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海洋哺乳动物的病毒病(ViralDiseasesinMarineMammals)SuzanneKennedy--stoskopf病毒分离的概况(VirusIsolation-AnOverview)病毒(Viruses)在排除其他容易分离到的病原体的基础上常常被认为是致病因子一旦细菌(bacteria)、真菌(fungi)和寄生虫(parasites)在鉴别诊断中被排除,则适合病毒分离的材料常常不再具有活性,如具有活性则不再具有传染性如对照血清显示对某病毒的抗体滴度升高,则表明动物有该病毒的感染但这只是间接性的证据,因此不能做出最后定论诊断一个病毒感染至少应用电子显微镜显示病毒粒子,最好的办法是分离病毒进行适当的鉴定,病毒是否真正造成疾病比较容易解释,并且能通过实验接种重新复制临床症状和病理变化予以验证然而,该方法是不实际的,并且有时因有其他病因(在实验条件下不能复制)能影响病毒的致病性而不能得出结论某些临床症状明显的说明病毒是致病因子大量动物由于急性死亡就是一个例子,比如发生于新英格兰海岸流行于点班海豹(harborseal)中,由流感病毒A引起的疫病和在北欧由疱疹病毒(herpesvirus)引起动物大量急性死亡就是很好的例证另外一个例子是在鲸类动物中,与痘病毒(poxvirus)有关的皮肤病变在临床上得到了复制用于病毒分离的病料有皮肤病变组织、肺、肝、肾、脾、异常的淋巴结和脑组织,采集病料时应尽可能无菌操作,各个样品应置于塑料袋里于-70℃保存,但大家一致认为该方法在临床上不实用,除非事先采取预防措施在病料运送到超低温冷冻器之前,可用含有冰块的容器保存6-12小时,样品应可能小,以便对样品进行速冻有时,从活组织中分离出的病毒比较好,这就需要与实验室进行密切合作并由实验室提供运输组织样品的运输媒介,用抗菌素和抗真菌药物强化处理的组织培养基和缓冲盐溶液被用于在冰中的环境中保存样品可达到24小时在大多数实验室受限制的因素是缺乏海洋哺乳动物细胞,以便用组织均桨进行接种,这些实验室寄希望于海洋哺乳动物分离的病毒能在来自其他动物种类的细胞上生长,或者能在那些组织样品细胞上进行病毒的生长和复制,该方法已被成功地用于萼病毒(calcivirus)和流感病毒A(influenzaAvirus),但在腺病毒和疱疹病毒(adenoandherpesvirus)还没取得成功假如病毒没有被分离出来,被保存的样品可作电子显微镜观察以检查病毒粒子(viralparticles),尽管用福尔马林固定的(Formalinfixed)组织能显示出病毒的超微结构,但最好用戊二醛(glutaraldhyde)进行固定一观察其形态学结构还有一个限制因素就是冰,因为大多数固定后的组织用于电子显微镜的观察需要冷冻,假如样品在现场采集时不能进行理想的固定,则可将组织样品在转到3%戊二醛溶液里之前储藏于塑料袋或将其包起来放于铝盒里储藏于冰里面保存4--6小时样品应小于1mm2以便用戊二醛进行适当的固定,假如样品不能冷冻保存或不能迅速转移到戊二醛溶液中,则可用福尔马林(Formalin)进行固定痘病毒(Poxvirus)宿主范围(Hostrange)痘病毒已在数种鳍脚类动物皮肤病变组织中进行过形态学的分离鉴定,这些鳍脚类动物包括加州海狮(Zalophuscalifornianus),南美海狮(Otariabyronia),点斑海狮(Phocavitulina),灰海豹(Halichoerusgrypus)和海狗(Callorhinusursinus),痘病毒也和大西洋瓶鼻海豚(Tursiopstruncatus)和搁浅的白腰斑纹海豚(Lagenorynchusacutus)的皮肤病变相关联,该病毒对人工饲养的和自由生活的鳍脚类动物以及鲸类动物都感染临床症状(Clinicalsigns)在鳍脚类动物中,该病毒引起的皮肤病变的分布基本相似,其中包括头、颈和鳍肢,在点斑海豹和灰海豹,开始在皮肤出现直径
0.5--1cm突出皮肤的结节,接近一周后,这些结节增加到
1.5--3cm(见图1),在第二周,这些病变破亏,在点斑海豹则可有化脓现象,同样在第二周,病变迅速扩散,在点斑海豹中,该病毒在开始形成的结节周围形成卫星样分布的皮肤病变,尽管在点斑海豹中这些结节可持续15--18周,但一般在四周后这些皮肤病变在这两种海豹中开始消退,在疾病康复后可能会留下脱毛区和瘢痕组织在海狗和许多南美海狮中,皮肤结节是溃疡性的,而在加州海狮则结节既可以是溃疡性的,又可以是非溃疡性的在两只南美海狮中,这些皮肤结节曾出现过不定期地分布在全身体表的现象在鲸类动物中,与痘病毒感染相联系的皮肤表现有环形或针孔样病变,有时会出现深彩色点状图案,后者常指“花纹”病变(见第一章),这些环形或针孔样病变常单独出现
