还剩31页未读,继续阅读
本资源只提供10页预览,全部文档请下载后查看!喜欢就下载吧,查找使用更方便
文本内容:
第二部分生物药物制备实验第一节氨基酸及其衍生物类药物实验二十二固定化细胞法生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸注此实验来自项目固定化细胞生产天冬氨酸,丙氨酸(国家攻关课题)的成果【实验目的】1.学习L-天冬氨酸和L-丙氨酸的制备方法2.了解酶法生产这两种氨基酸的原理和细胞固定化的原理及优点3.掌握固定化细胞的技术【实验原理】固定化细胞(Immobilizedcell)技术,就是利用物理或化学手段将游离的微生物细胞、动物细胞,定位于限定的空间领域,并使其保持活性且能反复利用的一项技术固定化细胞的制备方法主要有以下几种吸附法、共价交联法、絮凝法、包埋法;交联可以是细胞通过离子相互作用或共价连接到一个表面,也可以是细胞与细胞之间用过天然或化学试剂诱导产生连接;吸附法是细胞通过静电相互作用(范德华力、离子键和氢键)吸附到支持物表面,此法简单价廉,但经常发现有细胞泄露;絮凝法是利用某些微生物细胞具有絮凝形成颗粒的能力而对细胞进行固定化的方法;包埋法是近年来发展迅速的一种新兴固定化细胞技术,它是将细胞捕获在一个保护性基质结构或胶囊中,减少了细胞泄露,因此具有操作简单,对细胞活性影响较小,效率高等特点,是目前细胞固定化研究和应用最广泛的方法之一L-天冬氨酸(L-Asparticacid)是天然存在的重要氨基酸,在食品、医药、日用化工、纺织等行业有着广泛的应用L-天门冬氨酸钾、镁盐在细胞代谢中起着重要作用,是钾、镁的有效补充剂,适用于各种心脏病在食品方面,L-天冬氨酸作为食品添加剂可改善食品风味,L-天冬氨酸与D-丙氨酸可合成L-天冬酰-D-丙氨酸甲酯(其甜度为蔗糖的150倍),是一种新型甜味剂在化工方面,L-天冬氨酸还可以作为制造合成树脂的原料,其衍生物还可以合成量型表面活性剂以及制造化妆品工业上生产L-天冬氨酸以往采用化学合成法和微生物发酵法随着固定化酶和固定化细胞技术的不断完善和发展,人们开始改用含有天冬氨酸酶的固定化细胞直接将延胡索酸铵转化成L-天冬氨酸来实现工业化生产L-丙氨酸(L-Alanine)是一种脂肪族的非极性氨基酸,是丙酮酸代谢体系的非必需氨基酸,在血液中含量最多,与糖代谢密切相关,使转氨反应中重要的氨基供体,具有重要的生理功能;同时又是一种重要的氨基酸类药物,为多种复方氨基酸输液的重要组成成分,并可作多种医药中间体本实验用卡拉胶包埋天冬氨酸酶产生菌和L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌制成固定化细胞,利用生物反应器,可连续生产L-天冬氨酸和L-丙氨酸【实验材料】1.器材
(1)水浴振摇培养箱1台
(2)磁力搅拌器1台
(3)HPLC1台
(4)三角烧瓶250ml5个
(5)抽滤瓶1个
(6)离心机1台
(7)布式漏斗2只
(8)恒温水浴锅1台
(9)酶柱1根
(10)烧杯1000ml1个
(11)烧杯500ml2个
(12)烧杯250ml2个
(13)超级恒温水浴1台
(14)恒流泵1台
(15)高压灭菌锅1个
(16)锋利小刀1把
(17)试管12支2.试剂
(1)菌种
(2)玉米浆
(3)延胡索酸铵
(4)PLP(5-磷酸吡哆醛)
(5)牛肉浸膏
(6)KH2PO4
(7)MgSO4·7H2O
(8)浓氨水
(9)氯化钾
(10)氯化镁
(11)浓硫酸
(12)95%乙醇
(13)L-天冬氨酸标准品
(14)延胡索酸标准品
(15)L-丙氨酸标准品【实验方法】1.细菌的培养及菌体制备接种1ml对数生长期天冬氨酸酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已经灭菌的培养基1%延胡索酸铵,2%玉米浆,2%牛肉浸膏,
0.5%KH2PO4,
0.05%MgSO4•7H2O,pH
7.0,37℃振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,20min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤1次,离心收集菌体,置冰箱备用接种1ml对数生长期L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌种至250ml三角烧瓶中,内含50ml已灭菌的培养基(
1.5%L-谷氨酸钠,
0.5%富马酸铵,1%富马酸钠,
3.0%玉米浆,2%蛋白胨,
0.05%KH2PO4,
0.01%MgSO4•7H2O,pH
7.0),37℃振摇培养24h,培养液离心(3000r/min,20min)倾出上清液,再用生理盐水洗涤一次,离心收集菌体,置冰箱备用2.固定化细胞的制备
(1)天冬氨酸酶产生菌的固定化将4g湿菌体悬浮于4ml生理盐水中,置45℃恒温水浴保温,
0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中,加热至70-80℃使之溶解,再降温至45℃,两者于45℃混匀,混合物置4℃冰箱放置30min,将凝胶在100ml
0.3mol/LKCl溶液中浸泡4h,然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒经生理盐水洗涤后,将固定化细胞置于1mol/L延胡索酸铵中,于37℃活化24h,即可使用
(2)L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌的固定化将5g湿菌体悬浮于5ml生理盐水中,置45℃恒温水浴保温,
0.8g卡拉胶于17ml生理盐水中,加热至70-80℃使之溶解,降温至45℃,两者于45℃混匀,混合物置4℃冰箱放置30min,将凝胶在100ml
0.3mol/LKCl溶液中浸泡4h,然后切成3mm×3mm×3mm的立方体颗粒用
0.1mol/L甘氨酸充分洗涤,在1mol/L天冬氨酸铵(含
0.1mol/LPLP)底物中,于37℃活化24h,即可使用3.酶活力测定
(1)湿菌体天冬氨酸酶活力的测定取
0.5g湿细胞悬浮于2ml蒸馏水中,加入30ml
1.0mol/L延胡索酸铵,内含1mmol/LMgCl2,1%TritonpH
9.0,37℃搅拌反应30min,煮沸终止反应,1200rpm5min离心后,稀释反应上清液于240nm处测定吸收值,按延胡索酸残余量计算酶活力,一个酶活力单位定义为在测定条件下,每小时每克细胞转化生成1µmol天冬氨酸所需的酶量
(2)固定化细胞的天冬氨酸酶活力的测定取相当于
0.5g天然细胞的固定化细胞,置于30ml
1.0mol/L延胡索酸铵,内含1mmol/LMgCl2,37℃搅拌反应30min,迅速过滤除去固定化细胞,分离反应液,经稀释后于240nm处测定延胡索酸残余量,并计算每克固定化细胞的酶表现活力总活力用每克固定化细胞,单位小时内所产生的L-天冬氨酸的微摩尔数表示(µmol/h·g·cell)
(3)延胡索酸(即富马酸)标准曲线的绘制延胡索酸在240nm处有特征峰吸收,在一定范围内与延胡索酸含量成线性关系,且反应系统中无干扰标准曲线的绘制试管号123456延胡索酸标准液(50µg/ml)012345蒸馏水543210OD240nm根据测定的吸收值,作出标准曲线或回归方程
(4)湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的测定取1g湿菌体悬浮于10ml生理盐水中,取
0.5ml悬浮液,加入含
0.1mmol/LPLP的1mol/L天冬氨酸铵的底物2ml(pH
6.0)于37℃反应30min,煮沸终止反应生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定展开剂选用正丁醇:醋酸:水=4:1:1,显色剂用
0.5%茚三酮溶液,烘干后,将显色斑点剪下用
0.1%CuSO4·5H2O:75%乙醇=2:38洗脱后,于520nm处比色,再从标准曲线上读得L-丙氨酸的含量L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力的的定义为每克细胞每小时生成1µmol/L-丙氨酸为1个酶活力单位(U)
(5)固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力的测定取6g固定化细胞(相当于1g的湿细胞)加入20ml生理盐水,于37℃保温,加入含
0.1mmol/LPLP的1mol/LL-天冬氨酸铵4ml,pH
6.0,于37℃反应30min,迅速过滤除去固定化细胞,分离反应液,生成的L-丙氨酸用纸层析法定量测定
(6)L-丙氨酸标准曲线的绘制按
(5)法用纸层析法定量测定L-丙氨酸的含量与显色斑点脱色后在520nm处比色的关系标准曲线的绘制试管号123456L-丙氨酸标准液(40µg/ml)012345蒸馏水543210OD520nm根据测定的吸收值,作出标准曲线或回归方程4.L-丙氨酸的制备分别将6g天冬氨酸酶和L-天冬氨酸β-脱羧酶的固定化细胞装入带夹套的固定化生物反应器内(Φ
1.5cm×30cm),
