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生物技术原理与方法wzjhaust@gmail.com生物技术,也称生物工程,是指人们以现代生命科学为基础,结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的
1.2生物技术发展简史现代生物技术是以70年代DNA重组技术的建立为标志1944年阐明了DNA是遗传信息的携带者1953年提出了DNA的双螺旋结构模型,阐明了DNA的半保留复制模式,从而开辟了分子生物学研究的新纪元1961年等破译了遗传密码,揭开了DNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这一秘密1972年首先实现了DNA体外重组技术,标志着生物技术的核心技术——基因工程技术的开始基因工程技术向人们提供了一种全新的技术手段,使人们可以按照意愿在试管内切割DNA、分离基因并经重组后导人其他生物或细胞,藉以改造农作物或畜牧品种;也可以导人细菌这种简单的生物体,由细菌生产大量的有用的蛋白质,或作为药物,或作为疫苗;也可以直接导人人体内进行基因治疗显然,这是一项技术上的革命以基因工程为核心,带动了现代发酵工程、现代酶工程、现代细胞工程的发展,形成了具有划时代意义和战略价值的现代生物技术
1.4生物技术应用前景生物技术与其他高新技术一样具有“六高”的基本特征即高效益、高智力、高投入、高竞争、高风险、高势能. 另一方面,生物技术广阔的应用前景,高额的利润也促使生物技术的快速发展生物技术的应用领域非常广泛,它包括医药、农业、畜牧业、食品、化工、林业、环境保护、采矿冶金、材料、能源等领域这些领域的广泛应用必然带来了经济上的巨大利益
二、生物技术在医药方面的应用
1、生物工程药物
2、基因诊断和治疗
3、基因保键、器官移植与干细胞基因诊断法,又称分子诊断法或DNA探针检测法应用专用的DNA分子探针,对受检者的特定基因(DNA)或其转录本mRNA进行杂交分析,从而对遗传疾病作出诊断的技术人类基因组计划(HGP) 1986年美国生物学家诺贝尔奖获得者Dulbecco首先倡议,全世界的科学家联合起来从整体上研究人类的基因组,分析人类基因组的全部序列以获得人类基因所携带的全部遗传信息毫无疑问,该项工作的完成,将使人们深入认识许多困扰人类的重大疾病的发病机理;90年代的人类基因组计划的科学意义如同60年代的登月计划所以继美国之后,欧盟国家、日本、俄罗斯、加拿大、澳大利亚和我国也相继启动了人类基因组计划
三、转基因动物、乳腺反应器及动物克隆
四、能源与环保选育可大量生产能源化学物质的工程菌,开发生物来源的石油替代产品;选育可降解工业和生活废弃物的工程菌,用以处理垃圾,变废为宝;处理工业“三废”,石油泄漏等,解决环境污染问题生物学家们正尝试运用生物技术开发出能够将植物中的纤维素降解进而转化为可以燃烧的酒精等新能源自然界有取之不尽的植物纤维素资源,这项技术的突破有可能成为能源技术的新方向我国麻疯树、黄连木等油料植物可满足500万t/a生物柴油装置的原料需求微生物降解农药残留
1.5生物技术安全性1人身健康---基因的食物链转移2道德伦理---器官移植(头颅移植)3社会安定---克隆人、生物武器4生态安全---试验室安全、基因漂移生物武器是穷弱国家的“杀手锏”
1.6生物技术在国民社会经济发展中的地位人类基因组计划(HGP)解决能源危机、治理环境污染;环境保护,制造工业原料;生产贵重金属国家安全生物武器和反生物武器经济发展政治地位2植物组织培养技术原理及操作
1、植物组织培养:是指在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养,使其长成完整的植株
2、应用领域
(1)、快速繁殖
(2)、种苗脱毒
(3)、远缘杂交
(4)、突变育种
(5)、基因工程
(6)、生物制品
(7)、遗传、生理、生化、病理研究
8、植物种质资源保存和交换外植体在植物细胞组织培养中由活体植物体上提取下来的接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等均称为外植体愈伤组织在植物细胞组织培养中,愈伤组织则指在人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞
3、广义的组培依外植体不同可分为器官培养;茎尖分生组织培养;愈伤组织培养;细胞培养;原生质体培养
4、植物组培特点
①培养条件可以人为控制
②生长周期短,繁殖率高
③管理方便,利于工厂化生产和自动化控制
5、植物细胞的全能性植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性,在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力1》原理生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质,都有发育成为完整个体所必需的全部基因,从理论上讲,生物体的每一个活细胞都应该具有全能性2》差异
(1)受精卵的全能性最高
(2)受精卵分化后的细胞中,体细胞的全能性比生殖细胞的低3》潜在全能性的原因基因表达的选择性
6、脱分化来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来,恢复细胞的分裂活性
7、再分化经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力
8、一个成熟细胞或分化细胞转变成为分生状态的过程,即形成愈伤组织的过程,叫做脱分化
9、再分化由愈伤组织能再形成完整的植株,这一过程叫做再分化,或简单地叫做分化或再生
10、细胞全能性指一个完整的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息
11、细胞分裂植物组织培养属无性繁殖,有丝分裂保证组织培养过程中细胞数量的增加而减数分裂属于有性繁殖细胞分裂方式的一种
12、位置效应植物离体活组织,延续表现出来原生长部位的形态和特性的现象因此,要根据培养目的选择适宜的外值体
13、脱(去)分化和再分化:去处外植体原有的分化性状,重新进入新的发育分化状态
14、组织培养的难易规律(易---难)
[1]生长点细胞》形成层细胞》薄壁细胞》厚壁细胞》纤维细胞》退化细胞
[2]种子》花器》茎下部组织》茎中部组织》冠内部枝叶》冠外部枝叶
[3]组培时间长的植物》组培时间短的植物
15、植物组织培养的培养条件营养条件、环境条件、培养基配制
16、培养基在离体培养条件下,不同种植物的组织对营养有不同的要求,甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同,只有满足了它们各自的特殊要求,它们才能很好地生长因此,没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官,在建立一项新的培养系统时,首先必须找到一合适的培养基,培养才有可能成功
17、培养基的种类1MS培养基2B5培养基3White培养基4)N6培养基5KM—8P培养基
18、MS培养基它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的特点是无机盐和离子浓度较高,为较稳定的平衡溶液其养分的数量和比例较合适,可满足植物的营养和生理需要它的硝酸盐含量较其他培养基为高,广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养,效果良好有些培养基是由它演变而来的
19、培养基的成分
(1)水
(2)、大量元素
(3)、微量元素
(4)、有机化合物
(5)、碳水化合物
(6)、维生素
(7)、生长素类
(8)、肌醇
(9)、氨基酸
20、大量元素,指浓度大于
0.5mmol/L的元素等;包括1N2P3K3K
21、微量元素,指小于
0.5mmol/L的元素,Fe,B,Mn,Cu,Mo,Co等
22、在培养基的各成分中,植物生长调节物是培养基的关键物质,对植物组织培养起着决定性作用IAA吲哚乙酸NAA萘乙酸NAA和IBA广泛用于生根,并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长IBA吲哚丁酸是促进发根能力较强的生长调节物质在培养基中添加细胞分裂素有三个作用
①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长
②促进细胞分裂与扩大
③抑制根的分化因此,细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖,而在生根培养时使用较少或用量较低激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向,是愈伤组织、长根还是长芽如为了促进芽器官的分化,应除去或降低生长素的浓度,或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例高有利于根的形成和愈伤组织的形成;适中有利于根芽的分化;低有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微,一般用mg/L表示浓度在组织培养中生长调节物质的使用浓度,因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异,一般生长素浓度的使用为
0.05-5mg/L,细胞分裂素
0.05—10mg/L琼脂的用量在6—10g/L之间,若浓度太高,培养基就会变得很硬,营养物质难以扩散到培养的组织中去若浓度过低,凝固性不好固体培养基优点在于操作简便,通气问题易于解决,便于经常观察研究等;缺点如培养物与培养基的接触即吸收面积小,各种养分在琼脂中扩散较慢,影响养分的充分利用,同时培养物排出的一些代谢废物,聚集在吸收表面,对组织产生毒害作用市售的各种琼脂几乎都含有杂质,特别是Ca、Mg及其他微量元素环境条件温度湿度渗透压pH值氧气组织培养中光照也是重要的条件之一,主要表现在光强、光质、以及光照时间方面
29、母液stocksolution的配制和保存在植物组织培养工作中,配制培养基是日常必备的工作为简便起见,通常先配制一系列母液,即贮备液所谓母液是欲配制液的浓缩液,这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取,而且还便于低温保藏一般母液配成比所需浓度高10-100倍母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等配制时注意一些离子之间易发生沉淀,如Ca2+和S042+,Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后,会产生沉淀,一定要充分溶解再放入母液中!!!配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水药品应选取等级较高的化学纯或分析纯药品的称量及定容都要准确各种药品先以少量水让其充分溶解,然后依次混合一般配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液,其中维生素、氨基酸类可以分别配制,也可以混在一起母液配好后放人冰箱内低温保存,用时再按比例稀释
30、母液的配制方法1)、单配法将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液一般用a:b表示,即每b毫升溶液中含有a毫克溶质2)、混配法将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量,分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液,浓度可用amg/L表示,即配制一升培养基吸取该母液aml.生长素配制时可先用少量95%酒精助溶2,4—D可用
0.1mol/L的NaOH或KOH助溶,加入温水定容生长素常配成1mg/ml的溶液贮于冰箱中备用细胞分裂素类一般先用少量1N盐酸溶解后,再加入温水冷却后定容,3)、铁盐配法(MS为例)在装有400ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠,溶解后加入
3.73gEDTA-Na2,加热使其全部溶解,然后边搅拌边慢慢加入
2.78gFeSO
4.7H2O直至全部溶解,冷却后定容至500ml,置于冰箱中备用
31、培养基的配制按表用量筒移取大量元素母液100ml,用专一对应的移液管分别吸取微量元素母液10mi、铁盐母液10ml、有机物母液10ml,均置人1000ml定容瓶中,若不加任何激素,则为MSo培养基;若需加激素按配方移取激素母液即可将已装母液的定容瓶用蒸馏水或自来水定容到1000ml,取1/3左右倒人小铝锅中加热同时,称好30g蔗糖,称琼脂丝7g或琼脂粉,也倾人小铝锅中,边加热边搅拌,防止糊底旺火煮开,再用文火加热,直至琼脂全部融化即清澈见底为度若用琼脂粉,应加入100ml左右的液体培养基,并搅拌均匀然后再倾人定容瓶余下的液体培养基,摇晃均匀即可培养基配好后,要调整pH值用0.1M的NaOH或HCl液调成5.8pH值左右在培养基配方不大变动的情况下可用经验法可以将连续三次测定所加入的酸或碱液的平均值作为以后调整的用量值调后注意一定要摇动均匀,还要注意酸或碱液不要放置时间太久