0.5--3cm圆形或椭圆形斑点,这些斑点常常融合,尽管这些病变可以见到相反的颜色,并常呈深灰色图案,但在病变的边缘呈深灰色Geraci等人曾提出,这些病变斑点(blemish)逐渐发展成为“花纹”状病变(见图2),Smith等人曾报道突出的仓白色水肿病变的发展与原先已存在的“花纹”样病变相联系,在这两类病变中都可显示出病毒在鲸类动物,病变可发生在身体的任何部位,但大多数病变常见于体背部的体表皮肤,尤其是在头部、胸鳍(pectoralflipper),背鳍(dorsalfin)和尾鳍(tailfluke),病变可持续数月或数年,而对动物没有明显的致病作用治疗(Therapy)海洋哺乳动物的痘病毒似乎不能造成全身性的感染,尽管有因皮肤痘病毒引起动物死亡的情况,但其他因素是致死的原因,在皮肤病变有化脓时,则在治疗时必须控制继发细菌感染,否则皮肤病变会在一定时间内被吸收病理学(Pathology见第十八章)从点斑海豹、灰海豹和加州海狮所采取的活组织标本进行福尔马林固定后,其组织学特征基本相似,皮肤角质层表现出不同程度的过度角化(hyperkeratosis)和角化不全(parakeratosis),在一些区域能观察到溃疡,嗜中性细胞浸润和细胞、细胞桨的空泡化和细胞核的变性是棘细胞层最突出的现象,在这些表皮细胞中可见到胞桨内大的嗜酸性包函体(2--15μm),在真皮可见到多种炎性细胞浸润在海狗和南美海狮,皮肤结节由致密的多粒上皮细胞(polygonalepithelialcells)小叶组成,这些细胞向下朝着真皮方向增生,这些细胞含有丰富的微细颗粒状的嗜酸性细胞桨和一个圆形泡状细胞核,核中含有一个明显的核仁,在这些细胞内可见到单个存在呈圆形直径为8--26um的嗜酸性胞桨内包函体(inclusionbody)在鲸类动物中,间质细胞层的细胞含有较小、球状或不规则形状、浅嗜酸性的胞桨内包涵体,含有包涵体的细胞位于转移带并形成环形病变的边缘,病变中心带间质层的细胞表现出明显的胞桨空泡样变性和典型的角质蛋白纤维的网状图案,与病变组织相连的未感染组织的纵轴由正常方向发展为与皮肤表面的方向垂直在鲸类动物中,其皮肤的最外层(又称外层或角化不全层),在大多数动物中都没有角化(keratinized),而由10--15层各种具有细长细胞核和线粒体的扁平细胞组成,这些细胞具有极高的有丝分裂率并不断的脱落,留下光滑的皮肤表面在痘病毒感染时,最外层细胞的数量增加到3倍,从而将细胞向下挤压,因而基本没有突出的皮肤与病变相联系,当病变逐渐发展成深色点状图案时,这些图案常与“花纹”病变相联系,此时会在皮肤表层出现破裂,产生凹陷并延伸到皮肤的间质层诊断(Diagnosis)从鳍脚类或鲸类动物中分离痘病毒,目前还没有在科技文献中报道痘病毒的假定性诊断是依据嗜酸性胞桨内包涵体的存在,并用皮肤活组织制作的电子显微镜超薄切片,鉴定出典型的痘病毒粒子而确定的活组织标本应切成1mm2的块状,并用3%的戊二醛(glutaraldehyde)进行适当的固定但值得注意的是在采取活组织样品时,应包括病变组织和正常组织,这一点在鲸类动物中显得尤为重要,因为在鲸类动物中,病毒粒子只在病变周围组织中存在,有选择的采取活组织并且是在鳍脚类动物比较成功的方法是用手术刀获取活组织,并将其悬浮在
0.1ml灭菌的蒸馏水中,该病料应允许在包被的栅栏上干燥,进行阴性着染,然后在电子显微镜下观察,病毒粒子可以检查出来,但组织的形态被破坏在超微结构观察中,含有病毒粒子的细胞表现出细胞核和胞桨成分的丢失在细胞桨中,存在胞桨细胞器的破坏和边缘化,细胞核不规则,染色体着边和存在团集即使包涵体在不同种海洋哺乳动物中有所变化,但病毒粒子常常与胞桨内包涵体相联系,鳍脚类和鲸类动物成熟的病毒粒子具有典型的痘病毒的形态学特征,一个典型的病毒粒子在超薄切片或阴性染色标本检查时,直径约200×250-300nm,砖状,含有哑铃状的核心,具有一个外膜,两个侧体使核心成凹形,并具有一个核衣壳在阴性染色标本中,可以观察到两种类型的病毒粒子电子透明粒子—M(桑葚粒子)粒子和电子密度粒子--C(病毒衣壳)粒子,从加州海狮和点斑海豹所观察到的M粒子大小为313×194-200nm,C粒子稍大一些,其大小为352×196nm,从鲸类动物超薄切片中观察到的病毒粒子其大小为220×105nm8和200×300nm7尽管能根据病毒的形态学做出诊断,但假如在不同种鳍脚类动物之间的病毒分离作比较或在鳍脚类动物之间的病毒作比较,则必须进行病毒的分离从海洋哺乳动物分离痘病毒还没取得成功,有人曾试图从有临床症状的点斑海豹采取病料接种到绒膜尿束膜(chorioallantoicmembrane)上,但犬如接种到Vero细胞和犬胚胎皮肤细胞一样没有取得成功多数种类的病毒可以用绒膜尿束膜进行分离,然而痘病毒(parapoxvirus)在形态上和海豹病毒相似,同时也不能用绒膜尿束膜进行分离分离海洋哺乳动物痘病毒合乎逻辑的地方应该是包含有正常组织和非正常组织的活组织样品的移植物上,鳍脚类动物的皮肤成纤维细胞比较容易在体外繁殖,假如病毒在组织培养物上的复制速度没有在分裂细胞上复制速度快的话,则该方法用于病毒在加州海狮、点斑海豹、灰海豹的上皮上的繁殖,假如海洋哺乳动物成纤维细胞不容易得到,为了避免这个问题的发生,可同时移植正常的皮肤用于组织培养的需要,由于这些鳍脚类动物的病毒能造成人四肢的分离病变,因此可选择性的使用已被用于增殖类似海豹痘病毒的脑骨髓和动物痘病毒的原代人羊膜细胞进行病毒的增殖这两种方法之中的任一种是否适合南美海狮和海狗(NorthFurSeal)描述过的皮肤结节(epithelialnodules)的病毒分离存在争论,这是由于病毒在体外复制的靶细胞(targetcell)似乎是上皮细胞(epithelial)而不是成纤维细胞(fibroblastic)不幸的是,正常海豚皮肤的移植生长不是很容易,因此用海豚的痘病毒病变组织在培养基上能生长很好这还存在着一定的疑问因此分离海豚痘病毒一个可行的方法是将切碎或研磨的组织接种到原代海豚肾细胞或原代人羊膜细胞或包皮细胞上,在运用此种方法时,可以将组织冷冻到-70℃鉴别诊断(Differentials)与皮肤链丝菌病的鉴别鳍脚类动物皮肤链丝菌病(