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《生物技术实践》(选修1)高考复习资料第一部分、微生物的利用本部分“实验2分离以尿素为氮源的微生物”与“实验3观察土壤中能水解纤维素的微生物”不作要求,只要求“实验1大肠杆菌的培养和分离”实验1大肠杆菌的培养和分离
一、教学要求基本要求1.进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基进行细菌培养的操作2.进行大肠杆菌的分离,用固体平面培养基本进行细菌的划线培养发展要求说明大肠杆菌培养的条件和实验原理说明
二、基本内容1.培养基的种类和化学成份培养基的种类有很多划分标准,按物理性质分固体培养基和液体培养基(加入琼脂多少)液体培养基用于扩大培养和工业生产,固体培养基用于菌种分离,鉴定,计数(菌落数量)培养基的化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等按照微生物的同化作用类型是自养还是异养,碳源不同,自养微生物为无机碳源,如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐,异养微生物为有机碳源,如大肠杆菌是葡萄糖等有机物2.常见微生物类群原核生物(如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等)、原生生物(草履虫、变形虫等)、真菌(酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌)、病毒等细菌是单细胞的原核生物,有细胞壁(肽聚糖)、细胞膜、细胞质,无成型的细胞核,只有一环状DNA分子(拟核)以分裂(二分裂)的方式繁殖,分裂速度很快用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液的颜色)和革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁的成分不同大肠杆菌是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧的肠道杆菌3.无菌技术对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒;将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌;为避免周围微生物污染,实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行;避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触比较理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能灭菌方法
①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法
②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法,所用器械是干热灭菌箱
③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法,所用器械是高压蒸汽灭菌锅
④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法,所用器械是紫外灯4.培养基的配制原则目的要明确根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量营养要协调培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜pH要适宜细菌培养基pH中性或偏碱性,霉菌培养基呈酸性5.实验操作步骤
(1)配制培养基计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板(形成斜面是为增大接种面积)我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌,培养后可在LB固体培养基上划线分离以下为本实验中培养基配置步骤
①称量准确称取各成分蛋白胨
0.5g,酵母提取物
0.25g,氯化钠
0.5g,加水50ml配置LB固体培养基时还需加1g琼脂
②溶化加热熔化,用蒸馏水定容到50mL配置LB固体培养基时还需加琼脂,整个过程不断用玻棒搅拌,目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
③调pH用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性
④灭菌在两个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基,加上棉塞将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min
⑤倒平板灭菌后,待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行其过程是
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁,右手拿装有培养基的三角瓶,左手拔出棉塞;
②右手拿三角瓶,使三角瓶的瓶口迅速通过火焰;
③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口的缝隙,右手将培养基倒入培养皿,立刻盖上皿盖;
④待平板冷却凝固后,将平板倒过来放置倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面向培养皿中转移已灭菌的培养基时,也不要把培养基沾在皿壁上否则,空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖,并污染皿内培养基
(2)接种微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法平板划线法(方法简单,考试的主要考查点)通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面(也是分离纯化的方法)在第一次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落稀释涂布平板法(操作复杂,单菌落更易分开)将菌液进行一系列梯度稀释,并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养当稀释倍数足够高时,即可获得单个细菌形成的标准菌落1.划线分离法用接种环蘸菌液后在含有固体培养基的培养皿平板上划线,在划线过程中菌液逐渐减少,细菌也逐渐减少划线到最后,可使细菌间的距离加大在培养10~20h后,可由一个细菌产生单菌落,菌落不会重叠如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上,在斜面上划线,则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代其操作步骤是将培养皿底部用拇指和无名指固定成倾斜状态,在火焰旁将培养皿稍微打开在此同时,用环状接种针在火焰旁取少许菌悬液,迅速送入培养皿内,在平板培养基的一边,作第1次平行划线3~5条,转动培养皿约70°角,用烧过冷却的接种针,通过第1次划线部分作第2次平行划线,然后再用同样方法,通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线划线时,接种针应与平板表面成30°角左右不要使接种针碰到培养皿边缘,也不要将培养基划破划线完毕后,盖上皿盖,倒置于恒温箱培养取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物;除第一次划线外,其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种;取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行,其目的是防止高温杀死菌种;最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者2.涂布分离法先将培养的菌液稀释,通常稀释到10-5~10-7之间,然后取
0.1ml不同稀释度的稀释菌液放在培养皿的固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养,在适当的稀释度下,可产生相互分开的菌落通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后,再做功能性实验
(3)培养平板倒置放在培养箱中培养是为了使水分蒸发形成的水蒸气凝结成的水滴滴留在盖上,同时防止水滴入培养基并扩散开,已形成的菌落随水扩散,相互影响
(4)观察结果(菌落数量、特征等)并分析、评价
三、习题训练1.下表是一种培养基的配方,请回答牛肉膏蛋白胨NaCl琼脂水
0.5g1g
0.5g2g200ml
(1)此培养基从物理性质来说,属于培养基
(2)无菌操作是微生物培养最基本的要求,其中灭菌的主要目的是 对于培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌和消毒方法依次是(填代号)
①化学消毒
②灼烧灭菌
③干热灭菌
④紫外线灭菌
⑤高压蒸汽灭菌
⑥巴氏消毒法
(3)每次在灼烧接种环后,为什么要等其冷却后再进行划线?