33、培养基的分装与灭菌1)、培养基合成后要趁热分装,100ml的容器约装入30-40ml培养基,即1L培养基约装35瓶左右太多则浪费培养基,太少不易接种和影响生长但要根据培养对象来决定如果培养时间较长时,应适当多装培养基,生根等短期培养时,可适当少加培养基分装时不要把培养基弄到管壁上,以免日后污染装后用封口材料包上瓶口,扎口后,写上培养基种类,准备灭菌注意不能放置时间过长,以免产生污染2)、培养基用高压灭菌打开锅盖,加水至水位线把已装好培养基的三角瓶,连同蒸馏水及接种用具等放人锅筒内,装时不要过分倾斜培养基,以免弄到瓶口上或流出然后盖上锅盖,对角旋紧螺丝,接通电源加热,当升至0.05MPa时,打开放气阀放气,回“0‘,后关闭放气阀当气压上升到0.10MPa时,保压灭菌20min,到时停止加热当气压回”0“后打开锅盖,取出培养基,放于平台上冷凝灭好的培养基不要放置时间太长,最多不能超过1周,否则,冰箱中4℃保存
2.4无菌操作技术
2.
4.1灭菌灭菌是组织培养重要的工作之一初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴有菌的范畴是凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,至少它的表面都是有菌的依此观点,无菌室等未经处理的地方、超净台表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物茵的特点是极小,肉眼看不见无处不在,无时不有,无孔不人在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生无菌的范畴是经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理的或化学的灭菌方法处理后的物体当然这些方法必须已经证明是有效的,高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部等等都是无菌的从以上可以看出在地球表面无菌世界要比有菌世界小得多菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间接种室、超净台、等和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作常用的灭菌方法常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即物理方法如干热烘烧和灼烧、湿热常压或高压蒸煮、射线处理紫外线、超声波、微波、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌(培养基)培养基在制备后的24h内完成灭菌工序高压灭菌的原理是在密闭的蒸锅内,其中的蒸气不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加在o.1MPa的压力下,锅内温度达121℃在此蒸气温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底常用方法是关闭放气阀,通电后,待压力上升到O.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时压力0.1-0.15MPa,20min对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种用具,可以延长灭菌时间或提高压力而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间对于一些布制品,如实验服、口罩等也可用高压灭菌洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌20-30min高压灭菌前后的培养基,其pH值下降
0.2-
0.3单位高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的pH值变化幅度较大,甚至可大于2个pH值单位环境pH值的变化大于
0.5单位就有可能产生明显的生理影响高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压在8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高0.43倍培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖培养基值小于
5.5,其水解量更多,培养基中添加
0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5%防止高压灭菌培养基变化的方法1经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,及时采取有效措施2设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量在
0.1%以下注意pH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等3配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序如将磷、钙和铁放在最后加入4注意高压灭菌后培养基pH值的变化及回复动态如高压灭菌后的pH值常由
5.80升高至
6.48而96h后又回降至
5.8左右这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握灼烧灭菌(用于无菌操作的器械)在无菌操作时,把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌冷却后,立即使用操作中可采用250或500ml的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具干热灭菌(玻璃器皿及耐热用具)干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~C的温度来杀死微生物由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽抱的抗热水平,通常采用170℃持续90min来灭菌干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染包扎可用耐高温的塑料灭菌时应渐进升温,达到顶定温度后记录时间烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免妨碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂干热灭菌能源消耗太大,浪费时间过滤灭菌(不耐热的物质)一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法防细菌滤膜的网孔的直径为
0.45μm以下,当溶液通过滤膜后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液紫外线和熏蒸灭菌(空间)1紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质和核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡紫外线的波长为200—300nm,其中以260nm的杀菌能力最强,但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过
1.2m为宜2熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按5—8ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外喷雾灭菌(物体表面)物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用70%的酒精反复涂擦灭菌,l%-2%的来苏儿甲酚)溶液以及
0.25%—1%的新洁尔灭(苯扎溴铵)也可以植物材料表面用消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物这些污染源一旦带人培养基,便会造成培养基污染因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接到培养基上,这一过程叫做接种第一步,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放人为宜置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗流水冲洗在污染严重时特别有用洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲净洗衣粉水洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触当然,最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温第二步是对材料的表面浸润灭菌要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等用70%酒精浸10~30s由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内贮用次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水涮洗3—4次即可;难以对升汞残毒较难去除,用无菌水涮洗8~10次,每次不少于3min灭菌时,把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒人消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底在快到时间之前1—2min,开始把消毒液倾人一备好的大烧杯内,倾净后立即倒入无菌水,轻搅涮洗灭菌时间是从倒人消毒液开始,至倒入无菌水时为止灭菌液要充分浸没材料,宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌在灭菌溶液中加吐温—80或TntonX-100效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸人到灭菌的材料表面但吐温加人后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的O.5%,即在100ml加入15滴最后一步是用无菌水涮洗,涮洗要每次3min左右,视采用的消毒液种类,涮洗3-l0次左右无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用
2.
4.2接种接种时由于有一个敞口的过程,所以是极易引起污染的时期,这一时期主要由空气中的细菌和工作人员本身引起,接种室要严格进行空间消毒接种室内保持定期用1%—3%的高锰酸钾溶液对设备、墙壁、地板等进行擦洗除了使用前用紫外线和甲醛灭菌外,还可在使用期间用70%的酒精或3%的来苏儿喷雾,使空气中灰尘颗粒沉降下来无菌操作可按以下步骤进行1在接种4h前用甲醛熏蒸接种室,并打开其内紫外灯进行灭菌;2在接种前20min,打开超净工作台的风机以及台上的紫外灯;3接种员先洗净双手,在缓冲间换好专用实验服,并换穿拖鞋等;4上工作台后,用酒精棉球擦拭双手,特别是指甲处然后擦拭工作台面;5先用酒精棉球擦拭接种工具,再将镊子和剪子从头至尾过火一遍,然后反复过火尖端处,对培养皿要过火烤干;6接种时接种员双手不能离开工作台,不能说话、走动和咳嗽等;7接种完毕后要清理干净工作台,可用紫外灯灭菌30min若连续接种,每5天要大强度灭菌一次
2.
4.3外植体接种步骤1将初步洗涤及切割的材料放人烧杯,置超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上2材料吸干后,一手拿镊子,一手拿剪子或解剖刀,对材料进行适当的切割如叶片切成
0.5cm见方的小块;茎切成含有一个节的小段微茎尖要剥成只含l—2片幼叶的茎尖大小等接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染3用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上
2.5培养和驯化指把培养材料放在培养室有光照、温度条件里,使之生长,分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程
2.
5.1培养方法1固体培养法2液体培养法
2.