Cutaneousstreptothricosis)造成的皮肤节结与痘病毒(poxvirus)造成的皮肤结节相类似其病原体为Dermatophiluscongolensis,假如没有与其他细菌一起大量生长,则该病原体可用血琼脂培养基进行分离,或代之以病变组织的组织学切片检查,发现无数纵分裂或横分裂的菌丝便作出诊断与萼状病毒病的鉴别萼状病毒(Caliciviruses)在鳍脚类动物中可引起囊泡病变,该病变可与破溃型的痘病毒病变相混淆然而由萼状病毒引起的囊泡病变常常只涉及为鳍肢,而在动物的头部和颈部常常不造成病变流行病学(Epizootiology)和发病机理(Pathogenesis)痘病毒科(PoxviridaeFamily)有2个亚科(Subfamily)脊椎动物痘病毒亚科(Chrodopoxvirinae)和昆虫痘病毒亚科(Entomoponvirinae),脊椎动物痘病毒亚科(Chrodopoxvirinaesubtamily)由六个属组成,除副痘病毒属(parapoxvirus)以外,这些属在形态学上很难区别,副痘病毒属(parapoxvirus)的病毒粒子在阴极染色标本有交叉螺旋性的表面图案,依据该鉴别特征在加州海狮、点斑海豹和灰海豹种的痘病毒应归为副痘病毒属(parapoxvirus),该属的其他成员包括牛的流行性胃炎的病原体--假牛痘(pseudocowpox)和羊痘(orf),反刍兽和鳍脚类动物的副痘病毒在流行病学上(epizootiology)存在着某些相似性鳍脚类和反刍兽(ruminant)动物的痘病毒病变经常在新生儿中见到副痘病毒属的病毒很容易在这些敏感的动物群中传播,对于刚进入人工饲养的刚断奶的鳍脚类动物极易爆发该病毒病,其潜伏期(incubationperiod)为3--5周在灰海豹,只有饲养到水泥池的动物才发生副痘病毒属病变这表明,皮肤表面的破裂是造成感染的始发原因,这种现象对于假牛痘病毒确实存在由于在反刍兽中引起的病变可再度复发,因此,在鳍脚类动物中其症状消失的可能性也明显的存在引起南美海狮(SouthAmericasealion)和海狗(Northernfurseal)的痘病毒(poxvirus)可能是其他属,而不是副痘病毒属的病毒(parapoxvirus)遗憾的是从这些动物分离的样品没有制成阴性染色标本,分离病毒的组织必须具备相应的特征然而,由于这些痘病毒病变开始时,以上皮细胞增生为特征,这种现象犹如人的传染性软疣,该病是由于一种未确定分类地位的痘病毒引起人的一种常见的疾病海豚的痘病毒仍未确定分类地位,C粒子已在永久存在的“花纹”病变中显示出来,而C和M两种粒子可在并发的、新生的、突出皮肤的病变中同时存在C和M粒子沉淀抗体的出现表明突出皮肤的病变在消退,同时在长期存在“花纹”病变的病例中也会出现沉淀抗体,由于血清中含有沉淀C和M粒子的沉淀抗体,因而不能沉淀原病变中的C粒子作者推测这两种感染的动物要么是感染了两种不同的痘病毒,要么是由于宿主与病毒之间互相影响导致了某种改变不管怎样,可检测出的病毒特异性抗体的形成,都与急性和慢性皮肤病变相一致在采取活组织标本区域的局部病变同样也会痊愈Geraci等人推测,在海豚中与痘病毒相联系的病变的出现和消退与动物的健康状态和环境条件有关,差的水质,水温的急剧下降和胃溃疡的发生,同时与痘病毒病变的出现一致公共卫生意义(PublicHealthSignificance)当人与感染的动物接触时,鳍角类动物的副痘病毒(parapoxvirus)能造成人手散在性的病毒病变,反刍兽的副痘病毒(parapoxvirus)也同样如此因此,可以得出一个假设,那就是只要有病变存在,动物就排出病毒曾有一个文献报道,在处理过灰海豹的三个人当中,有2个人唯一在接触动物19天后发生皮肤病变(见第9章),病变最初出现到结痂脱落,最快需要35天,其中1个人病变完全愈合时,其愈合期超过3--4个月;然而另外一个人反复出现病变后又消失,其病变完全愈合几乎花了一年的时间,尽管没有生命威胁,但鳍脚类动物的副痘病毒几乎对人是一个潜在的危害因此,与感染动物相接触的人必须戴上手套大多数痘病毒对于干燥和低温等环境因素以及大多数普通消毒剂有较强的抵抗力腺病毒(Adenovirus)宿主范围(HostRange)在大西洋(Antarctic)由日本捕鲸船捕获的鰛鲸(SeiWhale)曾出离腺病毒(Adenovirus),该病毒对宿主的致病机理目前尚不清楚但该病毒是首次从海洋哺乳动物中分离到的DNA病毒,其分离具有重要的历史意义然而,其分离由于病毒在Vero细胞上生长效价很低,而没有特征,有人用Vero细胞从北极露脊鲸(bowheadwhale)分离出了腺病毒(Adenovirus),腺病毒粒子的特征有人在发生肝炎(Hepatitis)的加州海狮(Zalophuscalifornianus)的肝脏中作过观察临床症状(clinicalsigns)曾经有两个文献报道了加州海狮与腺病毒有关的肝炎,总共有六头动物感染了病毒性肝炎,所有动物都在春季于加州海崖搁浅,这些动物除1头动物以外,年龄都在1岁以下,动物在营救后的1-28天相继死亡,其临床症状只有在28天死亡的动物作了适当描述开始时,动物表现虚弱、消瘦、羞明、干渴,在入院后13天,一支后鳍产生不全麻痹,动物腹部呈夹板状,并有间隙性血性腹泻,尽管有辅助治疗,但胃肠症状渐渐恶化,血液学显示淋巴细胞相对减少,单核细胞相对增多,这些临床症状和血象(hemograms)与在狗中观察到的犬传染性肝炎(lnfectiouscaninehepatitisICH)的临床症状和血象相一致,而犬传染性肝炎是由犬1型腺病毒引起的(canineadenovirustype1cav-)治疗(Therapy)到目前为止,由腺病毒引起的加州海狮的肝炎其致死率为100%然而,在群体样本中,其死亡率很小,来诊断除具有中等临床症状的动物有可能康复正如所有的病毒感染一样,治疗只是一种辅助疗法,有人曾在腺病毒传染病流行时,用灭活的CAV-1型疫苗(Vaccine)对美洲黑熊(Americanblackbears)进行过免疫接种假如在加州海狮也爆发类似的病,也可考虑用该疫苗进行免疫接种病理学(Pathology)肝脏由淡黄色发展为充血,从正常大小发展到高度肿胀在所有的病例中,最突出的组织病理学发现是肝脏坏死,在有些动物中还可发生大量的凝固性坏死,但该坏死没有明显的带状分布,有一头海狮其坏死灶(necroticloci)几乎都发生在大肝门(portaltriads)和中心聚合静脉(centialcollectingveins),淋巴细胞聚集在肝动脉和中央静脉的管壁在第一章报道中,于肝细胞中观察到了核内嗜碱性包函体(basophilicintranuclearinclusions),在第二章报道中,于kupffer氏细胞中观察到了颗粒状的两性着染的核内包函体所有的感染动物都发生肺炎(Pneumonia),尽管腺病毒是亲肺炎的,但在肺切片中没有观察到包函体的报道,其肺炎都是由其他原因引起的如寄生虫和吸入性的肺炎诊断(Diagnosis)用福尔马林固定的组织进行电子显微镜观察,在所有的病例中,其诊断是依据在宿主细胞核内的包函体中检测出典型的病毒粒子,在核孔周围的细胞桨里可发现少量的病毒粒子,病毒粒子(viron)由Hexagonal到圆形,其直径为70-75nm,病毒粒子没有衣壳(envelope),有人试图用绿猴(greenMonkey)肾细胞、恒河猴肾细胞、WI36成纤维细胞、Hela细胞和人羊膜(humonamnion)细胞对肝组织均桨进行海狮腺病毒的分离,都没有取得成功最近,CAV-1病毒已从美洲黑熊中分离出来,这一点尤其值得注意,因为海狮在种系发育上与熊有关(见第24章)用熊的肝、脑和肾的细胞均桨接种到MadinDardy犬肾细胞(MDCKcells)以及猪的肾细胞和睾丸细胞上进行病毒的分离,CAV-1病毒同样也能在浣熊(Raccoon)和雪貂Ferret肾细胞上进行复制如将来想从海狮中进行腺病毒的分离可用这些细胞当中的一种或几种进行病毒分离流行病学(Epizootiology)加州海狮腺病毒的来源目前还不清楚然而,其临床症状使人回想起感染CAV-1型病毒的狗和熊的临床症状,假如CAV-1型病毒是加州海狮肝炎的原因,那么它的传染源(Sourceofinfection)可能是狗在两例文献记载的发生腺病毒感染的熊中和野生的Canids中同时爆发了ICH感染,该病毒具极强的传染性,可通过直接与感染动物接触而进行传播,或通过与污染的设备或衣服而发生传播,康复后的Canids可在感染后于尿中排毒长达6个月之久在狗和自由生活的加州海狮之间的接触机会存在,更有趣的是所有腺病毒感染的海狮被运到海洋哺乳动物中心,在该中心存养着无数鳍脚类动物,然而没有任何证据显示这些存养的动物能感染腺病毒这表明海狮腺病毒与CAV-1型病毒有着抗原区别并且不具备接触性传染性或者CAV-1型病毒如同在狗中一样能在海狮中流行,但极少造成临床疾病公共卫生意义(PublicHealthSignificance)海狮的腺病毒和CAV-1型病毒能否造成人的疾病目前尚不清楚疱疹病毒(Herpesvirus)宿主范围(HostRange)疱疹病毒已从点斑海豹(Phocavitulina)、加州海狮(Zalophuscalifornicnus)和灰海豹(Halichoerusgrypus),疱疹病毒样病毒粒子已在白鲸(Delphinapterusleucas)的皮肤中作过显示临床症状(Clinicalsigns)点斑海豹(HarborSeals)的临床症状死亡动物的临床症状期为1--6天,在病程的早期,有鼻分泌物、口腔粘膜发炎,呕吐不止(Vomiting)、腹泻,体温高达40℃(正常体温为
36.5℃--
37.8℃),在病程后期发生咳嗽(coughing),厌食(noresia)和昏睡(Lethargy)所有感染的动物都是新生儿]加州海狮(Californiasealion)的临床症状在临死之前(感染后13天),脱毛区的界限比较明显,这种现象尤其是在成年和雄性海狮(在皮肤病变曾分离出反转病毒(Retrovirus)),发病动物在10天后厌食、高热(Febrile),进行辅助治疗,但动物出现呼吸困难(Dyspnea)最终导致动物死亡灰海豹的临床症状一个成年雄性灰海豹具有反复发生皮肤病变的历史,这些病变包含界限明显的脱皮区,这些脱皮区直径接近
0.5cm,主要沿腹部分布,这些病变具有明显的季节性,并与雄性灰海豹发情期(rut)的出现相吻合,厌食是一个不定的临床表现白鲸(Belugawhales)的临床症状在两头死于多重感染的搁浅的青年雌白鲸中观察到动物普遍发生皮炎(Dermalitis),病变呈环形,直径可达到2cm,病变出现后又稍微有所凹陷,一个狭窄的黑环其颜色比位于中心的一小块正常皮肤的颜色要浅,一些病变的中央发生坏死,类似的病变也发生于被捕获后3个月的未成年的雌性动物经过7个月的时间后,位于背脊部的病变发展到直径为20--30cm的病变区如动物处于明显的健康状态,则病变虽能见到,但不再发展治疗(Therapy)在全身感染的情况下,治疗只是辅助性的,针对文献记载的动物流行病,可试用治疗人单纯性疱疹病毒(Herpessimplex)感染的口服用acyclovir(9-
