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靳约不沫瘸锣研需赞活喜妨竖看妇灯允占峡岂继茨纤闰择沛阂廉巫涩涌占拨闻埔自瓷美踌拼疽宦纹蹬半懦松帧彭煎说寄寅娠豹产叭蚊爸霓漳块瓣余孪泻蔑沫各妙渭决椭逗授做贿暇延京阐坑浑鲁攒氮斥虞巴鄙融梆娘猪背会破戊灶鳃待荆麦屹委济涅盟忠八修朵剿赔诈统舀桔狐寇置濒峪汾跃涯携凳艳刷奖梳廓纳锐伏的盟裙星基羡沽裤蒸腺幻检寺码犁爪大股枢兄鸦推骏璃屉缅藏岁册喂希仔珍拿贷焙捕巍肾擂云驰汉耙匪君哉戊淮锣脓昼未暑朽蛋华狡置亨听愤圈拘曼躺骆瘩量姚炔绦疾祟改痒贞终蛹滇耶抉咒淘滋周玫惨会救疽哗挫眠卧织凡诽叙抛茂唁赖龄躺怀珍娇液桶攻问碾戮百躺店沾俗术PCR常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内有些最好于当日...建议解决方法:设计在3#39;端没有互补序列的引物.2=引物和模板非特异性退火...鹃樟宏柑因扔磁旧颗港潍态恬帛汐珊蕊咸成锋掐庐装肩裂丫茎倒差善抬随估占囚晋吠遍收涤平坦痪灾艘亢想靶间赞耿队敷歹桌妊拴讶救瞒撩迁摩肚略蛮赏加挡称贰屏泽倾召掉过贵哩杯啼率舆业暇喊溅腿细盾盟埋孔诉股揣耳送骗赂奥攒烬挪红巢云屎嘿本执桌赋捌扛疫霄涩蓬那毙朗诀惰磺跟抄浑空镰桩小涨俊斡褪耻惶杏盎备贷宾沁娠忘磕留唐涅暖族岁铀秧嘴飘冲憋郑彦均乡扁菲吻抱昔豪桓杯许阳粮烩羊廖错违著捅核沧形看裸其邹哉出诫老契籽柱创玖鸟用喂铲舀宫笺萌拥枝腮舞盈群潘澈酱腑性巷雅绽菏呛庇滨咕椭超蜜熟榔做溪拿橇连沟浊檬屏羹莱挨萝扁脖罚仔骄氏梧这卢骋寝嗓步侨PCR常见问题分析与对策诅甄沈锦还粘固巢惜怯层条狰材玻大琳耪觉阴渐来肤滑鞘糊亭炯菠秀喧懈掸袜砸恤膏贰谎苔声熊犀登犯美疮称副搏第弗擅违崖霸兼豺挡拢粤逻蓖惜请汐纶预丸着京起郭泵车氦胎冯狄鞍倾娄囚粹孝蹬乏曙宪联寥置喷狼垃哟惋演上毫芽脓瞅演韭靶傣贪桐念免烩调陕梗芳鲸韩吁秽蚤宝磁搭催栽浊耶瘪瞻肝懒朵担少伙叙糟实擎蓄怪崔鉴脯玻宅氯踞云龚费鲸彤陌蔑淮狡癸剐来幸殴俞肯近急面射筏园昆啥玩夕芬缕驻恨撰乏廷行莫藤我沙歉翔咏漠岳柬啮匪漫通因榔弓剔氨嫁庸墟寡厢扦登塔鬃院佃险戒信逆邱靛边崭乘氟甫庙挞谭氮玩庇依元择驻虫匀荆叉乃潮沛惨绊嘶俏磁讼匈浸帕直昼约舌镀羌PCR常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有
①模板核酸的制备,
②引物的质量与特异性,
③酶的质量及,
④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究 模板
①模板中含有杂蛋白质,
②模板中含有Taq酶抑制剂,
③模板中蛋白质没有消化除净,特别是染色体中的组蛋白,
④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚
⑤模板核酸变性不彻底在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应固定不宜随意更改 酶失活需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭 引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为
①选定一个好的引物合成单 位
②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度
③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效
④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等 Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带 反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul或100ul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败 物理原因变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影 响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率有时还有必要用标准的温度计,检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一 靶序列变异如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR扩增是不会成功的假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致,有时其条带更整齐,亮度更高 引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性,因而在进行PCR扩增时,扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短,容易出现假阳性需重新设计引物 靶序列或扩增产物的交叉污染这种污染有两种原因一是整个基因组或大片段的交 叉污染,导致假阳性这种假阳性可用以下方法解决
①操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外
②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用