(4)用稀释涂布平板法统计菌落数目时,一般选择菌落在平板上进行计数,在某一稀释度下平板上的平均菌落数为50个,所用稀释液的体积为
0.2ml,稀释倍数为105时,则每毫升样品中的菌落数为2.为了研究培养液中大肠杆菌的数目随培养时间的变化情况,某学校研究性学习小组进行了一系列的微生物实验
(1)配置牛肉膏蛋白胨培养基60ml,分装入12支大试管;用记号笔在试管上标明培养时间,即
0、
2、
4、
6、
8、
10、
12、
14、
16、
18、
20、22小时;对12支大试管用方法灭菌
(2)用1ml无菌吸管,在 条件下,每次准确地吸取0.2ml大肠杆菌培养液,分别接种到已编号的12支大试管中,接种后振荡,使菌体混合均匀将12支试管置于摇床上,37℃振荡培养将时间编号的试管在对应的培养时间取出,并对大肠杆菌进行计数
(3)右图是部分学生使用的计数方法,称为法在接种前,都要在火焰上灼烧接种环,并待其冷却后再接种,原因是什么?
(4)有部分学生使用血球计数板法计数对10小时试管计数时,在
0.1mm3容积的400小格的计数室中,经显微镜下观察,随机选取的25小格中大肠杆菌的总数为160个,则该试管中大肠杆菌的总数约为
(5)用
(3)中方法,实际活菌数目比测得的要,因为 ;用
(4)中方法,实际活菌数目比测得的要,因为 3.某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数请回答与此实验相关的问题
(1)培养基中含有蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了氮源和______除此之外,培养基还必须含有的基本成分是 和
(2)对培养基进行灭菌,应该采用的方法是
(3)为了尽快观察到细菌培养的实验结果,应将接种了湖水样品的平板置于 中培养,培养的温度设定在37℃要使该实验所得结果可靠,还应该同时在另一平板上接种 作为对照进行实验
(4)培养20小时后,观察到平板上有形态和颜色不同的菌落,这说明湖水样品中有 细菌一般说来,菌落总数越多,湖水遭受细菌污染的程度越
(5)如果提高培养基中NaCl的浓度,可以用于筛选耐_ _细菌,这种培养基(按功能分)被称为 4.下面是为了鉴定细菌质粒上有无某些常见的抗生素抗性基因的实验取三个已进行灭菌的培养皿,标记
1、
2、3号,在酒精灯旁分别用3支注射器注入1mL蒸馏水、青霉素液、四环素液,并使之分布在整个培养基表面,再用经灭菌的接种环在酒精灯火焰旁,对3个培养皿分别接菌种将接种后的3个培养皿放入37℃恒温箱培养24h请分析回答
(1)若
2、3号培养皿中细菌都不能存活,说明________________________________
(2)长期使用抗生素和过量使用抗生素会导致抗药性强的菌种出现,使原有的抗生素失去杀菌效果,抗生素青霉素对细菌起________________作用;细菌的抗性性状产生来源于________________
(3)在固体培养基表面生长出的菌落在生态系统中称为________
(4)在基因工程中,使用的载体除质粒外,还有________________________________参考答案1.
(1)物理
(2)使用强烈的理化因素杀死体内外所有的微生物,包括芽孢和孢子
⑤③②①④⑥
(3)以免接种环温度太高,杀死菌种
(4)
2.51072.
(1)液体高压蒸汽灭菌
(2)无菌
(3)划线平板灼烧是为了杀死接种环上其他微生物冷却是为了防止接种环温度过高杀死菌种
(4)
3.328×108
(5)多两个或两个以上菌体连在一起,在平板上看到的是只形成一个菌落少将死的菌体也计算在内了3.
(1)碳源、无机盐、水
(2)高压蒸汽灭菌
(3)恒温培养箱 无菌水
(4)多 高
(5)盐(或NaCl) 选择性培养基4.
(1)该细菌质粒上既没有抗青霉素基因,也没有抗四环素基因
(2)定向选择 自然突变基因突变
(3)种群
(4)噬菌体 动植物病毒微生物的实验室培养培养基无菌技术分离、纯化大肠杆菌培养基的配制配制培养基的原则配制培养基的方法计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板平板划线法稀释涂布法系列稀释平板涂布PAGE1。