1.0mol/L延胡索酸铵(含1mmol/LMgCl2,pH
9.0)底物,以恒流速度通过天冬氨酸酶固定化细胞柱,SV=
0.87h-1,然后将流出液通过L-天冬氨酸β-脱羧酶固定化细胞柱,并加
0.1mmol/LPLP和28%的氨水,使pH
6.0,流出液用纸层析法计算L-丙氨酸的量,并计算转化率(L-丙氨酸转化率=L-丙氨酸浓度/延胡索酸铵浓度×100%)【思考题】1.分别求出湿菌体天冬氨酸酶活力、固定化细胞的天冬氨酸酶活力及湿菌体L-天冬氨酸β-脱羧酶产生菌活力、固定化细胞的L-天冬氨酸β-脱羧酶活力2.分别求出两种菌体包埋后的活力回收率3.分别求出L-天冬氨酸和L-丙氨酸的转化率第二节多肽及蛋白质类药物实验二十三重组水蛭素Ⅲ的制备注此实验内容来自校企合作课题,部分成果已申请专利【实验目的】1.了解以基因工程菌种E.coli/pHV3为材料进行工程菌发酵培养、外分泌表达小分子多肽类药物重组水蛭素Ⅲ及表达蛋白制备和抗凝血酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理2.掌握基因工程菌发酵培养条件、分泌表达目的蛋白及表达蛋白分析鉴定的操作技术方法【实验原理】水蛭素hirudin是一类由医用水蛭Hirudo唾液腺中分泌出的低分子量的酸性单链多肽,1904年,Markwardt首先将其分离纯化,并于1970年确定它是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂,即使在较低的浓度也可充分地阻止血液的凝固药理学及临床研究表明,水蛭素能有效地预防静动脉血栓的形成及弥散性血管凝结,不引起过敏、免疫反应,不会造成循环功能障碍可用于治疗不稳定性心绞痛USA、急性心肌梗死AMI、血管成形术、术后血栓形成、血液透析、体外循环、弥散性血管内凝血DIC等,是很好的抗凝抗栓药物水蛭素的分子质量约为7000Da,含有65~66个氨基酸残基,水蛭素肽链的二级和三级结构对其抗凝活性起决定性作用,其N端的3个二硫键则是决定分子二级和三级结构及其稳定性的关键,将二硫键氧化,或分子发生蛋白降解,则失去抗凝活性若C端羧基被酯化,或失去C端氨基酸,也会失去与凝血酶结合的能力水蛭素干燥状态下稳定,室温下水中可稳定存在6个月,80℃下加热15min不被破坏pH值升高则稳定性下降,在
0.1mol/L盐酸溶液或
0.1mol/L氢氧化钠溶液中可稳定15min水蛭素不被胰蛋白酶水解,对α-糜蛋白酶也有一定的耐受性,但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶A则可使之失去活性由于天然水蛭素来源非常困难,每条水蛭只含20μg的水蛭素,不能满足临床应用为此,国外多家公司及研究单位从80年代末就开始研究采用基因工程技术生产重组水蛭素目前,在国外已上市的水蛭素产品有Hoechs公司的重组水蛭素Lepirudin商品名Refludon,Novartis公司的重组水蛭素产品Desirudin1997年,本院合成了重组水蛭素Ⅲ基因并构建了大肠杆菌外分泌表达体系,分泌型重组水蛭素Ⅲ基因工程菌的表达产物重组水蛭素Ⅲ(recombinehirudinⅢ简写为rHV3)相对分子质量为
7010.8Da此工程菌为外分泌表达体系,其基因表达产物rHV3易于纯化但该表达系统会产生一些杂质蛋白和色素,影响下游的分离纯化提取纯化工艺采用了大孔吸附树脂疏水层析和离子交换层析方法较好地解决了杂质蛋白和色素的分离大孔吸附树脂作为rHV3的第一个提取步骤,高分子量杂蛋白被基本去除,而离子交换则是去色素的关键吸附及离子交换时采用合适的洗脱条件是提高活力收率的重要因素该纯化方法工艺简单、rHV3收率和纯度均较高,适用于rHV3的大规模制备本实验以此工程菌为材料,先进行工程菌发酵培养,再将发酵液经离心,从工程菌发酵液上清中分离纯化rHV3发酵上清液经过大孔吸附树脂HP20处理后,用DEAE-52阴离子纤维素交换层析,得到较高纯度表达产物rHV3rHV3进行抗凝血酶活力分析和15%SDS-PAGE电泳分析rHV3生物活性的测定参照Markwardt的凝血酶滴定方法进行比活力测定方法为精确称取纯化产物10mg,溶解于1mlH2O中,采用Lowry法测定蛋白质含量,并测定抗凝血酶活力,rHV3比活力=抗凝活力ATU/蛋白含量【实验材料】1.器材
(1)玻璃层析柱
1.6cm×20cm或/和
2.6cm×40cm1套
(2)恒流泵1台
(3)自动部分收集器1台
(4)记录仪1台
(5)恒温水浴锅1台
(6)高速台式离心机1台
(7)冷冻离心机1台
(8)旋涡混合器1台
(9)752紫外分光光度计1台
(10)稳压电泳仪1台
(11)摇床1台
(12)垂直板式电泳槽1套
(13)电炉1只
(14)秒表1只
(15)高压灭菌锅1台
(16)电磁搅拌器1台
(17)酸度计1台
(18)发酵罐1台
(19)微量移液器(20μl,200μl,1000μl)各1支
(20)标准净化工作台1台
(21)真空泵和真空干燥器1套
(22)电子天平精确到10mg1台
(23)照相器材1套
(24)基因工程菌菌种E.coli/pHV3为本实验室保存
(25)大孔吸附树脂HP20若干
(26)DEAE-52阴离子纤维素若干
(27)Eppendorf离心管架1只
(28)96孔酶标板1只
(29)脱色摇床1台
(30)灭菌的移液器枪头若干
(31)灭菌的Eppendorf管(
1.5ml微量离心管)若干
(32)试剂瓶(5000ml,1000ml,500ml,250ml,100ml)若干
(33)量筒(2000ml,1000ml,100ml,10ml)各1只
(34)烧杯(2000ml,1000ml,500ml,250ml,50ml)各3只
(35)布氏漏斗(8cm1只)和吸滤瓶(1000ml)各1只
(36)滤纸若干
(37)玻棒2根
(38)试管5ml,150支;15ml,16支
(39)三角瓶(250ml)2只
(40)大塑料桶1只
(41)石英比色杯1对2.试剂重组水蛭素Ⅲ制备和抗凝血酶活力
(1)培养基种子培养基(LB液体培养基)1%胰蛋白胨(Tryptone),
0.5%酵母提取物(YeastExtract),1%NaCl,加蒸馏水配制,pH
7.0,分装,高压蒸汽(
1.03×105Pa)灭菌20min接种前在无菌条件下加入抗生素,氨苄青霉素的终浓度为100μg/ml发酵培养基1%蛋白胨,
0.5%酵母提取物,4%谷氨酸钠,10%麦芽汁pH
6.5,摇瓶装液量为12%;
(2)氨苄青霉素Amp;
(3)
0.5%牛血纤维蛋白原
0.05mol/LTris-HCl缓冲液pH
7.4配制;
(4)凝血酶溶液500NIH单位加5ml蒸馏水;
(5)低分子量标准蛋白
17.5~94KDa;
(6)20mmol/L乙酸;
(7)盐酸;
(8)异丙醇;
(9)20mmol/L哌嗪;
(10)氯化钠;
(11)三(羟甲基)胺基甲烷(Tris);
(12)乙醇;
(13)氢氧化钠;
(14)谷氨酸钠(或含99%谷氨酸钠的味精);15%SDS-PAGE电泳分析同实验九【实验方法】1.工程菌发酵培养
(1)从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素终浓度为60μg/ml的LB液体培养基中,37℃,摇床转速220r/min,培养18h
(2)摇瓶培养再按3%接种量转接于发酵培养基中,37℃,250r/min,30h,离心收集上清
(3)补料-批式发酵30L的发酵罐装入15L发酵培养基,初始pH值为
6.5,121℃下灭菌20min,待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为60μg/ml,接入种子液1000ml,37℃培养,调节搅拌速度及通气量,控制溶氧在10~20%,通过补充酸、碱物质控制pH在
6.0~
7.5,同时通过流加葡萄糖或蛋白胨调节培养基中营养成分,延长活力表达时间培养9~16h2.重组水蛭素Ⅲ分离纯化制备(1发酵上清液制备下罐后发酵液经12000r/min高速离心除去菌体,收获发酵上清液采用Lowry法和Markwardt的凝血酶滴定法分别检测目的蛋白重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS–PAGE电泳分析计算收率(2大孔吸附层析大孔吸附树脂HP20处理装柱,用20mmol/L乙酸平衡调节发酵上清液pH值至
5.0~
6.0,于抽气泵中脱去气泡,以1ml/min的流速将样品上柱依次用20mmol/L乙酸洗涤和50mmol/LpH
8.5Tris-HCl洗涤,再用含10~40%异丙醇的20mmol/L乙酸梯度洗脱,分部收集器收集,
1.5ml/min,每管收集6ml,测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性,绘制洗脱曲线收集显示活性组分,检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析计算收率大孔吸附柱处理方法首先用蒸馏水漂洗,去除漂浮的细小颗粒,再用95%乙醇反复浸泡使其充分溶胀和初步除杂然后用95%乙醇在布氏漏斗中淋洗至乙醇在254nm的紫外吸收值小于
