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黄瓜总DNA的提取及鉴定摘要:植物DNA首先要在液氮或干冰中将新鲜或冷冻的植物__研磨成粉,使细胞壁破碎,再用含有去污剂、螯合EDTA等成分的提取缓冲液处理__匀浆用氯仿-异戊醇把__匀浆中变性的蛋白质除去,将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开;再用RNaseA去除核酸中的RNA剩下的便是DNADNA可用乙醇或异丙醇沉淀,沉淀的DNA可用挑取或离心方法收集DNA的纯度可用紫外分光光度计做初略测量核酸、蛋白质、盐与小分子的最大吸收峰值分别为260__、280__及230__顺序测定一个样品在这三种波长下的OD值,如果提取的样品较纯,蛋白质及小分子的污染较小,则OD/OD
1.8,OD/OD
2.0通过测定OD,根据公式(双链)的浓度(ug/mLDNA的完整性可用凝胶电泳来测定常用的凝胶有聚丙烯酰胺与琼脂糖琼脂糖电泳可分理相差100bp的DN__段,但分离范围大,制备简单方法植物__(削皮的黄瓜)在液氮中研磨,磨好的__溶于65℃CTAB提取缓冲液中,保温一段时间后用酚-氯仿抽取2次,除去变性的蛋白及大部分碳水化合物再用乙醇将DNA沉淀下来获得的DNA用紫外分光光度计测定浓度及纯度,再用琼脂糖凝胶电泳检测完整性关键词DNA,提取及鉴定
1.实验材料与方法
1.1实验材料黄瓜
1.
1.1试剂液氮;CTAB提取缓冲液;TE缓冲液或重蒸水;酚氯仿异戊醇=2524:1;异丙醇或无水乙醇;TE缓冲液,重蒸水;
0.3%m/V)标准琼脂糖;
0.5×TBE缓冲液,上样缓冲液;EB;
1.
1.2器具研钵,小药勺;
1.5mL小离心管若干;定量移液器及枪头;离心机;恒温水浴锅;紫外分光光度计;水平电泳槽;三角瓶(500或1000mL;微波炉或沸水浴,透射紫外灯
1.
1.3生物材料黄瓜
1.2试验方法
1.
2.1提取DNA
1.CTAB于65℃,水浴30min
2.称取8g黄瓜去皮)研磨破碎细胞壁
3.加20molCTAB于研磨中混匀酚浆,2支离心管于65℃水浴15min,3500Hpm,5min去除残渣
4.取上清液5mL于离心管中,加入5mL氯仿-异戊醇上下颠倒混合2min
5.上清液转移至小烧杯中加2倍体积预冷的乙醇,观察纤维状沉淀
6.转移10mol离心管中,4℃水箱保存备用
1.
2.2DNA浓度及纯度的测定
1.将提取的DNA粗产物离心3500rmp,10min
2.弃上清液,加约5mL70%乙醇吹打洗涤,使沉淀悬浮
3.3500rmp10min使DNA沉淀
4.弃上清,2支离心管一支加5mL氯化钠水溶液溶解;另一支4℃保存下次备用
5.用氯化钠作对照基线校正后沉淀220-350__的光谱图
6.用氯化钠作空白对照,测定OD、OD、OD
1.
2.3琼脂糖凝胶电泳
1.制胶称取
0.25g琼脂糖溶解在25mL1×TBE中微波炉加热,微沸3次冷却至60℃倒胶
2.点样待胶冷却凝固后,将DNA样品加2mlddHO溶解,取10ml与3mlloadingbuffe混合,并用移液枪小心加入至样品槽中
3.电泳点样端放在负极120V,40min凝胶成像,EB染胶10min,流水5min,凝胶成像在系统下观察
2.结果与分析
2.1提取DNA提取出黄瓜的DNA
2.2DNA浓度及纯度的测定
1.记录220-350__时的光谱图
2.计算OD/OD,OD/OD,分析DNA的纯度OD=DNA的浓度=50×OD×稀释倍数=波长换成280__及230__用同一样品再次测OD的值OD=;OD=OD/OD=;OD/OD=则提取DNA的纯度
2.3琼脂糖凝胶电泳观察并分析DNA的电泳图像从图中可以看出,如果基因组DNA完整,应该仅出现一条主带;如果很多条深浅不一的带,则说明DNA已经降解;如果背景模糊,说明在DNA样品中混杂有RNA;
3.1提取DNACTAB提取液中各试剂分别的作用?
1.细胞膜裂解,使DNA释放到提取缓冲液中,同时使__匀浆中的蛋白质变性;缓冲液中的-疏基乙醇,-疏基乙醇抑制从__匀浆释放的多酚氧化,防止植物__黄褐变
3.3琼脂糖凝胶电泳影响DNA电泳速率有哪些因素?
1.DN__段的长度;
2.DNA的构象;
3.琼脂糖的浓度;
4.电压电泳的原理带电物质在电场中向着与共电荷相反的电极__DNA分子在高于PI的溶液中带负电荷在电场中向阳极__琼脂糖的作用使DNA分离开琼脂糖凝胶的口径越大,能被分离的DNA越大。