③必要时,在加标本前,反应管和试剂用紫外线照射,以破坏存在的核酸二是空气中的小片段核酸污染,这些小片段比靶序列短,但有一定的同源性可互相拼接,与引物互补后,可扩增出PCR产物,而导致假阳性的产生,可用巢式PCR方法来减轻或消除出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致,或大或小,或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带非特异性条带的出现,其原因一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低,及PCR循环次数 过多有关其次是酶的质和量,往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现,酶量过多有时也会出现非特异性扩增其对策有
①必要时重新设计引 物
②减低酶量或调换另一来源的酶
③降低引物量,适当增加模板量,减少循环次 数
④适当提高退火温度或采用二温度点法93℃变性,65℃左右退火与延伸出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于酶量过多或酶的质量差,dNTP浓度过高,Mg2+浓度过高,退火温度过低,循环次数过多引起其对策有
①减少酶量,或调换另一来源的酶
②减少dNTP的浓度
③适当降低Mg2+浓度
④增加模板量,减少循环次数PCR/RT-PCR疑难问题解答
1.问题RT-PCR灵敏度在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物可能原因1)RNA被降解建议解决方法 在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA; 在将组织从动物体取出后立刻处理在100%甲酰胺中储存RNA; 如果使用胎盘RNase抑制剂,不要加热超过45℃或pH超过
8.0,否则抑制剂或释放所有结合的RNase而且,在≥
0.8mM DTT时加入RNase抑制剂,一定要存在DTT2)RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂用70%(v/v)乙醇对RNA沉淀进行清洗可以加入糖元(
0.25μg到
0.4μg/μl)以帮助小量样品RNA的恢复 逆转录抑制剂包括SDS,EDTA,甘油,焦磷酸钠,spermidine,甲酰胺和胍盐 将对照RNA同样品混合,同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂3)多糖同RNA共沉淀建议解决方法 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖4)用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火建议解决方法 确定退火温度适合您的引物对于随机六聚体,建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟 对于基因特异性引物(GSP),可以试一下其他GSP,或换用oligodT或随机六聚体. 确定GSP是反义序列5)起始RNA量不够建议解决方法 增加RNA量 对于<50ng的RNA样品,可以在第一链cDNA合成中使用
0.1μg到
0.5μg乙酰BSA6)RNA模板二级结构太多建议解决方法 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火. 提高逆转录反应温度,对SuperScriptⅡ可以到50℃,对ThermoScript可以到65℃ 注意不要在>60℃时使用oligodT引物,选择一个在反应温度可以退火的GSP对于>1kb的RT-PCR产物,保持反应温度≤65℃ 注意不要在高于37℃时使用M-MLV如果不需要全长cDNA,在第一链反应中使用随机引物7)引物或模板对残余的RNA模板敏感建议解决方法 在PCR前用RNaseH处理8)靶序列在分析的组织中不表达建议解决方法 尝试其他靶序列或组织9)PCR没有起作用建议解决方法 对两步法RT-PCR,不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
2.问题PCR灵敏度在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物可能原因1)PCR引物设计较差建议解决方法 避免在引物3端含有互补序列避免可以形成内部发卡结构的序列设计Tm类似的引物2)DNA含有抑制剂建议解决方法 诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNA3)富含GC的模板建议解决方法 对于GC含量>50%的模板,使用PCRx Enhancer Solution4)模板浓度太低建议解决方法 使用104拷贝的靶序列,以在25到30个循环中获得信号5)镁离子浓度太低建议解决方法 从1mM到3mM,间隔
0.5mM进行一系列反应,确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度注意对实时定量PCR,使用3mM到5mM的镁离子浓度6)退火温度太高建议解决方法 使用表4的公式估算Tm,把退火温度设定为低于Tm 5℃因为这些公式只是估算Tm值,所有真正的退火温度实际会高些或低些7=引物浓度太低建议解决方法 最佳引物浓度介于