0.03为止再用蒸馏水洗尽乙醇最后分别用5%盐酸和5%氢氧化钠浸泡3h,均分别洗至pH值为中性(3DEAE-52阴离子交换柱层析DEAE-52阴离子纤维素柱经20mmol/L哌嗪平衡大孔吸附层析产物液样品经10mmol/L哌嗪调节至pH
6.0后上样用平衡缓冲液洗涤至基线平稳再用含
0.1~
0.4mol/LNaCl的20mmol/L哌嗪pH
6.0溶液梯度洗脱,分部收集器收集,
1.5ml/min,每管收集6ml,测定每管的A280值和重组水蛭素Ⅲ活性,绘制洗脱曲线收集显示活性组分,冷冻干燥后即得高纯度的重组水蛭素Ⅲ冻干粉检测重组水蛭素Ⅲ含量和活性及进行15%SDS-PAGE电泳分析计算收率3.重组水蛭素Ⅲ生物活性测定 于酶标板小孔中加
0.5%牛血[
0.05mol/LTris-HCl缓冲液pH
7.4配制]200μl,再加入重组水蛭素Ⅲ溶液10~100μl,充分混匀用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液100NIH单位,时间间隔为1min,若在1min内纤维蛋白原发生凝固,即说明已达滴定终点由凝血酶的消耗量换算出重组水蛭素Ⅲ的单位数由于水蛭素与凝血酶是1:1结合,故每消耗一个凝血酶单位NIH相当于一个抗凝血酶单位ATU4.重组水蛭素Ⅲ比活力测定方法精称纯化产物10mg,溶解于1mlH2O中,采用Lowry法测定蛋白质含量,并测定抗凝血酶活力,经以下公式换算即得单位质量的rHV3比活力rHV3比活力=抗凝活力ATU/蛋白含量5.15%SDS-PAGE电泳分析样品纯度电泳方法同实验九(1按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶,浓度15%(2将发酵液上清、解吸液和离子交换洗脱液样品处理后,进行15%SDS-PAGE电泳析(3电泳2~3h后,取出凝胶,用
0.15%考马斯亮兰-R250进行染色过夜后倾出染液,不断脱色,起初每20min换液1次,1h后每小时换液1次,直到区带明显,画出电泳区带图谱6.结果处理
(1)用箭头图表示重组水蛭素Ⅲ制备的操作流程
(2)绘制洗脱曲线
(3)重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析重组水蛭素Ⅲ的纯化过程分析纯化步骤总蛋白mg总活力ATU比活ATU/mg纯化倍数收率%A.发酵上清液B.大孔吸附层析C.DEAE-52纤维素柱层析(4电泳图谱分析【思考题】1.影响重组水蛭素Ⅲ纯度和收率的因素有哪些?如何加以控制?2.试说明电泳图谱,并用电泳图谱判断所制得的重组水蛭素Ⅲ的纯度3.如何在原核内成功表达小分子多肽类药物而不被宿主内蛋白酶水解?实验二十四酸醇提取法制备猪胰岛素注此实验内容来自校企合作课题【实验目的】1.学习胰岛素的制备方法2.了解胰岛素的理化性质及其在制备方面的应用3.掌握酸醇提取法制备猪胰岛素的技术【实验原理】胰岛素(insulin)是动物胰腺中兰氏小岛β-细胞所分泌的一种动物激素,在体内具有降低血液中葡萄糖含量和调节血糖平衡的作用医疗上主要用于治疗糖尿病,也是生化工程中作为研究蛋白质结构与功能的常用材料胰岛素共51个氨基酸,由A、B两条肽链组成A链含21个氨基酸,B链含30个氨基酸,两条肽链之间借两个二硫键联结,A链的第6与第11位氨基酸之间也有一个二硫键人胰岛素分子量为5734Da,等电点为pH
5.6在酸性环境(pH
2.5~
3.5)较稳定,在碱性溶液中极易失去活力,可形成锌、钴等胰岛素结晶又由于其分子中酸性氨基酸较多,可与碱性蛋白如鱼精蛋白等结合,形成分子量大、溶解度低的鱼精蛋白锌胰岛素在显微镜下观察呈正方形或偏斜方形六面体结晶胰岛素不溶于水和乙醇、乙醚等有机溶剂,但易溶于稀酸和稀碱的水溶液,也能溶于酸性或碱性的稀乙醇和稀丙酮中胰岛素一般由动物脏器提取,其生产方法有酸醇提取减压法、分级提取锌沉淀法和磷酸钙凝胶、DEAE-纤维素及离子交换树脂吸附法本实验介绍酸醇提取减压浓缩法由猪胰提取胰岛素的方法【实验材料】1.器材
(1)组织捣碎机1台
(2)布氏漏斗10cm1个
(3)抽滤瓶1000ml1个
(4)抽气泵1台
(5)剪刀1把
(6)烧杯400ml2个200ml2个100ml1个
(7)纱布25cm×25cm1块
(8)玻璃棒(大)2根玻璃棒(小)2根
(9)量筒500ml1只100ml1只10ml1只
(10)容量瓶100ml1只
(11)分液漏斗250ml1只
(12)离心机1台
(13)真空干燥器及真空泵1套
(14)温度计100℃量程1根
(15)pH试纸各种量程规格1套2.试剂
(1)86%乙醇、68%乙醇
(2)草酸
(3)6mol/L硫酸溶液
(4)浓氨水、2mol/L氨水、4mol/L氨水
(5)氯化钠
(6)冷丙酮
(7)20%、
6.5%醋酸锌溶液
(8)2%、10%柠檬酸溶液
(9)
0.01mol/L盐酸
(10)
0.1mol/L磷酸二氢钠溶液
(11)乙醚
(12)乙腈【实验方法】1.操作方法1提取取冻胰块100g用匀浆机绞碎后加入
2.3~
2.6倍的86%乙醇w/w,5%冻胰重的草酸(少许硫酸调至pH
2.5~
3.0),在10~15℃温度下搅拌提取3h过滤或离心取上清,滤渣再用l倍量68%乙醇和
0.4%冻胰重的草酸及少许硫酸按上法提取2h,同上法分离合并乙醇提取液2碱化、酸化提取液在不断搅拌下加入浓氨水调溶液pH为
8.0~
8.4(液温10~15℃),立即压滤或离心除去碱性蛋白澄清液及时加6M硫酸酸化至pH为
3.4~
3.8,降温至0~5℃,静置4h以上,使酸性蛋白充分沉淀3减压浓缩离心取上清液,在30℃以下真空浓缩除去乙醇,浓缩至浓缩液比重为
1.04~
1.06(约为原来体积的1/9~l/10)为止4去脂、盐析将浓缩液转入烧杯,于10min内加热至50℃,立即用冰盐水冷却降温至5℃,转置分液漏斗静置3~4h,使油层分离分出下层清液(上层油脂可用少量蒸馏水洗涤回收胰岛素),调pH为
2.3~
2.5,于20~25℃在搅拌下加入23%W/V固体氯化钠,搅拌盐析,静置数小时,盐析物即为粗品胰岛素(含水量约为40%)5精制
①除酸性蛋白取粗制胰岛素,按其干重加入7倍量冰冷蒸馏水溶解(7倍量水应包括粗制胰岛素中所含水量),再加入3倍量的冷丙酮(按粗品计)并用2mol/L氨水调节pH为
4.2~
4.3,然后按耗用的2mol/L氨水量补加丙酮使溶液中水和丙酮的比例为7:3充分搅拌后,低温放置过夜,使溶液冷至5℃以下,次日在5℃以下用离心分离法或用布氏漏斗过滤法将沉淀分离
②锌沉淀在滤液中加入2mol/L氨水调pH到
6.2~
6.4,按溶液体积加入
3.6%醋酸锌溶液(浓度为20%),再用2mol/L氨水调节使最终pH为
6.0,低温放置过夜,次日用布氏漏斗过滤,分离沉淀
③结晶经丙酮脱水后按每克精品(干重)加入2%柠檬酸50ml、
6.5%醋酸锌2ml,丙酮16m1,并用冰水稀释至100ml,置冰浴中速冷至5℃以下,用2M氨水调pH
8.0,迅速过滤滤液立即用10%柠檬酸溶液调pH
6.0,然后补加丙酮使整个溶液体系保持丙酮含量为l6%在10℃下缓慢搅拌2~5h后放入3~5℃冰箱72h使之结晶,前48h内需用玻璃棒间歇搅拌,后24h静置不动这一步骤关系到结晶优劣,须仔细操作在显微镜下观察,外形为正方形或扁斜方形六面体结晶结晶离心收集,并用毛刷小心刷去晶体上面所覆灰黄色无定形沉淀,用蒸馏水或醋酸铵溶液洗涤,再用丙酮、乙醚脱水,离心后,在五氧化二磷真空干燥箱中干燥,即得结晶胰岛素,效价每毫克应在25单位以上6检测取对照品及供试品适量,分别加
0.01mol/L盐酸溶液制1ml中含40单位的溶液,照高效液相色谱法试验,以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂5µm;柱温40℃;以
0.1mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值为
3.0)-乙腈73:27或适宜比例的混合液(含
0.1mol/L硫酸钠)为流动相;检测波长为214nm;流速为1ml/min取供试品溶液及对照品溶液各20μl注入液相色谱仪,记录主峰的保留时间,供试品的主峰保留时间应与同种属对照品的主峰保留时间一致7效价测定将效价确定的Insulin标准品用
0.01mol/L盐酸液配制并稀释成
40、
30、
20、
10、1和
0.5U/ml溶液样品原料以
0.01mol/L盐酸液配制并稀释成