5.2培养步骤1初代培养2继代培养3生根培养4试管苗移栽驯化根据初代培养时发育的方向可分为1顶芽和腋芽的发育2不定芽的发育3体细胞胚状体的发生与发育诱导生根方法
①将新梢基部浸入50或100×10-6IBA溶液中处理4—8h;
②在含有生长素的培养基中培养4-6d;
③直接移入含有生长素的生根培养基中上述三种方法均能诱导新梢生根,但前二种方法对新生根的生长发育则更为有利而第三种对幼根的生长有抑制作用其原因是当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在,则不利于幼根的生长发育不过这种方法比较可行另外也可采用下列方法就可生根
①延长在增殖培养基中的培养时间;
②有意降低一些增殖倍率,减少细胞分裂素的用量即将增殖与生根合并为一步;
③切割粗壮的嫩枝在营养钵中直接生根,此方法则没有生根阶段可以省去一次培养基制作,切割下的插穗可用生长素溶液浸蘸处理,但这种方法只适于一些容易生根的作物另外少数植物生根比较困难时,则需要在培养基中放置滤纸桥,使其略高于液面,靠滤纸的吸水性供应水和营养,从而诱发生根经胚状体途径发育的苗数特别多,并且个体较小,所以也常需要一个低浓度或没有植物激素的培养基培养的阶段,以便壮苗生根4试管苗移栽驯化试管苗移栽是组织培养过程的重要环节,这个工作环节做不好,就会造成前功尽弃为了做好试管苗的移栽,应选择合适的基质,并配合以相应的管理措施,才能确保整个组织培养工作的顺利完成试管苗由于是在无菌、有营养供给、适宜光照和温度近100%的相对湿度环境条件下生长的,因此,在生理、形态等方面都与自然条件生长的正常小苗有着很大的差异所以必须通过炼苗,例如通过控水、减肥、增光、降温等措施,使它们逐渐地适应外界环境,从而使生理、形态、组织上发生相应的变化,使之更适合于自然环境,只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功从叶片上看,试管苗的角质层不发达,叶片通常没有表皮毛,或仅有较少表皮毛,甚至叶片上出现了大量的水孔,而且,气孔的数量、大小也往往超过普通苗由此可知,试管苗更适合于高湿的环境生长,当将它们移栽到试管外环境时,试管苗失水率会很高,非常容易死亡因此,为了改善试管苗的上述不良生理、形态特点,则必须经过与外界相适应的驯化处理另外,对栽培驯化基质要进行灭菌,因为试管苗在无菌的环境中生长,对外界细菌、真菌的抵御能力极差为了提高其成活率,在培养基质中可掺入75%的百菌清可湿性粉剂200-500倍液,以进行灭菌处理,通常采取的措施有对外界要增加湿度、减弱光照;对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等移栽用基质适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力,容易灭菌处理,并不利于杂菌滋生的特点,一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等为了增加粘着力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土配时需按比例搭配,一般用珍珠岩,蛭石,草炭土或腐殖土比例为1:1:
0.5也可用砂子草炭土或腐殖土为1:1这些介质在使用前应高压灭菌或用至少3h烘烤来消灭其中的微生物要根据不同植物的栽培习性来进行配制,这样才能获得满意的栽培效果以下介绍几种常见的试管苗栽培基质1河砂:河砂分为粗砂、细砂两种类型粗砂即平常所说的河砂,其颗粒直径为1—2mm细砂即通常所说的面砂,其颗粒直径为
0.1—
0.2mm河砂的特点是排水性强,但保水蓄肥能力较差,一般不单独用来直接栽种试管苗2草炭土:草炭土是由沉积在沼泽中的植物残骸经过长时间的腐烂所形成,其保水性好,蓄肥能力强,呈中性或微酸性反应,但通常不能单独用来栽种试管苗,宜与河砂等种类相互混合配成盆土而加以使用3腐殖土:腐殖土是由植物落叶经腐烂所形成一种是自然形成,一种是人为造成,人工制造时可将秋季的落叶收集起来,然后埋人坑中,灌水压实令其腐烂第二年春季将其取出置于空气中,在经常喷水保湿的条件下使其风化,然后过筛即可获得腐叶上含有大量的矿质营养、有机物质,它通常不能单独使用掺有腐殖土的栽培基质有助于植株发根移栽前的练苗试管内生根壮苗的阶段,通常不同植物的适宜驯化温度不同如菊花,以18~20℃为宜实践证明植物生长的温度过高不但会牵涉到蒸腾加强而且还牵涉到菌类易滋生的问题温度过低使幼苗生长迟缓,或不易成活春季低温时苗床可加设电热线,使基质温度略高于气温2~3℃,这不但有利于生根和促进根系发达,而且还有利于提前成活移植到试管外的植物苗光强度应比移植前培养有所提高,并可适应强度较高的漫射光,约4000h左右,以维持光合作用所需光照强度但光线过强刺激蒸腾加强,会使水分平衡的矛盾更尖锐移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2—3d,让试管苗接受强光的照射,使其长得壮实起来,然后再开口练苗1—2d,经受较低湿度的处理,以适应将来自然湿度的条件移栽和幼苗的管理从试管中取出发根的小苗,用自来水洗掉根部粘着的培养基,要全部除去,以防残留培养基滋生杂菌但要轻轻除去,应避免造成伤根栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔,然后将小苗插入,注意幼苗较嫩,防止弄伤,栽后把苗周围基质压实,栽前基质要浇透水栽后轻浇薄水再将苗移入高湿度的环境中保证空气湿度达90%以上1保持小苗的水分供需平衡在移栽后5-7d内,应给予较高的空气湿度条件,使叶面的水分蒸发减少,尽量接近培养瓶的条件,让小苗始终保持挺拔的状态保持小苗水分供需平衡首先营养钵的培养基质要浇透水,所放置的床面也要浇湿,然后搭设小拱棚,以减少水分的蒸发,并且初期要常喷雾处理,保持拱棚薄膜上有水珠出现当5—7d后,发现小苗有长趋势,可逐渐降低湿度,减少喷水次数,将拱棚两端打开通风,使小苗适应湿度较小的条件约15d以后揭去拱棚的薄膜,并给予水分控制,逐渐减少浇水,促进小苗长得粗壮2防止菌类滋生由于试管苗原来的环境是无菌的,移出来以后难以保持完全无菌,因此,应尽量不使菌类大量滋生,以利成活所以应对基质进行高压灭菌或烘烤灭菌可以适当使用一定浓度的杀菌剂以便有效地保护幼苗,如多菌灵、托布津,浓度800—1000倍,喷药宜7—l0d一次在移苗时尽量少伤苗,伤口过多,根损伤过多,都是造成死苗的原因喷水时可加入
0.1%的尿素,或用1/2MS大量元素的水溶液作追肥,可加快苗的生长与成活3一定的温、光条件试管苗移栽以后要保持一定的温光条件,适宜的生根温度是18—200C,冬春季地温较低时,可用电热线来加温温度过低会使幼苗生长迟缓,或不易成活温度过高会使水分蒸发,从而使水分平衡受到破坏,并会促使菌类滋生另外在光照管理的初期可用较弱的光照,如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等,以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发当小植株有了新的生长时,逐渐加强光照,后期可直接利用自然光照促进光合产物的积累,增强抗性,促其成活4保持基质适当的通气性要选择适当的颗粒状基质,保证良好的通气作用在管理过程中不要浇水过多,过多的水应迅速沥除,以利根系呼吸综上所述,试管苗在移栽的过程中,只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好,试管苗是很容易移栽的快速繁殖与脱毒培养快速繁殖:就是得用组织培养的方法,使植物的部分器官、组织在人工控制的适宜条件下,迅速扩大培养,并移植到温室或农田繁殖出大量幼苗的繁殖方法快繁特点繁殖速度快;使用材料少,生产效率高,省时省工;节约空间有利于植物的工厂化生产;在无菌条件下进行,不受病虫害侵害快速繁殖的优越性
(1)其主要特点是速度“快”
(2)是无性繁殖从田间移入室内,易于育苗工厂化快繁主要适用范围
(1)加速某些难繁或繁殖速度低的植物,特别是一些珍稀名贵的花卉,需要发展的濒危植物的繁殖如百合
(2)用有性繁殖的方法难以保持品种特性的异花授粉植物,如油棕、猕猴桃、非洲菊等
(3)需要去除病毒的植物如马铃薯、甘薯、大蒜等
(4)原种很少,生产上又急需推广的植物如百合,名贵花卉
(5)珍稀植物资源和育种原始材料如野生抗性资源、自然突变资源、雄性不育资源、罕见植物等快速繁殖过程一般包括四个阶段阶段一无菌培养物的建立1.外植体的选择选择适当的外植体对于快速繁殖能否成功是极其重要的,而选择什么样的外植体首先决定于第二阶段芽的增殖所采用的途径通过腋芽的形成来增加芽的数量时,应从带有营养芽的部分得到外植体,并注意以下4个问题
(1)外植体大小,如为一般繁殖而非脱毒繁殖,可使用普通茎尖、芽或带芽的茎切段作为外植体
(2)取材植株的生理状态对培养成败是极重要的,一般在植物开始生长,芽已膨大但芽鳞片还未张开时最为合适,此时芽生长旺盛,并有芽鳞片的保护,不易污染为了避免季节的影响,在有条件时也可以将植物放在光、温条件稳定的人工气候箱或温室中,使植物保持营养生长状态,对某些需低温或高温或特殊光周期处理才能打破休眠的块茎、鳞茎、球茎等,常要处理后才可剥取茎尖进行培养
(3)芽在植物株上的部位也是需要注意的,在一些草本植物(如菊花等)中,使用顶芽或上部的芽作为分生组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高,这可能和它们生长较旺盛有关
(4)多年生的木本植物随着年龄的增加,分生组织、茎尖和芽的培养越困难,特别是成年树较幼态树的培养要困难得多,此时,常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗或不定芽做材料,或采取某些措施如将芽接在实生苗上,修剪、保持高水平的水肥进行营养繁殖,或用细胞分裂素喷洒植株的方法等在通过不定芽途径使芽增殖时,可以根据不同的植物采用不同的外植体,如根、茎、叶或花器官的各部分,在自然界中能够产生不定芽的器官应当首先被采用,如非洲紫罗兰、秋海棠、大岩桐、落地生根等可用叶片,某些兰花等可以用茎尖;很多种植物,特别是单子叶植物,可以作用花器官,如黄花菜、鸢尾等在使用体细胞胚胎发生途径时,常使用胚分生组织或生殖器官作为外植体2.外植体的消毒阶段二芽的诱导及扩大化繁殖(增殖)这是快繁技术中最重要性一环,在这一阶段潜在的植物体幼体(芽或胚状体)通过腋芽的形成和生长、外植体或愈伤组织上不定芽的形成和胚状体发生三条件途径在数量上得迅速增殖,由于外植体种类的不同,在增殖时可能采用的途径不同1. 促进腋芽的形成和生2.诱导不定芽的形成3.诱导胚状体的形成阶段三根的诱导这一阶段的目的是使第二阶段通过腋芽生长和不定芽形成途径得到的嫩枝生根产生小植株,以便移栽很多草本植物的不定根的形成是很容易的,但木本植物一般要困难些,其中从成年树得到的材料就更困难由于生长的嫩枝本身能全盛丰富的生长素,所以一部分植物可在无激素的培养基上生根阶段四移栽移栽步骤及要求1炼苗3-10d2净苗除去培养基、过多过长根系3栽培基质无菌高压灭菌or化学消毒;保湿;透气4环境光弱中;适湿不萎蔫
3.2植物无病毒苗的培育
3.