(2)hydroxyethoxymethylguanine,9-
(2)羟乙氧甲基鸟嘌呤)抗病毒药,该药不能消除病毒的感染,但在原发性感染中能明显地减轻局部的临床症状该药在复发期和抗非H.simplex的疱疹病毒的有效性是可变的因此,该药治疗鳍脚类动物疱疹病毒的价值具有较大的推测性,一个有趣的报道是有人曾引用副牛痘接种的原理来控制两头贝加尔环斑海豹(phocasibiria),这两头动物被圈养在Leipzig动物园,并在3年里于头部反复发生结膜炎(Conjunctivitis),角膜炎(Keratitis)和皮肤疹块(Skineruptions),这些临床症状一年出现三次,疾病反复发生并结合不能鉴定出细菌性或真菌致病的病因,可得出疑似疱疹病毒感染(suspectedherpesvirusinfection)的诊断为努力控制各期病症,可将1ml的三联脊椎灰质病毒疫苗注射到鱼体内用口服的方法对海豹进行免疫接种,其目的是对无关病毒激发免疫反应,以希望对疑似疱疹病毒诱发有益的免疫反应,这种免疫的偶发现象(Epiphenomenon)在过去曾应用过,并用脊髓灰质炎病毒疫苗(poliovaccine)和小痘真菌苗(Smallpoxvaccine)(请注意疫苗必须为仍能使用的疫苗),接种后海豹会在9个月里不出现症状此后,仅仅只发生皮肤病变,如动物每间隔1个月连续接种三次,到本文发表时止,已有11个月没有出现临床症状,尽管该治疗有些益处,但由于动物在接种后会排出有活性的脊髓灰质病毒到外界环境中,因而会潜在性的公共健康方面的危害病理学(Pathology)
1、点斑海豹(HarborSeal)的病理变化肉眼可见的明显的病变包括肺炎(Pneumonia)、肝肿大(hepatomegaly)和口腔粘膜出现溃疡,在显微镜下,肝脏显示出大量的严重的凝固性坏死;
2、加州海狮(Californiasealion)的病理变化在颊壁粘膜上有小溃疡有5--10个小的溃疡性皮肤病变分布于胸部背侧、腹部和两支前鳍上心包腔(pericardialsac)含有接近500ml的脓性渗出液(purulentexudate),肺的重量增加并在胸膜下有大量灶状出血(hemorrhages)心包(pericardium)和心外膜(epicardium)由于水肿和纤维素积聚而增厚炎性浸润主要由嗜中性细胞组成,并蔓延到心肌层(myocardium)肺充血(pulmonarycongestion)并伴有散在性的胸膜下和肺泡出血,纤维素沉着弥漫性存在于肺泡里没有观察到核内色函体从心包渗出物(pericardialeffusion)和肺进行纯培养并分离到了巴氏杆菌(pasteurellamultocida)
3、灰海豹(Grayseal)的病理变化皮肤病变以具有局灶性脓性渗出物的溃疡为特征,并伴有皮肤的混合炎性细胞浸润
4、白鲸(Belugawhales)的病理变化皮肤病变以赖细胞层(stratumspinosum)的坏死为特征坏死性的角化细胞发生固缩(pyknotis),并表现出不同程度细胞桨空保养变性这些细胞中一部分细胞核各自含有一个色函体(lnclusionhoby),尽管皮肤的乳头状突起高度降低、数量减少,皮下没有炎症存在诊断(Diagnosis)
1、点斑海豹(Harborseal)的诊断该病毒最初是用患有肺炎(pneumonia)和肝炎(hepatitis)的一头动物所获取的移植肾细胞进行分离的典型的细胞病理作用(CPE)包括细胞呈局灶性圆形排列的合胞体细胞的形成,该细胞毒作用会在7天内感染各层的细胞从死于其他原因的点斑海豹获得的肾细胞用于病毒的繁殖以进行最新的病毒分离,同时也用于其他海豹肝、肺病毒的复壮人们试图用Vero细胞(美洲绿猴肾细胞系)、第三代Cynomologousmonkey肾细胞、具有Hela标记的人猴表皮样肿瘤细胞系(Hep-2)、猪肾细胞系(PK-15)、狗原肾细胞、MDCK、猫胚胎细胞系(FE1)、兔原肾细胞、兔肾细胞系(RK13)、鼠胚胎细胞系(Rates)、幼仓鼠肾细胞系(BHK)进行该病毒的繁殖都没有取得成功感染的海豹肾细胞常制成超薄切片和阴极对照标本进行超微结构的检查,病毒衣壳(Viralcapsids),大小接近115×105nm在阴极对照标本中,疱疹病毒具有中空病毒颗粒的特点,病毒粒子具有同心的衣壳交叉中和反应试验(cross-neutralizationtest)结果表明,从海豹分离出来的疱疹病毒在抗原性上与犬疱疹病毒(canineherpesvirus)和猫疱疹病毒-1(Felineherpesvirus-1)有关因而,该病毒被认为是疱疹病毒科(HerpesviridaeFamily)的一新成员,依据该病毒的抗原关系,短的复制周期(replicationcycle)和体外的细胞毒作用(CPE)以及体外的器官嗜性,海豹疱疹病毒(SeHV)被认为是α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinaesubfamily)的一名成员,该亚科的成员除了犬和猫的病毒以外,还有伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus),牛传染性鼻气管炎(rhnotracheitis)病毒以及鸡的传染性喉气管炎病毒
