所需的遗传物质不再受限于活的生物体
(1)加热使DNA双链打开,这一步是打开_____键,在图二中的位置是标号____________,DNA双链打开的过程称为_____________,细胞中是在________________酶的作用下进行的
(2)当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最终合成2条DNA分子此复制过程的原料是_________________,在图二中是标号__________所指的位置图二中标号1和2所代表的物质名称分别是__________和______________
(3)“PCR”技术的必需条件,除了模板、原料、ATP、酶以外,至少还有三个条件,即液体环境、适宜的______________和_________________
(4)通过“PCR”技术使DNA分子大量复制,若将一个用15N标记的DNA分子放入试管中,以14N标记的脱氧核苷酸为原料,连续复制四次之后,则15N标记的DNA分子占全部DNA总数的比例为_____________。