2.3脱毒的方法
(一)热处理脱毒热处理法的发现及应用热处理又称温治疗法theomtherapy,原理是当植物组织处于高于正常温度的环境中时,组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化,在高温下,不能生成或生成病毒很少,而破坏却日趋严重,以致病毒含量不断降低,这样持续一段时间,病毒自行消灭,从而达到脱毒的目的1温汤浸渍处理2热空气处理热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒,因此热处理需与其他方法配合应用,才可获得良好的效果
(二)茎尖培养脱毒1.茎尖培养脱毒原理感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀,病毒的数量随植株部位及年龄而异,越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低,生长点约
0.1~
1.0mm区域则几乎不含或含病毒很少、这是因为分生区域内无维管束,病毒只能通过胞间连丝传递,赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度在切取茎尖时越小越好,但太小则不易成活,过大又不能保证完全除去病毒茎尖培养脱毒,由于其脱毒效果好,后代稳定,所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径
(三)其他途径脱毒
1.愈伤组织培养脱毒2.茎尖微体嫁接
3.化学去毒
3.
2.4去病毒植物的鉴定
(一)指示植物法
(二)抗血清鉴定法
(三)电子显微镜检查法
(四)酶联免疫鉴定法
(五)核酸鉴定
一、无病毒苗的保存繁殖无病毒植株并不是有额外的抗病性,它们有可能很快又被重新感染所以一旦培育得到无病毒苗,就应很好地隔离与保存
二、无病毒苗的利用无病毒苗在生产中的利用也要防止病毒的再感染生产场所应隔离病毒感染途径,做好土壤消毒或防蚜等工作在此种植区及种植规模小的地方,要较长时间才会感染而在种植时间长、轮作及种植规模大的产地则在短期内就可以感染一旦感染,便会影响产量和质量的保证因此,应重新采用无病毒苗,以保证生产的质量
三、无病毒苗的效果无病毒苗可以表现出明显的优良效果如草莓可增产20%—50%,植株结果多,单果重增加,上等果比例提高菊花切花品种的脱毒株,表现出株高增加,切花数增多,花朵大,切花较重等特点第四章、原生质体培养与体细胞杂交原生质体:原生质体指采用机械或酶解法去掉了细胞壁的裸露的且具有活力的细胞是通过质壁分离与细胞壁分开的部分,是能存活的植物细胞的最小单位1880,Hanstein最早用来指细胞壁包围的活物质原生质体培养的应用及意义
1、种质资源保存原生质超低温保存,始于20c70s;具有单细胞保存的所有优点量大,质均;利于研究低温伤害和细胞内结冰
2、原生质体融合远缘亲合雄配子胞质遗传
3、筛选突变体量大,质均,无胞壁障碍
4、遗传转化原生质体作为遗传转化的受体系统优点大量一致单细胞;易获得转化植株;容易摄取外缘遗传物质;固体包埋培养,可以避免转化嵌合体的产生
5、易于遗传理论、生理生化的基础研究研究膜结构;壁再生;跨膜交换……
4.
1.3原生质体的分离与制备要分离植物原生质体,必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁分离机械法,即将叶肉细胞,愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖溶液中,使之质壁分离,原生质体收缩成球形然后用剪刀剪碎组织,就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体不过这种方法分离的原生质体太少,而且只能适于部分组织酶解法,所以目前普遍采用酶分离法来获得原生质体
一、植物材料一般来说,植物各个器官,如根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料但是,要获得高质量的原生质体,则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料材料的生理状况是原生质体质量的决定性因素之一
(一)细胞悬浮培养物选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织---------------悬浮培养-------------细胞的大小变得较为一致,且细胞质变得较浓时,可用作分离原生质体
(二)叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的细胞材料,取生理状态适宜的叶片,有利于原生质体的细胞再生和细胞分裂要获得良好的培养材料,下列外界因素是考虑的重要因子1光强为3000-6000Lx2温度为20~25℃培养3相对湿度在60%~80%左右植物的其他器官也适合用于分离原生质体,如用花粉四分体等
(三)植物材料的预处理对原生质体材料进行预处理能提高原生质体的分裂频率;也可以逐步提高植物材料的渗透压,以适应培养基中的高渗环境这些处理包括暗处理、预培养、低温处理等二酶
(一)酶的种类构成植物细胞壁的三个主要成分是
①纤维素
②半纤维素
③果胶质纤维素酶是从绿色木霉中提取的一种复合酶制剂,总体作用是降解纤维素,得到裸露的原生质体果胶酶是从根霉中提取的,使细胞间的果胶质降解,把细胞从组织内分离出来半纤维素酶制剂可以降解半纤维素为单糖或单糖衍生物此外,还有蜗牛酶,主要用于花粉母细胞和四分体细胞
(二)渗透稳定剂在酶液、洗液和培养液中渗透压应大致和原生质体内的相同,或者比细胞内渗透压略大些渗透压大些有利于原生质体的稳定,但也有可能阻碍原生质体的分裂过低,易造成细胞膜破裂渗透稳定剂常用的两种系统为
①糖溶液系统
②盐溶液系统另外,添加牛血清蛋白可减少或防止降解壁过程中对细胞器的破坏近年来多采用在盐溶液内进行原生质体分离,然后再用糖溶液作渗透稳定剂的培养基中培养此外,酶溶液里还可加入适量的葡聚糖硫酸钾,它可提高原生质体的稳定性这种物质可使RNA酶不活化,并使离子稳定
(三)酶溶液的pH值酶溶液的pH值对原生质体的产量和生活力影响很大
三、原生质体的分离分离原生质体时,首先要让酶制剂大量地吸附到细胞壁的纤维素上去,因此,一般先将材料分离成单细胞,然后分解细胞壁采用将酶液减压渗入组织,或将组织切成薄片等方法,都可增加酶液与纤维素分子接触的机会酶处理目前常用的多是一步法,即把一定量的纤维素酶,果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液,材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体由于不同材料的生理特点不同,在研究游离条件时,必须试验不同条件参数如酶量、酶解时间、温度、渗透压、ph值、黑暗酶解、去处表皮、切成细丝等二原生质体培养成功的技术关键1原生质体的活力形态识别荧光显微镜识别(FDA染色)2原生质体密度104-105/ml3细胞壁再生速度早快4培养营养和环境光具有叶绿体的原生质体初期培养最好在光下温度一般25---26℃;湿度
4.2原生质体融合(体细胞杂交)因为应用植物的根、茎、叶等营养器官及其愈伤组织或悬浮细胞的原生质体进行融合,所以称之为体细胞杂交体细胞杂交育种克服了远缘杂交中某些障碍,如杂交不亲和性等,从而更广泛地组合各种植物的遗传性状,为有效地培育新品种,开辟了一条崭新的途径
4.
2.1融合方式原生质体的融合方式分自发融合和诱导融合两类
1.高pH一高钙法;
2.聚乙二醇法
4.