1.5mol/ml溶液进样测定效价计算以主峰面积为纵坐标,Insulin浓度为横坐标进行线性回归,计算而得【思考题】1.提取过程中,影响胰岛素活性/效价的因素有哪些?如何提高提取率?2.制备猪胰岛素的原理及其应注意的问题实验二十五多肽缩宫素的Fmoc固相合成法注此实验内容来自校企合作课题【实验目的】1.学习多肽固相合成的方法及其分离纯化操作2.了解多肽固相合成的基本原理以及合成中功能基团的侧链保护策略3.掌握缩宫素Fmoc固相合成法的基本原理及其注意事项【实验原理】1963年Merrifield创建并发展了多肽固相合成(solid-phasepolypeptidesynthesis)方法之后,多肽研究领域发生了划时代的变化固相方法以快速简便的操作和高产率显示了无可比拟的优越性,应用该方法几乎可以随心所欲地合成任何多肽缩宫素oxytocin是垂体后叶激素的主要成分之一,临床主要用于引产、产时子宫收缩乏力、产后出血、子宫复位不良及月经过多等,是由8种氨基酸按如下所示的顺序排列,通过肽键结合而成的9肽化合物 SS C端-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-N端Fmoc固相合成法制备缩宫素的原理是首先将其所含的8种氨基酸分别制成Nα-芴甲氧羰基Fmoc氨基酸,然后从C端开始,将氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性高分子树脂相连,就以这一氨基酸的氨基作为合成的起点,使其同排列顺序中相邻的氨基酸的羧基发生酰化反应,形成酰胺键(肽键),然后再让这一包括两个氨基酸的树脂肽的氨基与下一个氨基酸上的羧基形成肽键,并不断重复这一过程,即可逐渐延长肽键,直至缩宫素的N端形成为止用固相方法合成具有特定氨基酸顺序的多肽必须满足3个条件一是通常把要合成多肽的羧基端键合到固相载体上,然后从氨基端逐步增长肽链;二是需要对暂不参与形成酰胺键的氨基加以保护,同时对氨基酸侧链上的活性基团也要保护,反应完成后再将保护基团除去;三是对参与形成酰胺键的羧基必须进行活化【实验材料】1.器材
(1)多肽合成反应器1台
(2)旋转蒸发仪1台
(3)高速冷冻离心机1台
(4)HPLC1台
(5)真空泵1台
(6)电子天平1台
(7)电动搅拌机1台
(8)电热恒温干燥箱1台
(9)圆底烧瓶50ml1个10量筒10ml1个100ml1个11布氏漏斗1个2.试剂
(1)Fmoc保护氨基酸:Fmoc-CysTrt-OH;Fmoc-TyrtBu-OH;Fmoc-AsnTrt-OH;Fmoc-GlnTrt-OH;Fmoc-Ile-OH;Fmoc-Pro-OH;Fmoc-Leu-OH;注Fmoc–氨基酸Trt-OH表示氨基酸的α-氨基和侧链基团已分别被Fmoc和Trt(三苯甲基)所保护
(2)HOBt
(3)DIC(二异丙基碳二亚胺)
(4)TFA(trifluoroaceticaci)
(5)DMSO
(6)哌啶经重蒸后使用
(7)DMF(二甲基甲酰胺)
(8)茚三酮
(9)CysTrt-2-ChlorotritylResin(半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂)【实验方法】1.粗品制备1称取约含
0.2mmol半胱氨酸的半胱氨酸-2-氯三苯甲基树脂,用10mlDMF溶胀30min,抽滤活化Fmoc-氨基酸向
0.3mmolFmoc-TyrtBu-OH中加入10ml溶有
0.33mmolDIC和
0.45mmolHOBt的DMF溶液,摇匀静置活化20min2缩合将活化好的Fmoc-氨基酸溶液加到盛有上述树脂的反应器皿中,室温下缓慢摇动反应2h,抽滤,用DMF洗3次,每次5ml3脱除Fmoc保护将10ml含20%哌啶的DMF溶液加到盛有上述树脂的反应器中室温下反应30min除去Fmoc保护基团,抽滤,然后用5mlDMF洗涤3次采用同样的试剂用量和操作步骤,按缩宫素分子序列顺序依次用下一种保护型氨基酸重复上面的接肽反应,直到最终形成所需的多肽序列4侧链脱保护及多肽链脱离树脂向肽-树脂样品中按15ml/g树脂的比例加入K试剂[三氟乙酸/二氯甲烷/1,2-乙二硫醇/苯甲醚/水80/10/5/3/2,v/v],室温下摇动反应4h抽滤后用1ml~2mlTFA分两次洗涤树脂,洗涤液并入裂解液中将裂解液旋转蒸发浓缩至小体积,然后将裂解液滴入100ml冷乙醚中得到多肽沉淀,将沉淀冷冻离心分离5成键反应将上述沉淀溶解于10ml25%的DMSO水溶液中,摇匀并在室温下静置24h形成二硫键,然后将溶液冻干得到粗品氧化产物2.精制缩宫素粗品产物通过SephadexG-15凝胶过滤层析,用25%的醋酸水溶液洗脱进行纯化洗脱产物采用制备型高效液相,经反相键合C18柱进行梯度洗脱最终纯化色谱条件为流动相由含
0.1%TFA的10%-75%的乙腈溶液在35min内进行梯度洗脱,流速为
1.5ml/min,检测波长为220nm3.检测粗品作为供试品溶液进行薄层层析检测,应只有一个清晰的斑点,薄层板采用G60-F254型硅胶板,溶剂展开系统取丁醇:醋酸:水=4:1:5的混合液的上清,或乙腈:水=5:1的混合溶剂取本品作为供试品溶液,另取合成缩宫素对照品,加
0.9%氯化钠溶液制成每1ml中含5个单位或10个单位的对照品溶液照高效液相色谱法,以辛基硅烷键合硅胶为填充剂,
0.1mol/L磷酸二氢钠溶液-乙腈82:18为流动相,流速为
0.8ml/min,检测波长为220nm取供试品溶液与相同浓度的对照品溶液各20μl注入液相色谱仪,供试品与对照品主峰的保留时间应一致4.效价测定(大白鼠离体子宫法)本法系比较垂体后叶或合成缩宫素标准品S与供试品T引起离体大鼠子宫收缩的作用,以测定供试品的效价1溶液的配制
①标准品溶液的配制迅速精密称取垂体后叶标准品适量,注意避免吸潮,先加少量
0.25%醋酸溶液,仔细研磨,移至硬质大试管中,再精密加
0.25%醋酸溶液使成每1ml中含缩宫素1单位的溶液管口轻放一玻璃塞,浸入沸腾的水中,持续振摇,加热煮沸5min取出,迅速冷却,滤过,滤液分装于适宜的容器内,4~8℃贮存,如无沉淀析出,可在3个月内使用
②标准品稀释液的配制实验当日,精密量取垂体后叶标准品溶液适量或取合成缩宫素标准品,按标示效价加入
0.9%氯化钠溶液配成每1ml中含缩宫素1单位的溶液,按高低剂量组ds
[2],ds
[1]加
0.9%氯化钠溶液配成两种浓度的稀释液,一般高浓度稀释液可配成每1ml中含
0.01~
0.02单位,高低剂量的比值r一般不得大于1:
0.7调节剂量使低剂量能引起子宫收缩,一般在20~50mm;高剂量应不致使子宫收缩达到极限,一般为50~85mm,且高低剂量所致子宫的收缩应有明显差别
③供试品溶液与稀释液的配制按供试品的标示量或估计效价A[T],照标准品溶液与其稀释液的配制法配成,高低两种浓度的稀释液,其比值r应与标准品相等,供试品和标准品高低剂量所致的反应均值应相近
④子宫肌蓄养液的配制试验当日,取氯化钠9g、氯化钾
0.42g、氯化钙(按无水物计算)
0.06g与葡萄糖
0.5g,加水700ml使溶解,另取碳酸氢钠
0.5g,加水约200ml溶解后,缓缓倾注于前一溶液中,边加边搅拌,最后补加蒸馏水至1000ml2供试用动物取健康合格的成年雌性大鼠,断乳后即与雄鼠隔离,出生后不超过3个月,体重160~240g试验当日,选择阴道涂片在动情前期的动物,也可用雌性激素处理使子宫涂片为动情前期或动情期的动物3检定法取选定的大鼠迅速处死,剖腹取出子宫,仔细分离附在子宫肌上的结缔组织,注意避免因牵拉使子宫肌受损在子宫分叉处剪下左右2条,取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部,上端用线与记录装置相连,以描记子宫收缩;浴杯中加入一定量的子宫肌蓄养液约30~50ml,连续通入适量空气蓄养液应调节至32~35℃之间并保持恒温±
0.5℃,子宫放入浴杯后,静置约15min,按次序准确注入等体积的标准品或供试品两种浓度的稀释液
0.3~
0.8ml,待子宫肌收缩至最高点开始松驰时(约60~90s),放去蓄养液并用蓄养液洗涤一次,再加入等量蓄养液,静置;相邻两次给药的间隔时间应相等(约3~5min,每次给药应在前一次反应恢复稳定以后进行标准品稀释液和供试品稀释液各取高低两个剂量ds
[2]、ds
[1]、d[T]
[2]、d[T]
[1]为一组,按随机区组设计的次序轮流注入每组4个剂量,重复4~6组测量各剂量所致子宫收缩的高度,照生物检定统计法(附录ⅩⅣ)中的量反应平行线测定法计算效价及实验误差本法的可信限率FL%不得大于10%【思考题】1.肽缩合反应中干扰最终产物分离纯化的原因是什么?解决上述问题可以从哪三方面来考虑?第三节核酸类药物实验二十六酵母RNA的制备和单核苷酸的离子交换柱层析分析注此实验内容来自校企合作课题【实验目的】1.学习以酵母为原料采用稀碱法制备RNA的原理和方法2.掌握离子交换法分离单核苷酸的原理和方法【实验原理】从微生物中提取RNA是工业上最实际有效的方法一些最常见的菌体,如啤酒酵母、纸浆酵母、石油酵母、面包酵母、百地霉等均含有丰富的核酸资源工业上制备RNA一般选用成本较低,适于大规模操作的稀碱法和浓盐法稀碱法是用氢氧化钠溶液,使细胞壁变性裂解,浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来如用稀碱法,需用酸中和然后除去菌体碎片,将pH调至RNA的等电点(pH
2.5),使RNA沉淀下来,该法的缺点是制备的RNA分子量较低核酸经酸、碱或酶水解可以产生各种核苷酸,核苷酸的可解离基团是第一磷酸基、含氮环上的-NH2和第二个磷酸基等,它们的解离常数(pK)和由此得到的等电点差异是进行离子交换层析分离的基础四种单核苷酸的解离常数和等电点见表1表1四种单核苷酸的解离常数(pKa)和等电点(pI)核苷酸第一磷酸基(pKa1)含氮环pKa2第二磷酸基pKa3等电点pI腺苷酸(AMP)鸟苷酸(GMP)胞苷酸(CMP)尿苷酸(UMP)
0.