2、加州海狮(Californiasealion)的诊断用移植的肺组织中过度生长的成纤维细胞进行病毒的分离,在培养2周后,细胞开始集聚并出现细胞崩解(lysing)将此时的细胞刮下来并固定作超薄切片检查,病毒粒子具有偏心的衣壳,直径为180-220nm,病毒粒子的大小和形态和疱疹病毒相一致
3、灰海豹(Grayseal)的诊断用移植的皮肤中过度生长的成纤维细胞进行病毒的分离,在典型的细胞病理作用(CPE)出现之前,用胰蛋白酶处理过的融合细胞层分裂成12,3天后细胞聚集和崩解,括取细胞并固定进行超薄切片检查,发现有核内包函体,核内和胞浆内病毒粒子都能见到,具有同轴的病毒衣壳的病毒粒子其大小为120--140cm
4、白鲸(Belugawhales)的诊断用石蜡包埋的、福尔马林固定的皮肤标本进行电子显微镜检查尽管其形态学很差,但在坏死的角质细胞核中观察到的病毒粒子具有20面体的病毒衣壳直径接近60-75nm,深色的核衣壳被一个清晰的晕圈和一个深色的同心环所包围,形成病毒典型的“靶”构型,具有衣壳的病毒粒子,大小为115-130nm,能在邻近核膜的细胞桨中见到,并具有“靶”构型在圈养的白鲸的皮肤活组织中观察到了大小为140-160nm的类似的病毒粒子鉴别诊断(Differentials)在海狮中,由SeHV造成的肺炎(Pneumonia),必须区别于感冒病毒造成的肺炎,除病毒分离确定诊断以外,这两种病毒表现出不同的致病性SeHV造成间质性肺炎(interstitialpneumonia),感冒病毒A(influenzaA)能造成支气管肺炎(BronchialPneumonia),虽然其病原生物诸如细菌和寄生虫能造成肺炎,但如在海狮中检出疱疹病毒和多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)以及在点斑海豹(Harborseal)中检出感冒病毒和支原体(Mycoplasma)就不能排除并发病毒感染的可能性尽管在海豹中(Phocidseal)没有腺病毒造成肝炎的报道,但应予以考虑,到目前为止,海狮的腺病毒能形成核内包函体,而SeHV则不能形成核内包函体流行病学(Epizootiology)1984年在荷兰(Netherlands)爆发SeHV期间,23头动物中有11头动物死亡,所有的动物都是被父母遗弃的幼崽,这些幼崽被带到一个救养所进行救养,年龄为出生几天到2周龄根据流行过程,潜伏期(incubationperiod)为10-14天,该病毒的来源目前还不清楚,但所有的证据证明疱疹病毒对海豹有其特异性从加州海狮和灰海豹分离到的疱疹病毒类型还知之甚少,在形态学上他们不同于SeHV然而,有足够的证据表明,它们象SeHV,极易传播一只加州雄海狮与一只雌海狮一起圈养了9个月,该雄性动物在出现同样的临床症状和肺部病变4天后死亡,但是在该动物既没有分离到病毒又没有分离到细菌尽管灰海豹与加州海狮没有直接接触,但该动物在同一水环境中生存,这两种分离到的病毒的关系目前还不清楚在白鲸中疑似疱疹病毒感染的流行病学目前还一无所知发病机理(Pathogenesis)疱疹病毒能在它们的宿主中造成永久性的感染,潜伏期的病毒能重新被激活而表现出重复感染,触发新一轮病毒复制的机制还不清楚,但诸如应激(Stress)和免疫抑制(immunosuppression)似乎与病毒的复发有着某种联系,在鳍脚类动物和白鲸的每例病例都有应激的病史,在点斑海豹,当动物处于遗弃状态时,过度拥挤被证实是一种诱发因子最近,加州海狮在临近运输时,被转移到一个较小的圈养区在繁殖季节(breedingseason)当雄灰海豹追逐雌海豹时仅仅只发生皮肤损伤一只搁浅的白鲸(Belugawhale)具有穿孔性胃溃疡并继发腹膜炎,另一支搁浅的白鲸则具有蠕虫性支气管肺炎(verminousbronchophneumonia)和可能由病毒引起的非化脓性脑炎(nonsuppurativeencephalitis)高浓度的多氯联二苯(Polychlorinatedbiphenyls)和DDT及其代谢物可在这些动物的组织中找到第三只白鲸最近被抓获并适应了人工饲养环境在点斑海豹中,尽管病毒感染有可能是主要的,但灰海豹和人工饲养白鲸的病史表明有隐性感染公共卫生意义(PublicHealthsignificance)除开灵长类动物以外,疱疹病毒在海兽中具有较强的特异性,依据此生物学特征,海兽的疱疹病毒可能不在人兽间传播(见第9章)流感病毒(Lnfluenzavirus)宿主范围(HostRange)有人已从点斑海豹(Phocavitulina)中分离出了两种不同的流感病毒A第一中病毒(A/Seal/Mass/1/80,(H7N7))是于1980年在新英格兰海岸死亡的动物中分离到的,同时还从这些死亡的动物中同时分离到了支原体(Mycoplasma)第二种病毒(A/Seal/Mass/133/82(H4N5))是于1982--1983年间在新英格兰海岸死亡的动物中分离到的流感病毒A的两个亚型(Subtypes)H13N2和H13N9是于1984年在美国缅因州海岸搁浅的领航鲸(Globicephalamelaena)中分离到的临床症状(Clinicalsigns)在点斑海豹中,该病在原发性疾病流行期间其临床症状具有戏剧性的变化,营养好的动物出现虚弱、共剂失调和呼吸困难,偶尔可见泡沫样的白色或血性鼻分泌物,最常见是由于空气从胸腔入口逃逸而被包埋于筋膜和肌肉中形成的颈部肿胀在一头领航鲸中表现出的临床症状没有什么特征,动物运动困难,极度消瘦,在皮肤上有腐