2.2融合过程异种原生质体先经膜融合形成共同的质膜,然后经胞质融合,产生细胞壁,最后是核融合细胞核的融合是异种原生质体融合的关键融合体只有成为单核细胞后才能继续生长,才能合成DNA、RNA,并进行细胞分裂,这就要求两个核必须同步分裂,如果两个核所处时期不同,一个开始合成DNA,另一个还处于合成的中途或已完成了复制,它们之间就会相互影响,导致最终不能进行细胞分裂第五章、花粉与花药培养指在人工合成培养基上,改变其发育机能,即不经过受精发生的细胞分裂,由单个花粉粒发育成完整植物由于都能获得同花粉染色体构成相同的单倍体植株,经染色体加倍而成为正常结实二倍体植株所以后者属于真正的纯系这和常规多代自交纯化方法相比,可节省大量的时间和劳力同时,花药和花粉培养是研究减数分裂,花粉生长机制的生理、生化、遗传等基础理论的最好方法花粉植物通过利用花药或花粉粒进行离体培养,使之长出愈伤组织callus或胚状体embryoid,然后由其分化成植株这些植株就称为花粉植物Pollenplant 其主要特点有单倍体,故又称单倍体植物;不能正常开花结实,需经人工或自然加倍,才能正常结实; 通过加倍,可以很快得到纯合二倍体植物purediploidplant.
5.1花药的培养花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上,来改变花粉的发育程序,使其分裂形成细胞团,进而分化成胚状体,然后再生植株,或形成愈伤组织,由愈伤组织再分化成植株
5.
1.1花药材料的选择最适宜的花药发育时期,因植物种和品种而不同但大多数是单核期根据细胞观察推测,双核期的花粉中开始积累淀粉,不能使花粉发育成植株
5.
1.2培养基的选择花药培养所采用的培养基是MS、N
6、B5等添加的激素有6-BA、KT和玉米素,2,4-D,NAA和IAA等诱导愈伤组织的培养基可添加2,4-D,花药培养在某些情况下,可不经愈伤组织阶段,直接产生胚状体但多数情况下是产生愈伤组织,这时尚需要进一步转移到分化培养基中,诱导分化产生芽蔗糖浓度对花粉的诱导生长有一定作用在辣椒花药培养中以6%的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高在番茄花药培养中需要量高达14%其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故,即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长,而利于花粉的生长
5.
1.3花粉预处理花药在消毒前,进行预处理,将花蕾剪下放入水中,在冰箱4~50C下保持3~4d低温贮藏后,花药容易发生胚状组织高温处理一般在35℃处理1—3天为避免花蕾失水,可将花蕾置于内装有浸湿的虑纸的培养皿中,进行处理
5.
1.4消毒接种培养
5.2花粉的培养花粉培养是指把花粉从花药中分离出来,以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术由于花粉已是单倍体细胞,诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株且不受花药的药隔、药壁、花丝等体细胞的干扰但缺点是较比花粉培养难度大
5.
2.1花粉分离收集由于花粉包于花药内,必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养方法1)自然释放法 将花药接种于液体培养中,使花粉自然释放 2)人工挤压法 用玻璃棒捣碎花药,使花粉释放3)机械法 用磁力搅拌器打碎花药,释放花粉以上3种方法释放的花粉粒→尼龙网(孔径20—60um)过滤,除去药壁等组织→离心收集花粉
5.
2.2花粉的预处理1低温处理低温处理通常是常用也是效果比较好的一种处理方法在花粉第一次有丝分裂期进行低温处理时,在黑暗条件下以植株、花蕾、花粉、花药等作材料比较,以处理分离的花蕾效果最好2重力的作用在烟草花粉培养中,在从花蕾中取出花药前1h,在5℃条件下进行低温离心机离心,可提高单倍体的诱导率另外,在玉米上试验也有同样效果
5.
2.3培养基成分在花粉培养中可添加一些物质,有促进生长的作用培养基选用Nitsch作基本培养基,含有诸如硝酸钙、硫酸、柠檬酸铁、酵母浸出液和椰子胚乳等
5.
2.4花粉培养方法1微室培养法取含有50~80粒花粉的一滴培养液放在微室培养装置中,为了防止花粉破裂,应在低温条件下4℃以下接种,然后在20℃下培养2看护培养法看护培养时,把花药放在琼脂培养基表面上,然后在每个花药上覆盖一小块圆片滤纸用移液管吸取1滴已准备好的花粉粒悬浮液(20个花粉粒/ml),滴在每个小圆片滤纸上培养在25℃和一定光照强度下,大约一个月长出细胞群由于完整的花药发育过程释放出有利于花粉发育的物质,并通过滤纸供给花粉,促进了花粉的发育一般以液体培养,密度104—105/ml;形成愈伤组织或胚状体,转入固体培养基花粉培养诱导单倍林植株除用于培育农作物新品种外,还有如下的一些用途(1)利用单倍体获得纯系;(2)利用花粉植株进行异源染色体或基因转移;(3)利用单倍进行突变体选择第六章、胚培养与胚抢救技术
(1)胚胎培养(成熟胚培养/幼胚培养)
(2)胚珠培养未受精胚珠,培养目的是为试管受精提供雌配子体受精后胚珠,胚的发育处于早期
(3)胚乳培养指处于细胞期胚乳的培养
(4)试管受精撒播花粉至试管培养的未受精的胚珠上,使之发育成有生活力的种子
6.
1.2胚培养的意义克服种、属间受精障碍;打破种子休眠;缩短育种周期;克服种子生活力低下,提高萌发率;克服种子的自然不育性;种子生活力的测定;获得多倍体
6.
1.3离体胚培养的方法一般胚龄越大培养成功率越高主要取决于培养基的组成成熟胚只需提供简单的营养元素(糖、盐分);幼胚还需要有机物与激素;早球胚期(20~40um)的幼胚需要的营养尚不清楚
6.
1.4离体胚培养的技术关键
(1)培养基渗透压糖是培养基渗透压调节的主要成分,其在胚培养的培养基中有三个作用调节渗透压、作为碳源和能源、防止幼胚早熟萌发
(2)培养基酸碱度因植物种类而异,但作用显著通常为
5.2~
6.3
(3)环境条件主要是光照条件一般不需光照;但少数植物光下比全暗条件下胚生长好,如荠菜(4)其他因素1 胚柄完整 利于胚培养成功2 胚乳看护培养异种或同种胚乳共培养;3 胚珠看护培养
6.
1.5胚乳培养一般被子植物胚乳细胞是由精细胞和二个极核融合而成,故含3套染色体由于胚囊类型(含极核数)不同,参加融合的极核数目或极核的倍性不同,胚乳的倍性也不同
(1)胚乳培养的意义
(2)研究进展仅能形成愈伤组织的植物巴婆、黑麦草、黄瓜、檀香、小麦、沙针、美洲槲寄生、澳洲根寄生达到器官分化水平的植物玉米、蓖麻、巴豆、麻疯树、变叶木、黑种草、葡萄荷叶芹、柏形外果、印度五蕊寄生、白花寄生、酸细檀、怒江钝果寄生、楔叶钝果寄生能形成完整植株的植物罗氏核实木、大麦、水稻、苹果、柚、橙、马铃薯、桃、荷叶芹3胚乳培养的方法及技术关键A胚乳发育时期双受精后的胚乳核,先分裂形成游离核(“游离核期”),继续发育后形成细胞壁,即“胚乳细胞期”前者很难,后者易B胚性因子EmbryofactorC培养基酸碱度
6.
1.6离体受精概念和意义从花粉到受精形成种子,从种子萌发到幼苗形成的整个过程,均在试管内完成,称离体受精,或试管受精离体受精的方法1裸露胚珠+撒花粉2带胎座(完整或部分)+撒花粉3带子房(完整或部分)+撒花粉4柱头接近法柱头+----花粉+异种裸露胚珠5哺育法胚珠表面蘸满有助于花粉发芽的培养基+撒花粉离体受精成功的技术关键1离体胚珠的成活率和受精力培养基是关键2花粉萌发和花粉管的生长速度培养基,Ca、B3花粉的灭菌花蕾浸渍法,剥出花粉粘连;自行裂开难保证花粉具有高的萌发率和受精力(率)4鉴别受精的标记性状离体受精与否直接鉴定较困难
6.2胚抢救/挽救技术针对部分植物胚胎发育进程中败育现象,把幼胚离体培养成完整植株的过程,称胚抢救或胚挽救技术因为培养对象一般是发育早期的胚胎,故培养难度较大
6.3胚培养与胚抢救技术的应用
7.1突变体的筛选及应用
7.
1.1突变体筛选的概念1自发突变如芽变,突变率为10-7—10-62人工诱变(理化诱变)10-6—10-4但盲目性大3生物化学诱变筛选把植物细胞培养在附加一定化学物质的培养基上,用生物化学的方法,从细胞水平上大量筛选拟定目标的突变体人工诱变的特点
①突变频率比自然突变高几百倍至几千倍,且变异谱广泛;
②由诱变引起的染色体http://www.wiki.cn/wiki/%E6%9F%93%E8%89%B2%E4%BD%93\o染色体断裂与重接,可打破优良性状与不良性状间的连锁;
③能比较有效地改良个别性状如早熟、矮秆、抗病、优质等;
④诱发的变异较易稳定中国在宋朝宣和年间曾有用药物处理牡丹http://www.wiki.cn/wiki/%E7%89%A1%E4%B8%B9\o牡丹的根http://www.wiki.cn/wiki/%E6%A0%B9\o根,从而诱发花色变异的记载太空蔬菜相比一般蔬菜生化诱变方法筛选突变体的诱导诱变数量大,诱变几率高1ml单细胞可有十几万至几十万个细胞与种子、苗木、插条比较,从细胞水平上诱发突变,重复性好,稳定性好突变体的主要应用
1、为细胞杂交和基因导入提供选择记号
2、用于遗传和代谢研究
3、对农作物性状进行遗传改良
7.