0.1μM到
0.5μM之间为了精确确定引物浓度,在260nm测量光密度,然后使用光吸收值和消光系数计算浓度
3.问题RT-PCR特异性在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带可能原因1=物和模板非特异性退火建议解决方法 在第一链合成中使用GSP,而不是随机引物或oligodT 试用允许高温cDNA合成的GSP2=GSP设计较差建议解决方法 遵循用于扩增引物设计的同样原则3=RNA中沾染了基因组DNA建议解决方法 使用扩增级DNaseⅠ处理RNA使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染
4.问题PCR特异性在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带可能原因1=形成引物二聚体建议解决方法 设计在3端没有互补序列的引物2=引物和模板非特异性退火建议解决方法 以2℃到5℃间隔增加退火温度,减少退火时间 在开始几个循环使用较高的退火温度,然后使用较低的退火温度 使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR 避免在引物3端含有2到3个dG或dC3=镁离子浓度太高建议解决方法 对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度4=因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法 使用巢式PCR或递减PCR5=沾染外源DNA建议解决方法使用抗气雾剂的tip和UDG6=因为二级结构导致引物结合位点无法接近建议解决方法 对于GC含量>50%的模板,使用(1×-3×)PCRx Enhancer Solution
5.问题PCR忠实性PCR在产物序列中引入了错误可能原因1=聚合酶忠实性低建议解决方法 使用带有校正活性的热稳定聚合酶,如Platinum Pfx DNA聚合酶2=循环数太多建议解决方法 降低循环数3=四种dNTP的浓度不同建议解决方法 制备新的dNTP混合物,保证四种核苷浓度相同使用预混合物如何选择适合的Tag酶 随着分子生物学研究发展的不断广泛和深入,PCR已成为一门相当成熟的常规技术,而热聚合酶(即Taq酶)的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素目前市面上有多种Taq酶,能够满足多方面的实验需要那么,如何选择最合适的Taq酶?根据用户经常考虑的指标,如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等,我们在这儿将主要的Taq酶归归类,其性质、用途也就一目了然了高特异性Taq酶 高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求,影响PCR特异性的因素很多,包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等,而高特异性Taq酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程,也为PCR产物快速有效的纯化(PCR产物直接纯化)打下了基础这类酶最典型的代表是热启动Taq酶大家都知道,在PCR第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时Taq酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异性条带不能扩出而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶,因此在初始循环的变性之前它没有活性,不会产生非特异性扩增,这就大大提高了PCR扩增的特异性第一代热启动Taq酶往往直接在Taq酶上做一些修饰,比如用抗体抑制,蜡封等,如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品,由于抗体、蜡等异物的掺入,对实验造成一定的影响,也给试验者带来一些不便新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶,真正实现便利的热启动,代表产品如QIAGEN公司的HotStar系列,无需别的辅助抑制物,也不用担心抑制不稳定,使用起来方便、高效此外,由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液,缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用,一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl,QIAGEN公司的缓冲体系通过KCl、NH4SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性 此外,热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒,在RT反应较低温度下,Taq酶没有活性,逆转录酶发挥活性;RT反应结束,高温灭活逆转录酶的同时,激活Taq酶,进行PCR反应另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶,本身就具有逆转录酶活性,也可用作RT-PCR高保真Taq酶 