90.
70.
81.
03.
72.
44.5—
6.
26.
16.
36.
42.
351.
552.65—在一定条件下,离子交换树脂对不同单核苷酸的吸附能力是不同的,因此选择适当类型的离子交换树脂,控制吸附及洗脱的条件便可分离各种单核苷酸为了增加单核苷酸在离子交换树脂上的吸附能力,需要控制条件使单核苷酸带上大量相应电荷,这主要是通过调节pH值,使单核苷酸的一些可解离基团(磷酸基、氨基、烯醇基)解离,同时应减少上柱溶液中除单核苷酸外的其它离子强度而洗脱时则相反,应使被吸附的单核苷酸的相应电荷降低,通常是增加洗脱液中竞争性的离子强度,必要时提高温度使离子交换树脂对单核苷酸的非极性吸附作用减弱RNA可被碱水解成2’-或3’-核苷酸可利用阳离子交换树脂(聚苯乙烯-二乙烯苯,磺酸型)或阳离子交换树脂(聚苯乙烯-二乙烯苯、季铵碱型)分离核苷酸本实验利用强碱型阳离子交换树脂(强碱型201×
8、强碱型201×
7、国产
717、Dowexl、AmberiteIRA-400或ZerolitFF)将各类核苷酸分开,测定核苷酸的紫外吸收光谱的比值O.D250/O.D
260、O.D280/O.
260、O.D290/O.D280对照标准比值表(表2),可以确定其为何种核苷酸【实验材料】1.试剂
(1)氢氧化钠(工业级);
(2)盐酸;
(3)95%乙醇;
(4)1mol/L甲酸取
21.4ml88%甲酸定容至500ml;
(5)1mol/L甲酸钠溶液称
32.15g甲酸钠用水溶液定容至500ml;
(6)
0.02mol/L甲酸取10ml1mol/L甲酸定容至500ml;
(7)
0.15mol/L甲酸取75ml1mol/L甲酸定容至500ml;
(8)
0.01mol/L甲酸-
0.05mol/L甲酸钠溶液(pH
4.44)取5ml1mol/L甲酸,25ml1mol/L甲酸钠溶液定容500ml;
(9)
0.01mol/L甲酸-
0.1mol/L甲酸钠溶液(pH
3.74)取50ml1mol/L甲酸,50ml1mol/L甲酸钠溶液定容至500ml;
(10)
0.3mol/L氢氧化钾溶液取
1.68g氢氧化钾用水溶液定容至100ml;
(11)2mol/L过氯酸取17ml70~72%过氯酸定容至100ml;
(12)1mol/L盐酸;
(13)
0.5mol/L氢氧化钠溶液;
(14)新鲜啤酒酵母;2.器材
(1)烘箱1台
(2)电动搅拌器1台
(3)桶或缸1个
(4)离心机1台
(5)滤布若干
(6)玻璃层析柱
1.1cm×20cm1根
(7)部分收集器1台
(8)紫外分光光度计1台
(9)恒温水浴1台【实验方法】1.RNA的制备取啤酒酵母于2~3℃条件下每天用水洗一次,共洗3~4次,最后沉淀1~2d倾去上清液,得酵母泥取酵母泥10g,置培养皿内,于105℃烘箱内烤干,测定其含水量这样的酵母泥一般含干酵母15%左右加水将酵母泥调成5~10%干重的菌悬液,再加入浓的氢氧化钠溶液,使氢氧化钠的最终浓度(即提取时的浓度)为1%在20℃条件下电动搅拌30~45min(如室温在20℃以下,可以适当延长时间)然后用6mol/L盐酸中和至pH
7.0,再搅拌10min,直火或用蒸汽迅速加热到90℃在该温度下保持10min,迅速下降到10℃以下,与低温处静置3~6d,沉出蛋白质和酵母残渣虹吸取出上清液向下层混浊液中加入1/3体积的水,搅匀,静置过夜于3000r/min离心20min左右,取出上清液将上述二次上清液(含RNA)合并用6mol/L盐酸调至pH
2.5(RNA的等电点),低温放置过夜离心收集RNA沉淀,用少量乙醇洗二次,干燥所得的RNA制品,色微黄,产率为4~5%,RNA含量可达60~70%2.单核苷酸的分离
(1)样品处理取20mg上述RNA制品,溶于2ml
0.3mol/L氢氧化钾溶液中,于37℃水解20h,RNA在碱作用下水解成单核苷酸,水解完成后,用2mol/L过氯酸溶液调至pH
2.0以下,以4000r/min离心10min,取上清液,用2mol/L氢氧化钠溶液调至pH
8.0,并用紫外分光光度计准确测得含量后待用
(2)离子交换柱的安装取内径
1.1~
1.2cm的层析柱,将处理好的强碱型阴离子交换树脂悬浮液一次倒入玻璃柱内,使树脂自由沉降至柱下部,用一小片圆滤纸盖在树脂面上缓慢放出液体,使液面降至滤纸片下树脂面上(注意在整个操作过程中防止液面低于树脂,当液面低于树脂表面时空气将进入,在树脂内形成气泡,妨碍层析结果)经沉积后离子交换树脂柱床高7~8cm
(3)加样将RNA水解液小心地用滴管加到离子交换树脂柱上,待样品液面降低到滤纸片内时,用50ml蒸馏水淋洗树脂柱碱基、核苷及其它不被阴离子交换树脂吸附的杂质均被洗出
(4)核苷酸混合物的洗脱收集蒸馏水洗脱液,在紫外分光光度计上测260nm处光密度,待洗脱液不含紫外吸收物质(光密度值低于
0.02)时,可用甲酸及甲酸钠溶液进行洗脱依次用下列洗脱液分段洗脱,500ml
0.02mol/L甲酸;500ml
0.15mol/L甲酸;500ml
0.1mol/L甲酸-
0.05mol/L甲酸钠溶液(pH
4.44);最后用500ml
0.1mol/L甲酸-
0.1mol/L甲酸钠溶液(pH
3.74)用部分收集器收集流出液,控制流速8ml/10min,8ml/管
(5)由层析柱所得各部分洗脱液的分析以相应浓度的甲酸或甲酸钠溶液作为空白对照,用紫外分光光度计测各管溶液在260nm波长处光密度值,以洗脱液体积(或管数)为横坐标,光密度值为纵坐标作图,分析各部分波峰位置根据各部分核苷酸在不同波长时光密度的比值(O.D250/O.D
260、O.D280/O.
260、O.D290/O.D280),对照标准比值(见表2)以及洗脱时的相应位置确定其为何种核苷酸由洗脱液的体积和它们在紫外部分的光密度值,计算各种核苷酸的含量附强碱型阴离子交换树脂201×8(聚丙乙烯-二乙烯苯,三甲胺季铵碱型,全交换量大于3毫克当量/克干树脂,100~200目)的处理方法用水浸泡并利用浮选法除去细小颗粒,使用时先用
0.5mol/L氢氧化钠溶液浸泡1h,以除去碱性溶液杂质然后用无离子水洗至中性再用1mol/L盐酸浸泡
0.5h,除去酸溶性杂质,再用无离子水洗至中性然后用1mol/L甲酸钠溶液浸泡,使树脂转变成甲酸型将树脂装入柱内,继续用1mol/L甲酸钠溶液洗,直至流出液中不含氯离子(用1%硝酸银溶液检查)最后用1mol/L甲酸洗,直至260nm处光密度值低于
0.02,并用蒸馏水洗至接近中性,即可使用表2部分核苷酸的物理常数核苷酸分子量pH异构体紫外吸收广谱性质克分子消光系数光密度比值ε260×10-3250/260280/260290/26027272727AMP
347.22’3’5’
14.
514.
514.
515.
515.
315.
30.
850.
850.
850.
80.
80.
80.
230.
230.
220.
150.
150.
150.
0380.
0380.
030.
0090.
0090.009GMP
363.22’3’5’
12.
312.
311.
612.
012.
011.
70.
900.
901.
221.
151.
151.
150.
680.
680.
680.
680.
680.
680.
480.
480.
400.
2850.