1.2突变体筛选目标
(1)改良作物品质
(2)抗病突变体筛选
(3)抗盐突变体筛选
(4)抗逆突变体筛选5高光效突变体筛选6其它目标
7.
2.1突变体筛选机理水稻高赖氨酸突变体筛选和烟草抗野火病(高蛋氨酸)突变体筛选,利用生物合成代谢过程中反馈调控的原理而获得成功的化学诱变育种的特点操作方法简便易行专一性强特定的化学药剂,仅对某个碱基或几个碱基有作用,因此可改变某品种单一不良性状,而保持其它优良性状不变化学诱变剂可提高突变频率,扩大突变范围化学诱变可诱变出自然界往往没有或很少出现的新类型,这就为人工选育新品种提高了丰富的原始材料化学诱变剂是靠其化学特性与遗传物质发生一系列生化反应造成的,多基因点突变,且有迟发效应,在诱变当代往往不表现,在诱导植物的后代,才表现出性状的改变因此,至少需要经过两代的培育、选择,才能获得性状稳定的新品种诱变后代的稳定过程较短,可缩短育种年限经过化学诱变剂处理后,用种子繁殖的一二年生草花,一般F3代就可稳定,经3~6代即可培育出新品种物理诱变的特点应用较多的是辐射诱变,即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异生物体内各种分子便产生电离和激发,接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团它们继续相互反应,并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应,引起分子结构的改变由此又影响到细胞内的一些生化过程,如DNA合成的中止、各种酶活性的改变等,使各部分结构进一步深刻变化,其中尤其重要的是染色体损伤由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变http://www.wiki.cn/wiki/%E5%9F%BA%E5%9B%A0%E7%AA%81%E5%8F%98\o基因突变那些带有染色体突变或基因突变的细胞,经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官,即可产生生物体的遗传变异粒子辐射和微重力作用可能是种子基因空间诱变的主要原因
7.3植物细胞突变体的选择方法1直接选择法主要用于抗性突变体的选择如抗生素,代谢类似物,某些离子先用一个较低的筛选浓度,进行初步筛选2富集选择法主要用于营养缺陷型突变体的筛选最低培养基加入5-溴去氧核苷,非突变细胞因DNA合成而死亡,突变体细胞在最低培养基上不能DNA合成,而存活下来,但出于饥饿状态进一步选择最低培养基平板培养,能在添加物下进一步分裂生长的细胞,就是目的细胞
7.4突变体筛选程序共6步骤预处理-----预培养----反馈诱发突变----高抗(高产)突变细胞株选择----突变细胞团的形成及再生----突变系鉴定
(1)预处理(制备单细胞)材料选择用茎尖,腋芽等,但容易诱发嵌合体最理想的材料是单细胞或原生质体,但范围有限故一般使用愈伤组织细胞A愈伤组织介于单细胞和具有一定结构的组织之间的组织B愈伤是分生细胞容易诱发突变C愈伤组织分散性好,借助酶处理分散性更好制备细胞悬浮液经预处理的材料用糖液洗净,(愈伤需酶解分散),过滤,离心沉淀,获得纯净的细胞悬浮液
(2)预培养单细胞或愈伤组织经诱变剂处理和酶处理后活力下降,为恢复细胞活力必须进行预培养方法1平板培养;方法2悬浮培养培养时间因植物种类而异,一般1~2周
(3)反馈诱发突变一般采用平板培养法培养基中加入选择因子,反复饲喂数月
(4)高抗、高产细胞株的选择经数月选择培养的细胞团,转入不加选择因子的培养基中培养数周后,再次转入具有选择因子的培养基中培养数周后,选择生长旺盛的细胞团,说明该细胞团具有抵抗改种选择因子的突变细胞株
(5)细胞增殖与器官建成单倍体细胞—加倍---诱导原生质—壁再生—诱导体细胞—诱导
(6)突变株系的鉴定和遗传分析第八章、植物种植超低温保存与人工种子
8.
1.2超低温冷冻保存种质的方法及原理------植物材料超低温冻存的细胞学基础A常用方法冷冻防护剂处理-196℃液氮库常用的冷冻防护剂甘油、甘露醇、脯氨酸、二甲基亚砜(DMSO;常用浓度5%---10%
1、细胞内外水的冻结状态是细胞冻存技术的关键植物细胞中含有大量的水分,约占细胞总重量的60~90%细胞中的水是由游离水和束缚水组成,其中游离水约占90%,很容易冻结由于细胞内含有复杂的化合物,细胞内的溶液并不象纯水那样在0℃左右结冰植物细胞超低温保存过程中的致死损伤细胞超低温保存有三个重要操作步骤一是细胞预冻;二是细胞在-196oC下长期贮存;三是细胞解冻植物超低温保存技术建立在生物细胞冻害和抗冻机理的基础之上种质超低温保存成功的关键,在于降温冰冻过程中避免细胞内结冰为此,针对不同种类的植物材料,筛选适合的冰冻保护剂,采用适当的降温冰冻速度和化冻方式,可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度玻璃化保存方法玻璃化是指液体转变为非晶体(玻璃态)的固化过程使溶液玻璃化有两条途径一是大幅度提高冷却速率;二是增加溶液浓度1.玻璃化法2.包埋玻璃化法B(防护剂)超低温冷冻保存原理a低分子量的中性分子,在水溶液中可强烈结合水分子,使溶液黏度增加冰点下降b提高培养基渗透压,胞壁轻微质壁分离,提高细胞和组织抗寒力cDMSO还极易渗入细胞内部,可防止冷冻和融冰时,细胞过度失水人工种子的优点1.繁殖速度快2.可固定杂种优势,使杂交种多代利用3.抗逆强4.可以快繁昂贵种子和不结实种子5.与普通试管苗比较,其成本低,运输方便6.可以成为基因工程技术应用到生产中的桥梁其制种技术包括胚状体诱导与形成,人工种皮的制作与装配两个主要步骤制人工种子对胚状体的要求是形态应和天然胚相似,其发育须达子叶形成时期,萌发后能生长成具有完整茎、叶的正常幼苗;其基因型应等同于亲本;耐干燥且能长期保存要求人工种皮内应富含营养物质、激素、维生素、菌肥及化学药剂等,供胚状体萌发生长等需要还要求有一定的硬度,保护胚状体顺利萌发生长,免遭机械损伤,且有利于机械化播种人工种皮常用的材料是褐藻酸盐1胚状体这是由组织培养产生的具有胚芽、胚根双极性、类似天然种子胚的胚状结构,具有萌发长成植株的能力2人工胚乳它包括胚状体生长所需要的多种营养,而且还添加了一定量的激素、抗生素、农药、除草剂以及有益微生物等成分,提供胚状体正常萌发生长期所需的各种条件3人工种皮这里包被在人工种子最外层由褐藻酸钙构成的具有防水透气的凝胶膜状物质,具有一定的机械抗压性
8.
2.3人工种子制作的技术核心导胚状体同步化生长是制备人工种子最为核心的问题一般情况下我们可以采取以下措施
(1)低温法
(2)分离法
(3)抑制剂法
(4)通气法
8.
2.
3.2人工胚乳的制备人工胚乳的营养成分与进行细胞和组织培养时所需的营养成分基本相同,我们还可以根据胚生长发育所需,加入一些大分子的碳水化合物,用来防止养分的遗漏如果可以,还可以在培养基中加入适量的激素和抗生素等进行辅助作用一般情况下,可以用MS培养基进行离体培养
8.
2.
3.3包埋剂的配制及包埋方便,无毒无污染,价格低廉,透气性强,保水作用机械性能好的材料,到目前为止褐藻酸钠就最为适合其次就是琼脂
8.
2.
3.4人工种子的贮藏一般在4摄氏度左右的温度下保存,随着时间的延长,萌发率会呈现出下降的趋势,这可能和人工种子没有休眠有关
8.
