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所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数,所用的方法是稀释平板计数法,由于计算的是平板上形成的菌落colony-formingunit,cfu数,故其单位应是cfu/gmL它反映的是检样中活菌的数量所谓大肠菌群,是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称,主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成,即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属水中大肠菌群的检验方法,常用多管发酵法和滤膜法多管发酵法可运用于各种水样的检验,但操作繁琐,需要时间长滤膜法仅适用于自来水和深井水,操作简单、快速,但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样三实验器材1菌落总数的测定1培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基牛肉膏
3.0g蛋白胨
10.0gNaCl
5.0g水1000mLpH
7.4~
7.6将培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中,牛肉膏常用玻棒挑取,放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶化后到入烧杯也可放在称量杯中,称量后直接放入水中,这时如稍微加热,牛肉膏便会与称量纸分离,然后立即取出纸片在上述烧杯中先假如少于所需要的水量,用玻棒搅匀,然后,加入琼脂,再在石棉上加热使其溶解将药品完全溶解后,补充水到所需的总体积在未调pH前,先用精密pH试纸测量培养基的原始pH,如果偏酸,用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌,并随时用PH试纸测其PH,直至PH达
7.6反之,用1mol/LHCL进行调节无菌生理盐水需用生理盐水浓度是
0.9%称取
0.9克氯化钠,溶解在少量蒸馏水中,稀释到100毫升2器材试剂牛肉膏蛋白胨NaCl1moL/LNaOH1moL/LHCL灭菌水高压蒸气灭菌锅培养皿三角烧瓶带玻璃塞瓶天平试管牛角匙pH试纸(pH
5.5-
9.0)棉花记号笔纱布吸管麻绳牛皮纸量筒玻璃棒电热炉称量杯灭菌三角瓶灭菌的具塞三角瓶灭菌平皿灭菌吸管灭菌试管高压蒸气灭菌
1.将内层锅去处,再向外层锅中加入适量的水,使水面与三角架相平为宜
2.放回内层锅,并加入要灭菌的培养皿、试管、烧杯等物品(注意不要装得太挤,以免防碍蒸气流通而影响灭菌效果)
3.加盖,并将盖上的排气管插入内层的排气槽内,再2两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓,使螺栓松紧一致,勿使漏气
4.本实验用
0.1MPa,
121.5℃,20min灭菌灭菌所需时间到后,切断电源,让灭菌锅内温度自然下降,当压力表的压力降至“0”时,打开排气阀,旋松螺栓,打开盖子,取出灭菌物品2大肠菌群的测定;1培养基
①乳糖胆盐蛋白胨培养基蛋白胨20g,猪胆盐或牛、羊胆盐5g,乳糖10g,
0.04%溴甲酚紫水溶液25mL,水1000mL,pH
7.4制法将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中,校正pH,加入指示剂,分装,每瓶50mL或每管5mL,并倒置放入一个杜氏小管,l15℃灭菌15min双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基除水以外,其余成分加倍或取三倍用量
②伊红美蓝琼脂培养基蛋白胨10g,乳糖10g,K2HP042g,2%伊红水溶液20Ml,
0.65%美蓝水溶液lOmL,琼脂17g,水1000mL,pH
7.1制法将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中,校正pH后分装.121℃灭菌15min备用临用时加入乳糖并熔化琼脂,冷至50-55℃,加入伊红和美蓝溶液,摇匀,倾注平板
③乳糖发酵管除不加胆盐外.其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基2器材灭菌三角瓶,灭菌的具塞三角瓶,灭菌平皿,灭菌吸管,灭菌试管等
(四)实验方法1水样的采集1自来水先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌,再开放水龙头使水流5min,以灭菌三角瓶接取水样以备分析2池水、河水、湖水等地面水源水在距岸边5m处,取距水面10-15cm的深层水样,先将灭菌的具塞三角瓶,瓶口向下浸入水中,然后翻转过来,除去玻璃塞,水即流入瓶中,盛满后,将瓶塞盖好,再从水中取出如果不能在2h内检测的,需放入冰箱中保存2细菌总数的测定1水样稀释及培养
①按无菌操作法,将水样作10倍系列稀释
⑦根据对水样污染情况的估计,选择2-3个适宜稀释度饮用水如自来水、深井水等,一般选择
1、1:10两种浓度;水源水如河水等,比较清洁的可选择1:
10、1:
100、1:1000三种稀释度;污染水—被选择1:
100、1:
1000、1:10000三种稀释度,吸取1mL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作3个重复
③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿,每皿约15mL,并趁热转动平皿混合均匀
④待琼脂凝固后,将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出,计算平皿内菌落数目,乘以稀释倍数,即得1mL水样中所含的细菌菌落总数2计算方法作平板计数时,可用肉眼观察,必要时用放大镜检查,以防遗漏在记下各平板的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌落数3计数的报告
①平板菌落数的选择选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准一个稀释度使用两个重复时,应选取两个平板的平均数如果一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数
②稀释度的选择a.应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度,乘以该稀释倍数报告之表1例1b.若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30-300之间,则视二者之比如何来决定若其比值小于2,应报告其平均数;若比值大于2,则报告其中较小的数字l例
2、例3c.若所有稀释度的平均菌落均大于300,则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之l例4d.若所有稀释度的平均菌落数均小于
30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之1例5e.若所有稀释度均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数报告之(表1例6f.若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间,则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之表l例7