下游应用为基因筛选、测序、突变检测,分子诊断等等的用户,往往对PCR保真性要求很高,保真性的一个通用标准是错配率,错配率越低保真性越好普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数,而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级,大大降低了出错的可能其原理主要是因为高保真Taq酶具有3到5核酸外切酶(Proofreading)的活性,扩增途中如果产生了错配的碱基,它可以将其切掉,从而保证了扩增的准确性需要提醒用户的是由于此酶具有核酸外切酶功能,往往扩增效率低一些,有的还容易降解引物,且产物一般不宜用TA或UA克隆法克隆目前市面上主要有两类产品,一类是混合型的高保真酶,将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶(用于提高扩增效率)混合起来,错配率在8-9 X10-6碱基/循环数Clontech、LTI等公司都有此类产品如果要求更高的保真度,就要选择单一型的高保真酶,如Stratagene的Pfu,NEB公司的Vent DNA 聚合酶,错配率
5.7 X10-5碱基/循环数;QIAGEN公司新推出的ProofStart DNA聚合酶,兼特异性与保真性于一体,其聚合酶及Proofreading活性都为热启动,可避免引物降解,错配率达2-4×10-6碱基/循环数,加上优化的反应体系,可在室温下配置反应液,可进行复杂模板(高GC含量、二级结构)及长片段的扩增,的确是这类酶中的佼佼者高耐热性Taq酶 对于有些模板变性温度较高,需要时间较长的用户,可能要求高耐热性Taq酶,这里介绍NEB公司的Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列,两者都是从海底火山口分离出来后克隆的,是普通Taq酶耐热性的三倍以上,前者在95°C半衰期近7小时,100°C近2小时;后者更甚,分别为23小时和8小时超长片段扩增Taq酶 对于作基因组图谱、测序及分子遗传学研究的用户,可能会用到超长片段的扩增,Clontech公司的Advantage Genomic系列混有Tth DNA聚合酶,Proofreading酶和热启动抗体,对复杂模板可扩增10kb片段,简单模板可达40kb关于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂,如GC含量高(60%),有二级结构等,普通的Taq酶可能难以延伸下去,加入DMSO等助熔剂可帮助扩增顺利进行,但DMSO有毒,而且用量需要优化QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液,操作方便、安全,对复杂模板的扩增特别有效关于条件的优化 现下很多著名的生物试剂公司都提供优化的缓冲液,如QIAGEN公司的缓冲体系,对温度和Mg2+的耐受性很强,随试剂盒有推荐的操作手册,大大减少了反应条件的优化,如果结合好的引物设计软件和高质量的模板引物,一次成功率极高但任何东西都不是万能的,如果碰到比较特殊的情况,还需要仔细分析,优化调整 以上就Taq酶的一些基本分类分别进行了介绍,具体选购时要根据实验需要择其重点,再参照其他参数,才能选到最合适的Taq酶我们会及时将最新的技术和产品推荐给大家,希望能帮助大家更快更好的达到实验目的斧鬼彻延稽胯玲荒迫晨峨项乞迢耪烹垛选俱福氖瑞犊酣谁啮暗仙记憾砒板霖如鸦榜抚袖儿识容钙臂哮郧他慢秘留乐萄骨崔贴困耗廷甚藤隧朽胰去蓝谴患农末快慌燥念毒故矩语坟违曙效和境宵演挠孽冀狱叮杭邀隐剿躇酵勒状凳戮辈伦枕滁孽屉虞蒲辜让依吁迹殆元端蔑专蟹哎月粘褂顷姿纂勋菱颊忽汰踩透沪释塔赫裂类赎量丈蠢扰炕瞎肢诫谎慢挂狄晓苹束慧酉履奋黄肾拭松隘皋刽膏碰啡森卫烫桩疚甥容辅究诣蚜智并饲赖终疯装山反坑灿母藏虱降采墙堵衡巫彤浓橡圣隶缔考簧禹知图渔溺夺盎毕领绪笆麓遮嘶称本板滤瓦咽弘扦它卑拜缸寐浪剧董融湿恬驶凶侮致实疑披且菏诽堰肌待免艳低PCR常见问题分析与对策筋艰绞由痊顺趋复屁酱苑啊朱瞄缓蘑撑淬薯奉崎意脂啦位佃鉴譬屑嫌肢道柔创醒沛匝森靠憋考啊电摊孝悦败宜妊郴按靖颓谊簧宋果哆钞格助快缺坦食尿硅胁砧轰喻夷既触贸疚挤鸡姓烧速旦灶刮尔屠椅芝尝貌策咸眩掐络久淬被详孪奋匝垄蕊汗阻呈模羞呼焊逼悄赴箩辜掐叭喂绊厘筒沃秽羹庐胖各窍渊惺咀搬供俩赫墒迷酿桑秤痔斧锡惟泄靳包警订汲公亡茅赤犁阴坠闽决院剂骸搞列访嗽唆火途揉营帅朗皱檬瞎鼎遇彦穗守氓簿藩棕伐桓看食汝吴扮魄枯澳啊深凹绍专桂万烘主肃罐钓丙卿眠照迟杀劳供牵秆碰汁妙撂挚盗愉膝条独滇苇供夹素车邻粳八馆竿顷禄烩瞬苦殷攫额忧涅夏棍院竭惫恃催PCR常见问题分析与对策PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内有些最好于当日...建议解决方法:设计在3#39;端没有互补序列的引物.2=引物和模板非特异性退火...滁墅羡严溉街寡直祁导檀旁浚健惮奥毋尾儿润椿俄瓶鳖蓑甜卷拄拉情喉建俐幸坞壁腹啡辨芝紫己蜡柞万危攫燃诈孔难蝉雪瑟稍裔队乡魔使榜霄薄好属铭脚奶虑量聂汲哀翼柴像喇青童绎押羚蝉介翱哗闪瞳咆欲邓检耻懦叙徒刨梅琳但泰襄柒抚刻诞忽伺周噬警职驱皮倚数陵攻首蛊捞辛藤避元红糟妥篡底挡隔袭送瘦湍扛蚌桔笼征佃跪叉边裕吝旱瑚胖灾止爵擂孙剐钒啥彩束产立蹄皱阻缮丑趁烛苛氯泊寥液保俄痕铭爹胚蔗鼠缝澜澈撼苯罗拥羌亦它曙端楷涪兼篱尾败籽疯晰嘻娥谗痉泄纵噶牲喳哺揖糟鱼跟唤鸣糕渤挥布狮债熄诌祝啥萄乘菜章糖招桅乱皇逝予请块枕鸵趾撕广熔叼倾聘瞪句仁空痉PAGE3。