2.4人工种子在利用中的问题
1.贮藏问题人工种子含水量大,容易失水,所以只能用液体石蜡来贮藏才会有一定的效果,但还没有一种真正实用的方法2体细胞无性系变异在人工种子中尽管还存在着变异,但只要的农艺性状(产量、品质、抗逆性)没有受到大的影响,就可以利用3成本问题成本问题是目前限制人工种子在商业利用中的最大的问题,如每粒苜蓿种子的成本为
0.264美分而天然种子的成本仅
0.00066美分,可见其价值的悬殊性,就不难想到,成本成为人工种子生产与利用的最大限制第九章、植物细胞反应器与次生物质生产
9.1植物反应器与植物次生物质原义生物反应器是使生物反应得以实现的装置新意通过组织培养、基因工程等手段,强化或专门生产某种代谢物的生物个体、器官、组织或细胞但,目前的成就主要是加强其自身代谢物表达植物细胞大规模培养的价值1.利用组织培养代替原植物的栽培以获得所需的有效成分,产量高,成本低,还可节约土地2.除了应用于产生次生物质外,还可应用于生物转化3.从组织培养的定性分析中发现新化合物4.一般情况下,组织培养是异养的,但也有自养的细胞系株,它们具有光合作用的能力而不依赖外界的糖类供应这种特性将使细胞培养技术优越于全植物,并更为经济植物反应器同动物反应器的比较降低成本利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本,仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1/10~1/50)安全微量生物活性物质、病毒等储运方便食用方便(注射感染)植物次生产物植物可以产生多种有机化合物,其中许多对植物自身的生长发育似乎没有直接的作用,但对植物适应不良环境或抵御病原物侵害以及植物的代谢调控等有重要作用的种类繁杂的有机物,这些物质称为次生产物(secondaryproduct,或次生代谢物,secondarymetabolite)或天然化合物(Naturalproduct与碳水化合物、氨基酸、蛋白质、核酸、叶绿素、有机酸等初级产物(primaryproduct)不同,次生产物大部分不再参加植物的各种代谢,它们是代谢的终产物,被贮存在液泡或细胞壁中另一点与初级产物不同的是,初级产物在整个植物界广泛存在,而次生产物在植物界的分布有很大的局限性,即特定的次生产物只在某一种或一些分类上相关的种中存在虽然次生产物不通过各种代谢途径影响植物的生长发育,但它们具有重要的生态作用(ecologicalfunction)此外,许多次生产物可以作为药物的原料或工业原料,具有重要的经济意义
9.2细胞培养生产有用物质的一般程序1取材在开展细胞培养生产有用物质的选材时,应注意以下先决条件1药效肯定;2对其有效成分有充分的了解;3有测定有效成分的可靠方法;4市场短缺或价格贵重取材应取有药效成分的部位,且该部位较易形成愈伤组织
2、细胞株系建立将诱导产生的愈伤组织分离建立悬浮细胞繁殖体系为了实现细胞培养工业化产品质量,对细胞袜系的选择有两个基本要求,即有用物质的合成积累能力强和生长速度快的细胞株因此,在培养过程中,要不断对培养细胞进行分析,检测其生化合成某些有效物质的能力,筛选合成能力高的细胞袜,不断更新培养的细胞株系
3、大量培养将选出的优良细胞株扩大繁殖后,即可作为细胞工厂化培养的生产“种子”采用成批的、半连续或连续的培养系统,对这些“种子”进行大量培养
4、产品提取与纯化从植物细胞培养物产提取和纯化有用的产品通过组织培养可获得有效成分,但实际上只有大量培养成功才有经济价值因此在生产上常采用悬浮培养法来代替含有琼脂的固体培养基愈伤组织悬浮培养的生长通常比静止培养快,这是由于悬浮培养时营养成分可较快地渗入细胞,抑制生长的代谢废物可较快地除去,同时供氧情况也较好,在进行这种培养时要注意通气与定期更新营养液,这是保证生长稳定,次生物质产量高的关键之一
9.3提高有用物质生产效率的技术因素
1、筛选高产细胞系
(2)、二步培养法离体培养实验证明,脱分化的细胞生长旺盛,很难积累次生物质当培养细胞接近于衰老时,才趋向于积累次生代谢物
(3)、培养基中添加前体
(4)、培养基中生长调节剂的作用
(5)、培养条件的影响光照,温度等
(6)、诱导添加物第十章、基因工程原理与技术基础
10.1基因工程的基本概念A重组DNA技术的概念重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术(即狭义的基因工程)因此,供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件B基因工程的概念基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程C基因工程的基本用途基因工程可以绕过远缘有性杂交的困难,使基因在微生物、植物、动物之间交流,迅速并定向的获得人类需要的新的生物类型概括地讲,其意义体现在以下三个方面分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质(基因调节)设计、构建生物的新性状甚至新物种(正义、反义)意义
一、第四次工业大革命
1.医学抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂;
2.轻工食品氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体;
3.能源石油二次开采、纤维素分解、太阳能转化;
4.环保微生物生态种群;
5.信息蛋白芯片、基因芯片;日本政府称基因工程为战略工业
二、第二次农业大革命
1.蛋白类杀虫剂(生物农药)、抗广谱虫害植物;
2.农作物品种改良;高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状;
3.畜牧业;高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率;
4.固氮
三、第二次医学大革命(麻醉外科术是第一次医学大革命)
1.分子病(文明病富贵病)基因治疗,遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症;
2.抗衰老端粒酶编码基因(具有逆转录酶的功能,能以自身的RNA为模板合成端粒DNA,从而维持端粒的长度) 基因疗法; 补充突变基因原始产物; 更换突变基因D基因工程的基本形式第一代基因工程蛋白多肽基因的高效表达经典基因工程第二代基因工程蛋白编码基因的定向诱变蛋白质工程第三代基因工程代谢信息途径的修饰重构途径工程第四代基因工程基因组或染色体的转移基因组工程
10.4基因工程基本过程
1、材料的准备目的基因、载体、工具酶和受体细胞(宿主)的准备用限制 性内切酶分别将外源DNA和载体分子切开
2、目的基因与载体DNA的体外重组,形成重组DNA分子
3、重组的DNA分子引入受体细胞,并建立起无性繁殖系
4、筛选出所需要的无性繁殖系,并保证外源基因在受体细胞中稳定遗传、正确 表达
10.5载体
(1)克隆载体;(2) 表达载体基因的运输工具——载体载体特点
1、至少有一个复制起点,因而至少可在一种生物体中自主复制
2、 至少应有一个克隆位点,以供外源DNA插入
3、 至少应有一个遗传标记基因,以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞
4、具有较小的分子量和较高的拷贝数注前三个特点必不可少重组菌的蓝白斑筛选lacZ(lacZα)中含有多克隆位点,当无外源DNA片段插入时,质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽,与缺失突变体宿主菌(不能编码α-肽)表达的lacZ基因产物(β链)互补,产生有活性的β—半乳糖苷酶,在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下,菌落呈现兰色;外源基因的插入后,破坏了lacZα-肽基因的结构,细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性,菌落呈白色表达载体
一、大肠杆菌表达载体
二、穿梭载体
三、整合载体
10.6工具酶基因的剪刀——限制性内切酶基因的针线——DNA连接酶DNA聚合酶重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术(即狭义的基因工程)基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质(基因调节)设计、构建生物的新性状甚至新物种(正义、反义)
一、第四次工业大革命
1.医学抗病毒、抗癌因子、新型抗生素、疫苗、抗衰老保健品、心脏血管药物、生长因子诊断剂
2.轻工食品氨基酸、助鲜剂、甜味剂、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶蛋白酶、生物拆分混旋体
3.能源石油二次开采、纤维素分解、太阳能转化
4.环保微生物生态种群
5.信息蛋白芯片、基因芯片日本政府称基因工程为战略工业
二、第二次农业大革命
1.蛋白类杀虫剂(生物农药)、抗广谱虫害植物;
2.农作物品种改良;高营养、长保存、抗环境压力、花卉颜色与型状;
3.畜牧业;高蛋白乳汁、鱼生长激素、饲料利用率
4.固氮
三、第二次医学大革命(麻醉外科术是第一次医学大革命)
1.分子病(文明病富贵病)基因治疗,遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症、过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症
2.抗衰老端粒酶编码基因(具有逆转录酶的功能,能以自身的RNA为模板合成端粒DNA,从而维持端粒的长度) 基因疗法;补充突变基因原始产物;更换突变基因十一章、基因的分离与克隆
11.1基因
11.
1.1基因的发现A 孟德尔(G.J.Mendel)和他的黄色绿色的豌豆遗传因子假说)B 摩尔根和他的黑腹果蝇(染色体遗传理论)C、克里克和DNA双螺旋结构模型
11.