2850.28CMP
323.22’3’5’
6.
96.
96.
37.
757.
67.
40.
480.
460.
460.
860.
840841.
832.
002.
100.
860.
930.
991.
221.
451.
550.
260.
300.30UMP
324.22’3’5’
9.
99.
99.
99.
99.
99.
90.
790.
740.
740.
850.
830.
730.
300.
330.
380.
250.
250.
400.
030.
030.
030.
020.
020.03【思考题】
1.离子交换法分离单核苷酸的原理?
2.离子交换时常用的洗脱方式有哪些?各有何特点?实验二十七单核苷酸衍生物制备注此实验内容来自校企合作课题,部分成果已申请专利【实验目的】1.学习单核苷酸衍生物的生物制备方法2.了解单核苷酸衍生物制备的原理和一般方法【实验原理】核苷类药物传统的制造方法一般采用化学合成此方法缺点是步骤多、难度高、周期长且有异构体产生例如要对天然核苷进行化学修饰,往往需要先对碱基或核糖基团进行保护,此后还要去除保护基团,这样合成反应总收率将会降低用化学法将碱基与核糖缩合,还可能形成α-异构体影响产率酶法合成的优点在于可合成复杂的生物分子,与特定基团选择性结合,无需基团的保护,酶反应效率高,其底物可以是天然底物的类似物酶法合成核苷类药物的原理是利用微生物中产生的核苷磷酸化酶催化核苷、碱基转换反应,即由廉价供应的天然核苷为原料将其核糖基进行化学修饰后作为核糖基供体,利用核苷磷酸化酶或脱氧核糖转移酶为酶源,天然或杂环碱基为核糖基受体酶法合成核苷及其类似物,反应式如下当核苷1为尿苷、碱基1为5-氟尿嘧啶时即可转化合成5-氟尿苷【实验材料】1.器材
(1)高效液相色谱仪Agilent11001台
(2)摇床;1台
(3)紫外可见分光光度计1台
(4)台式水浴恒温振荡器1台
(5)高压灭菌锅1台
(6)台式高速离心机1台
(7)电子分析天平1台
(8)取液器1000μl、200μl各1支2.试剂
(1)牛肉浸膏
(2)酵母浸出汁
(3)蛋白胨
(4)硼砂
(5)乙二醇
(6)甘氨酸
(7)环己胺
(8)EDTA
(9)尿苷
(10)尿嘧啶
(11)5-氟尿嘧啶【实验方法】1.菌体培养经斜面活化的产气肠杆菌EMA-Z1先接种2环于摇瓶培养种子,在31℃、200r/min摇床中培养6~7h,以10%的接种量接种于摇瓶,于31oC、200r/min摇床培养13h2.菌体的制备培养液于3600r/min离心24min,所得菌体用10mmol/L的磷酸钠盐缓冲液(pH
7.0)重悬,于12000r/min离心5min,去除上清,用上述缓冲液重悬再以同样条件离心5min,洗去残余的培养基,去除上层黑色物质,所得湿菌体于4oC冰箱保存备用3.微生物转化10mmol/L尿苷(UR)、30mmol/L5-氟尿嘧啶(FU)、30mmol/L磷酸钠盐盐缓冲液NaOH调pH
7.8和含10g/100ml产气肠杆菌湿菌体的酶反应混合物于恒温水浴振荡器中55oC、150r/min振荡反应9h后加入
0.5倍体积的3mmol/L的HCl终止反应,12000r/min离心5min,取上清液,HPLC分析产物浓度4.检测方法Waters1525高效液相色谱仪,LichrospherC18柱
4.6mm×250mm,260nm检测流动相磷酸二氢钠:甲醇(90:10);流速1ml/min;进样量10μl【思考题】1.单核苷酸衍生物的生物制备方法有何特点2.实验中菌体的培养时间对转化反应有什么影响第四节酶类药物实验二十八胰弹性蛋白酶的制备及活力测定注此实验来自项目超氧化物歧化酶的分离纯化(省课题)的成果【实验目的】1.学习弹性蛋白酶制备的方法2.掌握弹性蛋白酶活性测定的原理【实验原理】弹性蛋白酶(ElastaseEC
3.
4.
4.7),又称胰肽酶E,是一种肽链内切酶,根据它水解弹性蛋白的专一性又称为弹性水解酶弹性酶为白色针状结晶,是由240个氨基酸残基组成的单一肽链,分子量为25900,等电点为
9.5其最适pH随缓冲体系而略异,通常为pH
7.4~
10.3,在
0.1mol/L碳酸缓冲液中为
8.8光吸收系数εlcm280nm=
5.74×104,E1cm1%280nm=
22.2(
0.1mol/L氢氧化钠);εlcm280nm=
5.23×104,E1cm1%280nm=
20.2(
0.05mol/LpH
8.0乙酸钠)结晶弹性酶难溶于水,电泳纯的弹性酶易溶于水和稀盐酸溶液(可达50mg/ml),在pH
4.5以下溶解度较小,增加pH可以增加溶解度弹性酶在pH
4.0~
10.5,于20℃较稳定,pH<6.0稳定性有所增加,冻干粉于5℃可保存6~12个月在-10℃保存更为稳定弹性蛋白唯有弹性酶才能水解弹性酶除能水解弹性蛋白外还可水解血红蛋白、血纤维蛋白等许多抑制剂能使弹性酶活力降低或消失,如10-5mol/L硫酸铜,7×10-2mol/L氯化钠可抑制50%酶活力,氰化钠、硫酸铵、氯化钾、三氯化磷也有类似作用上述抑制作用一般多为可逆另外大豆胰蛋白酶抑制剂、血清或肠内非透析物等也有抑制作用其它如硫代苹果酸、巯基琥珀酸、二异丙基氟代磷酸等均能强力抑制酶活力弹性酶广泛存在于哺乳动物胰脏,弹性酶原合成于胰脏的腺泡组织(Micin),经胰蛋白酶或肠激酶激活后才成为活性酶本实验以新鲜猪胰脏为原料进行提取,然后再用离子交换层析法进行纯化,得到弹性酶所得产品以刚果红弹性蛋白为底物采用比色法测其活力,【实验材料】1.器材1组织捣碎机1台2电动搅拌器1台3布氏漏斗10cm1只4吸滤瓶1000ml1只5抽气泵1台6剪刀1把7烧杯800ml1只8烧杯400ml1只9绸布25cm×25cm1块10量筒500ml1只100ml1只11玻璃棒(大)2根12玻璃棒(小)6根13试管10ml18支14吸量管5ml18支1ml2支15721型分光光度计1台16乳钵10cml只17真空干燥器及真空泵1套2.试剂
10.1mol/LpH
4.5醋酸缓冲液NaAc·3H2O
5.85克与36%醋酸溶液
9.51ml(冰醋酸
3.42ml)溶于水,稀释至1000ml,pH计校正
21.0mol/LpH
9.3氯化铵缓冲液
26.8克氯化铵溶于500ml水中,用浓氯水调整至pH
9.33pH
8.8硼酸缓冲液取
3.72克硼酸和
13.43克硼砂溶于水中,稀释至1000ml,pH计校正4pH
6.0磷酸缓冲液取KH2PO
46.071克,NaOH
0.215克溶于1000ml水,pH计校正52mol/L醋酸6丙酮7刚果红弹性蛋白8弹性酶纯品9AmberliteCG50树脂【实验方法】1.预处理及细胞破碎取冻胰脏,剪去脂肪,切成小块称取100g加入50ml醋酸缓冲液(内含
0.05mol/LCaC12),用组织捣碎机搅碎,静置活化2.提取再加入200mlpH
4.
50.1mol/L醋酸缓冲液,25℃搅拌(机械搅拌)提取
1.5h离心(3000r/min,15min)除去上层油脂及沉淀用绸布挤滤,保留滤液3.树脂吸附滤液中加100ml蒸馏水及40g(抽干重)经过处理的AmberliteCG50树脂,于20~25℃搅拌吸附
2.5h倾去上层液体,树脂用蒸馏水洗涤重复洗涤5~6次4.解析树脂中加50mllmol/LpH
9.3NH4C1液,搅拌洗脱lh洗脱过程中每隔10min测一次pH,整个过程须保证
5.2<pH<
6.0,否则用氨水调节经布氏漏斗滤过的洗脱液调节至pH
7.0,置冰箱或冰盐浴预冷15min5.成品收集在-5℃条件下边搅拌边加入3倍体积冷丙酮,继续搅2min低温静置20min离心(3000r/min,15min)收集沉淀,将沉淀移入离心试管中,用10倍量冷丙酮分两次洗涤离心,再用5倍量乙醚洗一次,离心置真空干燥器内用P2O5干燥得弹性酶粉,称重6.活力测定活力单位定义在pH
8.8,37℃条件下作用20min,水解
1.0mg刚果红弹性蛋白的酶量定义为一个活力单位1标准曲线的制作取6支试管按下表操作管号123450刚果红弹性蛋白(mg)51015202510弹性酶液(ml)555550PH
8.8硼酸缓冲液(ml)—————537℃水解60min(间歇搅拌30次)PH
6.6磷酸缓冲液(ml)5555553000r/min×10min离心后取上清A495nm注意
(1)刚果红弹性蛋白称量须准确
(2)标准液中酶量是过量的,以保证水解完全2样品测定精确称取样品5mg左右(如效价高可适当减少)置乳钵中,加5ml(先加少量)pH
8.8硼酸缓冲液研磨至完全溶解吸取lml于大试管中,用上述缓冲液配制约每毫升5~10单位的待测液,取3支试管接下表操作管号120刚果红弹性蛋白(mg)663PH
8.8硼酸缓冲液(ml)445待测酶液(ml)11037℃水解20min(间歇搅拌20次以上)磷酸缓冲液(ml)5553000r/min×10min离心后取上清A495nm取平均吸收值由标准曲线查得单位数,再由稀释倍数加以换算出弹性酶比活,并折算总收率附树脂处理取干AmoerliteCG50树脂,水漂洗后加5倍体积lmol/LNaOH搅拌2h,水洗至中性加5倍体积lmol/LHC1处理2h,水洗至中性,再用pH
4.