肉形成治疗(Therapy)该传染病具有极强的传染性以至于任何辅助治疗都无济于事病理学(Pathology)在海豹,肺炎以坏死性支气管炎和细支气管炎为特征,同时还表现出血性肺泡炎(Hemorrhagicalveolitis)在领航鲸,表现出肺出血,肺门淋巴结(hilarnode)极度肿胀诊断(Diagnosis)在海豹和领航鲸(Pilotwhale)两种动物中,流感病毒可将动物的肺和肺门淋巴结组织匀浆接种到鸡胚的尿囊膜中,进行病毒的分离该病毒同样也可以采取海豹的脑组织进行分离流感病毒血凝素和神经氨酸酶抗原的抗血清在病毒分离时被用于病毒的特异性鉴定鉴别诊断(Differentials)请参阅疱疹病毒的鉴别诊断流行病学(Epizootiology)在海兽中复壮的病毒在抗原性和遗传上与禽的流感病毒株(avianinphcenravirusstrains)有关从领航鲸(pilotwhale)分离到的两种病毒与欧鸟(gull)的H13流感病毒有关从海豹中分离到的病毒在抗原上与引起禽霍乱(Fowlplaque)的某些流感病毒株有关然而,从海豹中分离到的病毒对禽(poultry)没有致病性,从点斑海豹中分离到的病毒亚型H4N5具有其独特性,这主要是因为到目前为止,只有从哺乳动物分离到的流感病毒才能在鸟的消化道上进行复制,这是禽类引起病毒传播的主要地点与禽株病毒有关的流感病毒A引起的海兽的传染病进一步强化一个观点,即存在于哺乳动物中的流感病毒A是保持在禽类群体中的病毒在遗传上的重新归类在发病期间病毒的潜伏期(inculationperiod)为3天或少于3天从点斑海豹(Harborseal)分离的病毒在实验室接种时,能在雪貂(Ferret)、猫(cat)、猪(pig)和海豹(phocidseal)(其中包括点斑海豹(harborseal),环斑海豹(Ringedseal),以及鞍纹海豹(Harpseal))中进行复制,尽管能在自由生活的灰海豹中检测出抗H7N7流感病毒的抗体,但试验接种该动物时,病毒不能在灰海豹中复制,尽管灰海豹属于海豹,但灰海豹不是Phoca属的海豹,因此就不能象其他所有海豹一样流感病毒能在其中复制为了在动物发病期间复制出可见的临床症状,有人曾用在有临床症状的海豹中分离到的流感病毒A和支原体同时接种海豹鞍纹海豹尽管在显微镜下存在坏死性支气管炎和肺泡炎,但该动物不表现出明显的肺炎症状在点斑海豹中,许多相互作用的因素可能导致该疾病的爆发高群体密度以及非季节性温度升高已被证明是始发死亡率的原因公共卫生意义(PublicHealthSignificance)在该病毒流行期间,有四个人进行海豹剖检研究后的2-3天内,于已知的污染眼中发生了角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)有一个研究者在实验感染的海豹向其脸上打喷嚏后的40小时发生了严重的角膜炎(conjunctivitis)用结膜签在该研究者结膜上采样发现了与海豹相一致的一种流感病毒所有被感者于7天后完全康复,没有一个人对病毒产生抗体滴度,这表明此种病毒的作用就如同新城疫(NewcastleDisease)在人眼中的传播一样,只是局部现象然而,海豹流感病毒在气管内接种鼠猴(Squirrelmonkey)时,病毒不仅能复制,而且能造成全身性的疾病再次指出来,这些可疑的禽病毒的动物传染病潜伏着能适应哺乳动物宿主的威胁(见第9章)萼状病毒(Calicivirus,又名SANMiguel海狮病毒)宿主范围(HostRange)目前,从海洋哺乳动物分离到的萼状病毒有14个血清型(Serotype),其中有8个血清型的病毒是从加州海狮(Zalophuscalifornianus)中分离到的,其他病毒的来源有海狗(Callorhinusursinus),北象海豹(Miroungaangustirostris),太平洋海象(Odobenusrosmarusdivergens),斯氏海狮(EnmetopiasJubatus),大西洋瓶鼻海豚(Tursiopstruncatus),白眼鱼(Opaleyefish,Girellanigricans)和一个海狮肝吸虫(Zalophatremaspp.)海兽的萼状病毒似乎是猪疮疹病毒(VESV),对VESV不同血清型具有抗体的其他海洋哺乳动物包括加州灰鲸(Eschrichtiusrobustus),抹香鲸(Physetercatodon),长须鲸(Balaenopteraborealis),北极露极鲸(Balaenamysticetus)临床症状(Clinicalsigns)在海兽中,由萼状病毒造成的最常见的病变是皮肤空泡,在鳍角类动物中,空泡(Vesicle)常见于前鳍的背面,在海豚,所观察到的空泡病变常与“花斑”(tattoo)病变和老疤有着某种关联空泡的直径为1mm--3cm,这些空泡常常破溃(erode),留下浅的,能较快愈合的溃疡(ulcer),但偶尔空泡消退,留下疹块(Plaque)病变(图3a和图3b)在加州海狮,还观察到了与萼状病毒有关的早产(Prematureparturition)现象然而,在早产中也同时分到了波蒙纳钩端螺旋体(Leptospirapomona)因此,还不能肯定究竟是病毒还是螺旋体(spirachete)引起的早产早产的海狮崽表现出呼吸和运动困难,而且不能存活实验感染的海狗(Northernfurseal)幼儿发生了间质性肺炎(interstitialpneumonitsi)和轻度脑炎(mildencephalitis),但在肺(Lung)或中枢神经系统组织(CNStissue)中没有发现病毒治疗(Therapy)皮肤病变在没有进行辅助治疗的情况下常常自行愈合)病理学(Pathology)早期的空泡在棘细胞层(stratumspinosum)形成,之后扩展蔓延到皮肤的透明层(Stratumlucidum)和基底层(Basallayer)之间诊断(Diagnosis)该病毒可通过喉部采样或者抽取空泡液体置入含有磷酸缓冲甘油(PH