1.2基因的定义 基因是DNA分子上含特定遗传信息的核育酸序列的总称,是遗传物质的最小功能单位
11.2目的基因获得的方法
一、目的基因用来改造生物个体或用于生产某种产物的有用基因
二、目的基因获得方法
1、化学合成法
2、基因组文库法将基因组DNA切割成片段后,直接克隆构建成基因组文库,从基因组文库中查找有用克隆的编码序列的方法片段切割识别序列为4碱基的限制性内切酶、或非专一性酶核酸酶部分降解、化学试剂处理、机械剪切克隆载体病毒、噬菌体、酵母人工染色体优点能够获得未知基因;缺点包含内含子序列
3、cDNA文库法以生物体内mRNA合成cDNA后直接克隆构建成cDNA文库,从中查找有用基因的方法片段来源mRNA逆转录;克隆载体质粒载体优点便于获得表达的基因的序列,获得得序列为编码序列无内含子,费用较低缺点无法获得未表达或表达水平较低
4、PCR法参照已知基因序列,在该基因序列保守区域设计两个引物,用PCR反应获得两个引物之间该基因DNA序列的方法引物来源已知基因序列;片段获得PCR优点操作容易、目的性强;缺点不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因,含内含子
5、RT-PCR法提取生物体内mRNA,反转录形成cDNA.参照已知基因序列,在该基因序列保守区域设计两个引物,以cDNA为模板经PCR反应获得两个引物之间该基因编码序列的方法引物来源已知基因序列;片段获得RT-PCR优点操作容易、目的性强;缺点不能克隆未知基因或序列同源性较差的基因
6、来自差异显示片段
7、来自已知蛋白蛋白测序----------------〉DNA序列三插入片段验证将已经连接外源DNA的细菌质粒载体转化感受态的大肠杆菌,然后对受体大肠杆菌进行筛选,从大量的个体中筛选出含有目的基因克隆载体的菌株,称为重组质粒筛选
1、抗性筛选
2、蓝白筛选
3、酶切验证
4、PCR检测
5、测序验证十二章、植物转基因技术基因工程操作的一般步骤
1、获得目的基因(DNA片段);
2、目的基因克隆(复制)与验证;
3、表达载体构建将目的基因与载体组合成能在目的生物中表达的形式(重组DNA);
4、转化把重组DNA引入某种受体生物或细胞;
5、筛选从大量的受体中筛选出可能具有目的基因且目的基因能够表达的个体或细胞一生物表达系统的特异性不同生物中,启动基因的表达需要不同的表达系统在原核生物中,需要原核生物启动子和终止子;在植物中,需要适合植物的启动子和终止子在大肠杆菌中,经常使用的启动子有Tac(乳糖和色氨酸杂交)和Lac(乳糖)、PL和PR、和T7(噬菌体)启动子在植物中,经常使用的启动子有花椰菜花叶病毒35S(CaMV35S)启动子,胭脂碱合成酶基因NOS终止子U6或H1启动子;OCS章鱼碱合成酶终止子)二植物表达载体系统作为植物遗传转化的表达载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子目前的载体系统有病毒的表达载体系统和质粒的表达载体系统两大类
1、质粒载体系统
2、病毒载体系统三表达载体构建过程1.片段获得酶切法2.连接(1)表达载体与基因片段连接(2)连接操作同克隆连接
(四)表达载体验证1.标记基因筛选2.酶切鉴定法3.PCR鉴定法4.DNA杂交斑点杂交、菌落原位杂交五工程菌构建 将表达载体导入介导生物农杆菌或病毒
12.2基因转化受体系统一植物受体系统1、植物组织受体系统2、植物细胞原生质体3、生殖细胞受体系统
(二)动物受体系统细胞微生物受体系统感受态细胞
1、植物组织受体系统 愈伤组织的细胞处于旺盛分裂状态,细胞壁较薄,容易接受外源DNA该受体系统转化率高,可获得较多的转化植株,取材广泛、适用性广但再生植株无性系变异较大,转化的外源基因稳定性差,嵌合体多
2、植物原生质体受体系统原生质体是植物细胞除去细胞壁后的部分,是一个质膜包围的“裸露细胞”原生质体在体外比较容易完成一系列细胞操作或遗传操作,可以直接高效的捕获外源基因原生质体接受外源基因后再生可以发育成纯合体缺点遗传稳定性更差,培养周期长,难度大,再生频率低
3、生殖细胞受体系统以植物生殖细胞如花粉细胞、卵细胞为受体细胞的转化系统一是单倍体愈伤组织细胞分化发育成单倍体植株,从而建立单倍体的基因转化系统;二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化,如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房微针注射法等一旦将外源基因导入这些细胞,可以遗传,利用植物自身的受粉过程,具有操作方法方便、简单不足之处是季节的限制,无性繁殖的植物不能采用
12.3基因转移把外源DNA导入生物体,使生物体发生某种变化的过程称为转化Transfermation把一种生物的基因导入到另外一个生物体内的过程称为基因转移genetransfer. 把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞,若受体细胞是细菌,通常称转化;若受体细胞是动/植物细胞,通常称转染
一、直接转化法直接将纯化的携带有外源基因的DNA导入生物体的方法根据所采用的原理,可以分为
1、物理方法
2、化学方法
1.物理方法通过物理方法打开细胞屏障细胞壁和细胞膜,将外源基因直接导入生物体的方法1电激法电穿孔法细胞膜在适当的外加电压作用下,细胞膜有可能被击穿外源DNA分子会通过这些孔洞进入细胞中外源基因进入后可能会整合到染色体上利用这一原理,将原生质体与外源基因混合,然后在一定的电压下进行短时间直流电脉冲,电击后的原生质体被转移至培养基中培养,根据选择标记筛选带有标记基因的转化子2超声法超声穿孔法3热激法4显微注射法5激光法激光穿孔法6基因枪法微弹法
2.化学方法 1聚乙二醇PEG法 PEG和二价阳离子(如Mg2+、Ca2+、Mn2+)及DNA常在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内吸作用而被吸收 2脂质体法 带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物,然后脂质体上剩余的电核与细胞膜上的唾液酸残基的负电核结合;另一种解释是通过细胞是内吞作用而被进入细胞
3.种质介导转化法1花粉管通道法授粉后使外源DNA能沿着花粉管渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化还不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出,我国目前推广面积最大的转基因抗虫棉就是用花粉管通道法培育出来的2生殖细胞浸泡法将受体植物外植体如种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、花药悬浮细胞培养物等直接浸泡在外源DNA溶液中,利用渗透作用把外源基因导入受体细胞并稳定整合和遗传3胚囊、子房注射法使用显微注射仪把外源基因溶液注射到子房或胚囊中,由于子房或胚囊中产生的压力和卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中,从而获得转基因植株
二、间接转化法生物转化法
1.病毒介导法通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互作用而进入宿主细胞,之后反转入酶启动合成DNA并随机整合到宿主基因组中有些病毒是先和细胞表面的受体结合,继而被细胞内吞1双链DNA病毒:CaMV花椰菜花叶病毒、DaMV大丽花花叶病毒、CEKV石竹饰刻斑纹病毒2单链DNA病毒3单链RNA病毒
2.农杆菌介导法有两种农杆菌根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和发根农杆菌A.Rhizogenes,被广泛用于植物转基因原理农杆菌的毒区基因可在一定条件下酸性条件和酚类诱导物如乙酰丁香酮的存在,将DNA分子的一部分可以转入植物细胞并插入到植物基因组中农杆菌介导转化法;1整体植株接种共感染法受体材料无菌苗、种子实生苗优点试验周期短、具有较高的转化效率缺点嵌合体多、筛选困难、瞬时2叶盘转化法受体材料无菌苗叶片优点适用性广、重复性好缺点部分材料叶盘再生困难原理把无菌苗叶片剪切成圆形或方形叶盘,人为地造成较大的伤口/面积比,诱导农杆菌的侵染活性,叶盘浸蘸接种农杆菌后,与农杆菌共培养一段时间后,目的基因可经农杆菌整合到植物染色体上,经转接到脱菌培养基上除去农杆菌,经筛选后可得转化植株3原生质体共培养转化法受体材料:原生质体优点易转化、无嵌合体缺点再生困难3原生质体共培养转化法受体材料;原生质体优点易转化、无嵌合体缺点再生困难
12.4筛选与检测
1、抗生素抗性筛选
2、报告基因检测筛选
3、DNA检测
4、mRNA检测
5、蛋白质检测
6、蛋白质活性检测
7、田间鉴定基因工程操作的一般步骤
1、获得目的基因;
2、目的基因克隆(复制)与验证;
3、表达载体构建将目的基因与载体组合成能在目的生物中表达的形式(重组DNA);
4、转化把重组DNA引入某种受体生物或细胞;
5、筛选从大量的受体中筛选出可能具有目的基因且目的基因能够表达的个体或细胞十三章、分子标记
13.
1.遗传标记与分子标记的概念遗传标记geneticmarkers是鉴别基因组中基因位点locus的手段,是易于识别而可遗传的实体指可以明确反映遗传多态性的生物特征是研究遗传现象和物种进化的不可缺少的工具遗传标记主要有4种类型:形态标记;细胞标记;生化标记;分子标记分子标记的概念广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)狭义的分子标记概念只是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段,它直接反映基因组DNA间的差异目前分子标记已广泛用于植物分子遗传图谱的构建;植物遗传多样性分析与种质鉴定;重要农艺性状基因定位与图位克隆;转基因植物鉴定;分子标记辅助育种选择等方面分子标记的特点
(1)直接以DNA的形式表现,在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到,不受季节、环境限制,不存在表达与否等问题;
(2)数量极多,遍布整个基因组,可检测座位几乎无限;
(3)多态性高,自然界存在许多等位变异,无须人为创造;
(4)表现为中性,不影响目标性状的表达;
(5)许多标记表现为共显性的特点,能区别纯合体和杂合体依其所用的分子生物学的技术大致可以分为
1、以Southern杂交技术为核心的分子标记;代表RFLP、DNA指纹技术;
2、PCR技术为主的分子标记;代表RAPD、SSR、AFLP
3、DNA序列为核心的分子标记;代表STS测序分析
4、以基因芯片等电子计算机检测的分子标记SNP第十四章生物信息学生物信息学Bioinformatics是研究生物信息的采集,处理,存储,传播,分析和解释等各方面的一门学科,它通过综合利用生物学,计算机科学和信息技术而揭示大量而复杂的生物数据所赋有的生物学奥秘生物信息学的主要应用1序列比对2蛋白质结构比对和预测3基因识别非编码区分析研究4分子进化和比较基因组学5序列重叠群Contigs装配6遗传密码的起源7基于结构的药物设计8生物系统的建模和仿真9生物信息学技术方法的研究10生物图像PAGE16。