50.1mol/L醋酸缓冲液平衡过夜【思考题】1.弹性蛋白酶制备的原理?2.影响弹性蛋白酶收率的因素有哪些?实验二十九超氧化物歧化酶的分离纯化注此实验内容来自校企合作课题,成果已经产业化应用【目的要求】1.通过超氧化物歧化酶的分离纯化,了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理2.掌握测定超氧化物歧化酶活性和比活力的方法【实验原理】超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)简称SOD,它广泛存在于各类生物体内,按其所含金属离子的不同,可分为3种铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)SOD催化如下反应O2十O2-·+2H+→H2O2+O2在生物体内,它是一种重要的自由基清除剂,能治疗人类多种炎症、放射病及自身免疫性疾病,并具有抗衰老作用,对生物体有保护作用在血液里Cu·Zn-SOD与血红蛋白等共存于红血球中,当红血球破裂溶血后,用氯仿-乙醇处理溶血液,使血红蛋白沉淀,而Cu·Zn-SOD则留在水-乙醇均相溶液中磷酸氢二钾极易溶于水,在乙醇中的溶解度甚低,将磷酸氢二钾加人水-乙醇均相溶液中时,溶液明显分层,上层是具有Cu·Zn-SOD活性的含水乙醇相,下层是溶解大部分磷酸氢二钾的水相(比重大)用分液漏斗处理,收集上层具有SOD活性的含水乙醇相,再加入有机溶剂丙酮,使SOD沉淀极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层,并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用,致使蛋白质颗粒凝集而沉淀采用这种方法沉淀蛋白质时,要求在低温下操作,并且需要尽量缩短处理时间,避免蛋白质变性Cu·Zn-SOD的pI为
4.95将收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中,在pH
7.6的条件下,Cu·Zn-SOD带负电,过DE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化目前常用的活性测定方法为邻苯三酚自氧化法,该法所用试剂和仪器比较普通,测试方便,灵敏度高,是目前应用最广泛的一种测试方法,但对温度、PH、邻苯三酚浓度、SOD待测液存放时间等诸因素比较敏感因此测定时要严格控制这些因素本实验以新鲜猪血为原料,通过氯仿-乙醇除去杂蛋白,采用DE-32纤维素进行纯化,并用邻苯三酚法测定SOD的活力【实验材料】1.材料新鲜猪血2.器材
(1)离心机1台
(2)G3漏斗1只
(3)抽滤瓶1只
(4)751型分光光度计1台
(5)梯度混合器1台
(6)玻璃柱
1.0cm×10cm1根
(7)试管100支
(8)自动收集器1台
(9)紫外检测仪1台
(10)移液管5ml、1ml各2支
(11)量筒1000ml、100ml各1只
(12)烧杯1000ml、500ml、200ml各2只
(13)分液漏斗1只3.试剂
(1)
0.9%NaC1;
(2)95%乙醇,氯仿,K2HPO4·3H2O,丙酮;
(3)pH
7.6,
2.5mmol/L磷酸钾缓冲液;
(4)pH
7.6,200mmo1/L磷酸钾缓冲液;
(5)10mmo1/LHCl;
(6)6mmol/L邻苯三酚(用10mmol/LHCl作溶剂配制),4℃下保存;
(7)
2.5%草酸钾,DE-32纤维素;
(8)pH
8.2,100mmol/LTris-二甲胂酸钠缓冲液(内含2mmol/L二乙基三氨基五乙酸)以200mmol/LTris二甲胂酸钠溶液(内含4mmol/L二乙基三氨基五乙酸)50ml加200mmol/LHC
122.38ml,然后用重蒸水稀释至100ml【实验方法】1.酶的制备(l)分离血球取新鲜猪血500ml(加人抗凝剂
2.5%草酸钾50ml),3000r/min离心20min除去血浆,收集红细胞约250ml,加人等体积
0.9%NaC1溶液,用玻璃棒搅起充分洗涤,3000r/min,离心20min,弃去上清液(如此反复3次),收集洗净的红细胞放入800ml烧杯中,加250ml重蒸水,将烧杯置于冰浴中搅拌溶血40min以上,得溶血液500ml
(2)向溶血液缓慢加入在4℃下预冷过的95%乙醇125ml(
0.25倍体积),然后再缓慢加入在4℃下预冷过的氯仿75ml(0.15倍体积),搅拌15min,室温下3000r/min离心20min,弃去沉淀(血红蛋白),收集上清液约330ml(留样2ml测酶活和蛋白含量)此即酶的粗提液
(3)向酶粗提液加入K2HPO4·3H2O(按43gK2HPO4·3H2O/100ml粗提液的比例),转移到分液漏斗,振摇后静置15min,见分层明显收集上层乙醇-氯仿相(微混浊),室温下离心(3500r/min)25min,弃去沉淀,得上清液约150ml(留样
1.5ml测酶活和蛋白含量)
(4)向上一步得到的上清液加入
0.75倍体积在4℃下预冷过的丙酮,Cu·Zn-SOD便沉淀下来室温下3500r/min离心20min,收集灰白色沉淀物将此灰白色沉淀物溶于约5ml重蒸水中(呈悬浮状),在4℃下,对250mlpH
7.6,
2.5mmol/L的磷酸钾缓冲液透析,每隔
0.5h以上,换透析外液l次,共换4次~5次透析内液如出现沉淀,需在室温下3500r/min离心25min~30min,弃去沉淀,收集上清液约7ml(留样
0.5ml)
(5)DE-32纤维素柱层析DE-32纤维素的处理称量DE-32纤维素干品5g~6g,用自来水浮选除去1min~2min不下沉的细小颗粒,用G3烧结漏斗抽干,滤饼放入烧杯中,加适量1mol/LNaOH溶液,搅匀后放置15min,用G3烧结漏斗抽滤,水洗至中性,滤饼悬浮于1mol/LHC1溶液中,搅匀后放置10min后用G3烧结漏斗抽滤水洗至中性,滤饼再悬浮于1mo1/LNaOH溶液中,抽滤,水洗至中性,最后将滤饼悬浮于层析性平衡缓冲液中待用DE-32纤维素使用后的回收处理与上述步骤相同,只是不用HC1,所用NaOH浓度改为
0.5mol/L将上一步所得离心上清液过DE-32纤维素柱柱体l.0cm×6cm,用pH
7.6,
2.5mmol/L磷酸钾缓冲液作层析柱平衡液,用pH
7.6,
2.5mmol/L(100ml)~200mmol/L(100ml)的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱流速30ml/h,每管收集3ml2.酶蛋白浓度的测定采用紫外吸收法,先测定不同已知浓度标准酪蛋白在280nm波长处的光吸收值绘出标准曲线作定量的依据,再测定样品在280nm波长处的光吸收值,从标准曲线上查出待测样品的蛋白浓度3.酶活性的测定本实验采用邻苯三酚自氧化法邻苯三酚自氧化的机理极为复杂,它在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物反应开始后,反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30s~45s后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min的范围内中间物在420nm波长处有强烈光吸收,当有SOD存在时,由于它能催化O2-与H十结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间物的积累,因此,通过计算就可求出SOD的酶活性邻苯三酚自氧化速率受pH、浓度和温度的影响,其中pH影响尤甚,因此,测定时要求对pH严格掌握
(1)邻苯二酚自氧化速率的测定在试管中按下表1加入缓冲液和重蒸水,25℃下保温20min,然后加入25℃预热过的邻苯三酚(对照管用10mmol/LHCl代替邻苯三酚),迅速摇匀,立即倾入比色杯中,在420nm波长处测定A值,每隔30s读数一次,要求自氧化速率控制在
0.060A/min(可增减邻苯三酚的加入量,使速率正好是
0.060A/min)
(2)酶活性的测定酶活性的测定按表2加样,操作与测定邻苯三酚自氧化速率相同根据酶活性情况可适当增减酶样品的加入量酶活性单位的定义在1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活性单位,即在420nm波长处测定时,
0.030A/min为一个活性单位若每分中抑制邻苯三酚自氧化速率在35%~65%范围,通常可按比例计算,若数值不在此范围时,应增减酶样品加入量邻苯三酚自氧化速率测定加样表试剂对照管/ml样品管/ml最终浓度mmol/LPH
8.2100mmol/LTris-二甲胂酸纳缓冲液(内含2mmol/L二乙基三氨基五乙酸)
4.
54.550重蒸水
4.
24.210mmol/LHCl
0.3_6mmol/L邻苯三酚_
0.
30.2总体积99酶活性测定加样表试剂对照管/ml样品管/ml最终浓度mmol/LPH
8.2100mmol/LTris-二甲胂酸纳缓冲液(内含2mmol/L二乙基三氨基五乙酸)
4.
54.5酶溶液—
0.1重蒸水
4.