7.2)并冷冻后进行常规分离病毒在Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)很容易形成1--4mm的蚀斑(plaque)其他敏感细胞还包括PK-15,人的胚胎肾细胞,Hela细胞,Chang1-5C4细胞和包皮细胞有趣的是在海豚和海狮的皮肤细胞,没有产生细胞病理作用的报道目前,只有两个实验室能对分离的病毒和从海兽中采取的血清样品进行血清定型一个是美国俄勒冈州立大学(OregonStateUniversity)兽医学院(CollegeofVeterinaryMedicine)的萼状病毒研究中心;另一个是位于纽约长岛Greenport港的Plum岛动物疾病中心流行病学(Epizootiology)存在海兽中的萼状病毒,其流行病学可能在病毒学(Virology)中是最有趣的一种病毒将海兽萼状病毒接种到猪所造成的囊泡病变,几乎与所见到的囊状疱疹的一样,同时还发现在加州SanMiguel岛海狮中分离到的病毒与引起猪囊状疱疹(该病最晚一次见于1959年)的病毒没有什么不同因此,就形成一种理论,在加州,海兽的病毒可能是猪的感染源,因为在加州,该病在传播到该国家其他地区之前,已于十九世纪三十年代流行了20年,猪的临床疾病通过宰杀患病动物和禁止饲喂未煮过的食物而得以消除考虑到海产品一直被用作猪的食物来源,所以很容易推论出海狮是病毒的传染源然而,由于海狮群太小不足以形成如此众多而不同血清型的病毒的储藏宿主,从而激起了对更多可能的传染宿主的研究,这就导致发现了Opaleyeperch(一种鱼,分布于加州海狮分布区的南部区域)感染了从海兽分离到的各种血清型的萼状病毒Opaleye可生存10年,病毒至少能存活32天同时还有研究表明,肺虫(Parafilaroidesdecorus)幼虫(该幼虫能在鱼的肠道里存活相当长一段时间)尽管还没有最后定论,但可能是病毒的携带者Opaleye鱼可能是引起生存在加州海岸水域的海兽流行萼状病毒的主要原因,血清学研究表明,当时大多数海狮只有四个月大,并且都存在对一种病毒血清型或更多血清型的中和抗体(neutralizingantilodies)病毒在北冰洋(Arcticsea)的储藏宿主(reservoir)目前还不知晓,原先有学者认为北极圈海兽的萼状病毒感染只是暂时的,而且只发生于从流行水域移行来的那些种类然而,当从海象中分离出萼状病毒时,则否定了这个理论目前,既没有萼状病毒也没有萼状病毒抗体从大西洋(Atlantic)的海兽中分离出来,但这并不意味着分布在大西洋的海兽对萼状病毒不敏感,因为有人曾从人工饲养在太平洋海岸的大西洋瓶鼻海豚中分离出了萼状病毒相反,这恰恰意味着在这些水域的相应储藏宿主中有待于建立一个病毒血清型公共卫生意义(PublicHealthsignificance)目前,还没有任何证据显示海兽的萼状病毒能造成人的临床疾病,然而,这些病毒能感染广泛而不同的品种的能力还存在着争论,其病因不应轻易地予以定论,海兽的萼状病毒能在非洲绿猴造成实验感染,并能在灵长类和人的细胞上进行较好的复制,有研究者已提出该病毒两个血清型的中和抗体,并表明动物要么处在高病毒抗原浓度的环境中,要么病毒已真正在动物体内繁殖最近,在患有囊泡病变和脑炎(encephalitis)的灵长类动物中进行了萼状病毒的分离,进一步证明这些病毒在处理时应小心谨慎(见第九章)混合感染(Miscellaneous)从海洋哺乳动物中分离到的病毒是肠道病毒(Enterovirus),该病毒是细小病毒科(Picornaviridae)的一种细小RNA病毒,它是在加州的灰鲸中于1969年在直肠采样后用海豚的肾细胞分离到的,分离到的此种病毒对鲸的致病性目前还不清楚第一种存在于海兽的反转病毒(Retrovirus)是从一头加州海狮分离到的唾液病毒(Spumavirus),该海狮后来因患肺炎而死亡,并且从该动物分离到了多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocid)和疱疹病毒唾液病毒(spumavirus)常常从复发的皮肤病变和起源于外周血液单核细胞的粘附细胞中分离到,这种病毒是否真正能造成病变,目前还不清楚,Spumavirus的数种病毒组成了反转病毒科的一个亚科,并能在多种动物中造成持续性的感染尽管有一个研究报道这些病毒能在兔子中引起免疫抑制,但到目前为止,这些病毒还没有与任何一个特殊的疾病相联系在挪威(Norway),于环斑海豹(Ringedseal)中诊断出了狂犬病(Rabies),该动物被发现体后躯有伤口并且出现神志不清,5天后,动物的整个状况恶化,并变得具有攻击性(Aggressive),狂犬病(Rabies)通过大脑的免疫荧光检查(Immunofluorescentexamination)的到了确诊,而就在同一时间,在狐狸(Fox)之间有狂犬病的流行,考虑到狂犬病感染多种哺乳动物的可能性,这可能是在这个区域一个额外的不同,而使存在于陆栖动物中间的狂犬病能与海兽相互传播。