③细菌总数的报告细菌的菌落数在l00以内时,按其实有数报告;大于100时,用二位有效数字,在二位有效数字后面的数字,以四舍五入方法修约为了缩短数字后面的0的个数,可用10的指数来表示,如表1“报告方式”一栏所示3大肠菌群的测定多管发酵法表1稀释度的选择及细菌数报告方式稀释度及菌落数两稀释度之比菌落总数/(cfu/g或cfu/mL)报告方式(菌落总数)/(cfu/mL或cfu/g)10-110-210-31多不可计16420-1640016000或
1.6×1042多不可计
295461.63775038000或
3.8×1043多不可计
271602.22710027000或
2.7×1044多不可计多不可计313-313000310000或
3.1×105527115-270270或6000-<10<107多不可计30512-3050031000或
3.1×1041生活饮用水或食品生产用水的检验
①初步发酵试验在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液可称为三倍乳糖胆盐的三角瓶中内有倒置杜氏小管,以无菌操作各加水样100mL在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中内有倒置小管,以无菌操作各加入水样10mL如果饮用水的大肠菌群数变异不大,也可以接种3份100mL水样摇匀后,37℃培养24h
②平板分离经24h培养后,将产酸产气及只产酸的发酵管瓶,分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板EMB培养基上,37℃培养18—24h大肠菌群在EMB平板上,菌落呈紫黑色,具有或略带有或不带有金属光泽,或者呈淡紫红色,仅中心颜色较深;挑取符合上述特征的菌落进行涂片,革兰氏染色,镜检
③复发酵试验将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中,为防止遗漏,每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个,37℃培养24h,如果产酸又产气者,即证实有大肠菌群存在
④报告根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数,查表107-2(或表107-3),报告每升水样中的大肠菌群数MPN2水源水的检验用于检验的水样量,应根据预计水源水的污染程度选用下列各量
①严重污染水1,0.1,0.01.0.00lmL各1份
②中度污染水10.1,0.1,0.01mL各1份
③轻度污染水100,10,1,0.1mL各l份
④大肠菌群变异不大的水源水10mLl0份表2大肠菌群检索表(饮用水)012备注每升水样中大肠菌群数0<3411接种水样总量300mL(100mL2份,10mL10份)138182713273111838414245251830706223692727431208315116193660230104069>230表3大肠菌群数变异不大的饮用水阳性管数0123接种水样总量300mL(3份100mL)每升水样中大肠菌群数<3411>18表4大肠菌群检索表(严重污染水)接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注
10.
10.
010.001----<900接种水样总量为
1.111(1,
0.1,
0.01,
0.001mL各一份)---+900--+-900-+--950--++1800-+-+1900-++-2200+---2300-+++2800+--+9200+-+-9400+-++18000++--23000++-+96000+++-238000++++>238000表5大肠菌群检索表(中度污染水)接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注
1010.
10.01----<90接种水样总量为
11.11(10,1,
0.1,
0.01mL各一份)---+90--+-90-+--95--++180-+-+190-++-220+---230-+++280+--+920+-+-940+-++1800++--2300++-+9600+++-23800++++>23800表6大肠菌群检索表(轻度污染水)接种水样量/mL每升水样中大肠菌群数备注
1001010.1----<9接种水样总量为
111.1(100,10,1,
0.1mL各一份)---+9--+-9-+--
9.5--++18-+-+19-++-22+---23-+++28+--+92+-+-94+-++180++--230++-+960+++-2380++++>2380表7大肠菌群变异不大的水源水阳性管数012345678910每升水样中大肠菌群数<10112236516992120160230>230备注接种水样总量100mL10mL10份操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验同时应注意,接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管;接种量在1mL以上者,应保证接种后发酵管瓶中的总液体量为单倍培养液量然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管瓶数,查表107-
4、表l07-
5、表107-6或表107-7,报告每升水样中的大肠菌群数MPN附滤膜法滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中,经过抽滤,细菌即被均匀地截留在膜上,然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落,计算出每升水样中含有的大肠菌群数MPN1准备工作1滤膜灭菌将3号滤膜放入烧杯中,加入蒸馏水,置于沸水浴中蒸煮灭菌3次,每次15min前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次,以除去残留溶剂2滤器灭菌准备容量为500mL的滤器,用点燃的酒精棉球火焰灭菌,也可用121℃高压灭菌20min3培养3)培养将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min2过滤水样1用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分,将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上,轻轻地固定好滤器漏斗水样摇匀后,取333mL注入滤器中,加盖,打开滤器阀门,在—50kPa压力下进行抽滤2水样滤完后再抽气约5s,关上滤器阀门,取下滤器,用无菌镊子夹取滤膜边缘部分,移放在品红亚硫酸钠培养基上,滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴,两者间不得留有间隙或气泡若有气泡需用镊子轻轻压实,倒放在37℃培养箱内培养16-18h3结果判定1挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色,镜检
①紫红色,具有金属光泽的菌落
②深红色,不带或略带金属光泽的菌落
③淡红色,中心颜色较深的菌落2凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌,需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基,37℃培养6-8h,产气者,则判定为大肠菌群阳性31L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。