24.16mmol/L邻苯三酚—
0.
30.210mmol/LHCl
0.3—总体积99
(3)活性和比活的计算公式总活性单位=每毫升酶液活性单位(U/ml)×酶原液总体积比活==【思考题】1.SOD对人体有何生物学意义?2.有机溶剂沉淀SOD根据的原理是什么?实验三十重组门冬酰胺酶Ⅱ的纯化与分析注此实验来自项目重组E.coliL-门冬酰胺酶制备研究(科技部)的成果【目的要求】1.了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原理2.掌握以基因工程菌种E.coli/pANS2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白重组门冬酰胺酶Ⅱ及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理和技术方法【实验原理】L-门冬酰胺酶L-asparaginase,EC
3.
5.
1.1广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部分啮齿类动物的血清中,但在人体的各种组织器官中的分布未见报道L-门冬酰胺酶活性形式为一同源四聚体,每一亚基由330个氨基酸组成,分子质量为34564u,能专一地水解L-门冬酰胺生成L-门冬氨酸和氨由于某些肿瘤细胞缺乏L-门冬酰胺酶合成酶,细胞的存活需要外源L-门冬酰胺的补充,如果外源门冬酰胺被降解,则由于蛋白质合成过程中氨基酸的缺乏,导致肿瘤细胞的死亡因此,L-门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物,多年来一直是小儿急性成淋巴细胞性白血病AcuteLumphoblasticLeukaemiaALL和淋巴肉瘤Lymphosarcoma临床化疗中重要的配伍药物之一用微生物,特别是大肠杆菌来生产L-门冬酰胺酶已有广泛深入的研究大肠杆菌能产生2种天冬酰胺酶,即L-门冬酰胺酶Ⅰ和L-门冬酰胺酶Ⅱ,分别由其染色体上基因ansA和ansB编码只有L-门冬酰胺酶Ⅱ才有抗肿瘤活性美、德、日均有L-门冬酰胺酶Ⅱ商品出售我国天津生化厂曾于1974年投产,后因菌种退化,产量降低而停产国内目前用药全靠进口1995年,本院构建了高效分泌表达L-门冬酰胺酶Ⅱ的基因工程菌,重组L-门冬酰胺酶ⅡrL-ASPⅡ在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中表达的rL-ASPⅡ相对分子质量为138356Da,pI为
4.85,紫外最大吸收值在278nm处本实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用提取周质中的rL-ASPⅡ,再用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维素交换层析等步骤提取和纯化,得到较高纯度表达产物rL-ASPⅡ并对rL-ASPⅡ进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析rL-ASPⅡ酶活性的测定参照Peterson的方法修订取1ml
0.04mol/LL-门冬酰胺,1ml
0.1mol/LpH
8.4硼酸-硼酸钠缓冲液,
0.2ml细胞悬液或酶液于37℃保温15min,速加1ml50%三氯乙酸终止反应,4000r/min离心沉淀细胞取上清液1ml,加奈氏试剂2ml和双蒸水7ml,放置15min后,于500nm波长比色在上述规定条件下,将每分钟催化L-门冬酰胺水解释放1μg分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位(OD500=
0.07时为1U)比活力测定方法为精称纯化产物10mg,溶解于1mlH2O中,采用Lowry法测定蛋白质含量,并测定酶活力,经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力rL-ASPⅡ比活力=酶活力U/蛋白含量【实验材料】1.器材(1基因工程菌菌种E.coli/pANS2为本实验室保存;(2其他同前实验二十三器材2.试剂重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备和酶活力测定(1培养基种子培养基(LB液体培养基);发酵培养基(玉米浆培养基)玉米浆50g/L,牛肉浸膏35g/L,味精10g/L,pH
7.0,高压灭菌接种前在无菌条件下加入抗生素氨苄青霉素(2氨苄青霉素Amp;(3破壁液45%蔗糖,10mmol/LEDTA,200mg/L溶菌酶,pH
7.5;(4奈氏试剂称碘化钾5g加入5ml蒸馏水中,边搅拌边滴加25%氯化汞饱和液至稍有红色沉淀出现再加40ml50%氢氧化钠溶液,最后用蒸馏水稀释至100ml,混匀入棕色试剂瓶中置暗处保存;(51mol/L氯化锰(MnCl2);(65mol/L磷酸缓冲液pH
6.4;(7pH
8.4硼酸缓冲液
0.858g硼砂MW=
381.37,
0.680g硼酸MW=
61.83,用蒸馏水稀释至100ml;(8溶菌酶;(9蔗糖;(10氯化钠;(11三(羟甲基)胺基甲烷(Tris);(12乙醇;(13氢氧化钠;(14硫酸铵;(15谷氨酸钠(或含99%谷氨酸钠的味精);(16四甲基乙二胺(EDTA);(17盐酸;(18玉米浆;(19低分子量标准蛋白
14.4~94KDa;12%SDS-PAGE电泳分析同实验九【实验方法】1.工程菌发酵培养
(1)从平板上挑取菌种接种于新鲜的含氨苄青霉素终浓度为100μg/ml的LB液体培养基中,37℃,摇床转速220r/min,培养至OD600为
0.48~
0.6h
(2)摇瓶培养再按2%接种量转接于发酵培养基三角瓶20%装液量中,37℃,250r/min,20h,12000r/min离心收集细胞
(3)批式发酵培养20L的发酵罐装入14L发酵培养基初始pH值为
7.0,121℃下灭菌20min,待温度降至37℃时加氨苄青霉素至最终浓度为100μg/ml,接入种子液700ml,37℃培养12~14h,罐压力
0.05Mpa2.重组L-门冬酰胺酶Ⅱ分离纯化制备
(1)蔗糖溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中,在30℃温和振荡70min后搅拌下倾入大量水中,4℃,边搅拌边加入1mol/LMnCl
27.5%,V/V,沉淀核酸和菌体碎片,8000r/min,离心30min,收集上清液即得酶提取液采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析计算收率
(2)硫酸铵分级沉淀在酶提取液中加入硫酸铵至55%饱和度,调pH到
7.0,冰水浴磁力搅拌60min,4℃静置过夜,12000r/min离心10min除去沉淀再在上清液中加入硫酸铵至90%饱和度,调pH至等电点附近(约pH
5.0),搅拌60min,4℃静置过夜,12000r/min离心10min,收集沉淀采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析计算收率
(3)透析脱盐上述沉淀物用5mol/L磷酸缓冲液pH
6.4溶解,透析脱盐(4DEAE-52阴离子交换柱层析DEAE-纤维素柱经5mmol/L磷酸缓冲液pH
6.4平衡后,上样品脱盐酶液,用相同缓冲液洗涤至基线平稳,改用50mmol/L磷酸缓冲液pH
6.4洗脱,分部收集器收集,
1.5ml/min每管收集6ml,测定每管的A280值和酶活性绘制洗脱曲线收集显示酶活性组分,冷冻干燥后即得高纯度的L-门冬酰胺酶冻干粉采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L-门冬酰胺酶Ⅱ含量和酶活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析计算收率3.重组L-门冬酰胺酶Ⅱ酶活性测定 吸取1ml菌液入Ep管,12000r/min离心5min,收集菌体弃去上清,加入蒸馏水1ml洗涤,混悬,12000r/min离心5min,弃上清重复上述操作2~3次,加入pH
8.4硼酸缓冲液1ml混悬准备一组2支蒸馏水准备管取10ml的洁净试管2只,每管加
3.5ml蒸馏水另取2支10ml的洁净试管,分别加入
0.04mol/L天冬酰胺底物,
0.1mol/LpH
8.4硼酸缓冲液各1ml,37℃水浴5min,其中一只加入细胞悬液20μl,另一支为对照管反应15min后分别加入50%三氯乙酸1ml终止反应再从终止反应管中各支取500μl进蒸馏水准备管,每管分别加入与25%NaOH以1:1配好的奈氏液1ml显色,500nm处测OD值计算酶活力U=[OD×1000/
0.07×15x]×3+x/1000x为取样体积本实验为20μl4.比活力测定方法精确称取纯化产物10mg,溶解于1mlH2O中,采用Lowry法测定蛋白质含量,并测定酶活力,经以下公式换算即得单位质量的rL-ASPⅡ比活力rL-ASPⅡ比活力=酶活力U/蛋白含量5.12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度电泳方法同实验九(1按常规制备电泳用聚丙烯酰胺凝胶,浓度12%(2将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸铵分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后,进行电泳分析(3电泳2~3h后,取出凝胶,用
0.15%考马斯亮蓝-R250进行染色过夜后倾出染液,不断脱色,起初每20min换液1次,1h后每小时换液1次,直到区带明显,画出电泳区带图谱6.结果处理
(1)用箭头图表示重组L-门冬酰胺酶Ⅱ制备的操作流程
(2)绘制洗脱曲线
(3)重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯化过程分析纯化步骤总蛋白mg总活力U比活U/mg纯化倍数收率%A.粗提酶液B.硫酸铵沉淀C.DEAE-52纤维素柱层析(4电泳图谱分析【思考题】1.试说明电泳图谱,并用电泳图谱判断所制得的重组L-门冬酰胺酶Ⅱ的纯度2.影响重组L-门冬酰胺酶Ⅱ纯度和收率的因素有哪些?如何加以控制?3.硫酸铵分级沉淀的机理?总活性单位(U)每毫升酶液活性单位(U/ml)(U/mL)总蛋白(mg)每毫升蛋白浓度(mg/ml)PAGE84。