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白姑鱼中日群体遗传分化研究刁苏劲浙江海洋学院渔业学院浙江舟山316004[摘要]白姑鱼(Argyrosomusargentatus)属鲈形目,石首鱼科,白姑鱼属,为暖温性近底层鱼类,广泛分布于印度洋和太平洋西部海域,我国沿海均有分布,是产量较高的重要经济鱼类在东黄渤海和南海北部,白姑鱼的分布范围较广,从河口、海湾和沿岸浅海至水深110m陆架海域均有出现,以渤海湾、长江口、台湾浅滩和海南岛以东陆架区包括整个粤东陆架区以下简称陆架区分布为主为阐明白姑鱼不同地理群体的遗传结构和遗传变异,对白姑鱼青岛群体5尾、上海群体4尾、广州群体(5尾)和日本有明海5尾群体,共19个个体的线粒体DNAmitochondrial,mtDNA的细胞色素bcytb基因片段序列进行分析,共获得四个群体cytb基因片断500bp的一致序列在所获得的19个个体中总共检测到9个单倍型,各单倍型的变异全部是转换或颠倒无插入和缺失A+T含量平均值为
49.9925%,日本有明海群体最高,为
50.27%大于G+C的含量
49.73%,G+C含量平均值为
50.0075%,最高则是广州和青岛群体核苷酸多样度以青岛群体最高为
0.0068±
0.0050,其它两个中国群体较低,最低的日本有明海群体则只有
0.0015±
0.0016有明海群体的FST值很大,为
0.830到
0.906之间,而中国的三个群体的FST值均很小,为-
0.1022到-
0.0424成对的FST值清楚地表明白姑鱼的群体遗传结构分化主要在中日群体间系统树显示存在中日两个完全隔离的地理分支本研究结果有力地表明白姑鱼种群在黄渤海和东海之间有很高频率的种群间基因交流,但中日间存在非常有限的基因交流[关键词]中日;白姑鱼;遗传分化;线粒体DNAGeneticvariationofwhitecroaker(Argyrosomusargentatus)populationsinChinaandJapanDiaoSujinFisherySchoolofZhejiangOceanUniversityZhoushanZhejiang316004[Abstract]ThewhitecroakerArgyrosomusargentatusbelongstothePerciformesSciaenidaeandwhitecroakerGenus.ItisakindofwarmwatergroundfishwidelydistributesamongtheIndianOceanandthewestPacificOceanincludingChinacoastalwatersandisoneoftheimportanthigh-yieldeconomicalfishesforChina.WhitecroakerdistributeswidelyintheyellowSeaEastChinaSeaandnorthernSouthChinaSea.Itcanbecommonlyseeninestuariesbayscoastalwatersandshallowseasdeepedto110mabovethecontinentalshelfmainlyintheBohaiBayYangtzeRiverestuaryTaiwanbankandtheshelfintheeastofHainanIslandIncludingthewholecontinentalshelfareaintheeastofGuangdongshorttedin“shelfarea”below.Inordertoclarifythegeneticstructureandevolutionalrelationshipamongdifferentgeographicwhitecroakerpopulations19individualscollectedfrom4populations:AriakeSea5individualsGuangzhou5individualsShanghai4individualsandQingdao5individualswerestudiedinthispaper.500bpconsensussequenceswereobtainedbasedontheanalysisofcytochromebcytbgenefragmentsofthemitochondrialDNAmtDNA.Ninehaplotypeswerefoundinthisresearchallvariationsareresultedfromreversingandtransformationnogeneinsertingandmissing.TheaveragevalueofA+Tpercentageis
49.9925%thehighestvalue
50.27%appearedintheAriakeSeasampleswhichislargerthantheC+Gvalueof
49.73%.TheaveragevalueofC+Gis
50.0025%andhighestvalueappearedinQingdaoandGuangzhousamples.Thehighestnucleotidediversityvalueis
2.8000±
1.7686inQingdaosamplesandthelowestvalueis
0.0015±
0.0016inAriakeSeasamples.TheFSTvaluesbetweenAriakeSeaandChinapopulationswereverylargerangingfrom
0.830to
0.
906.HoweverTheFSTvaluesamongChinapopulationswerenegativebetween-
0.1022to-
0.
0424.ThepairwiseFSTvalueclearlyshowsthatthegeneticvariationismainlyoccurredbetweentheChineseandJapanesegroupsandtheneighborjoiningtreealsoshowstherearetwototallyseparateclades.ItfirmlyprovesthatgeneticflowfrequencyofwhitecroakerpopulationsinHuanghaiSeaBohaiSeaandEastChinaSeaisveryhighbutverylowbetweenChineseandJapanesewaters.[Keywords]ChinaandJapan;WhitecroakerArgyrosomusargentatus;Geneticvariation;mitochondrialDNA白姑鱼中日群体遗传分化研究1前言
1.1白姑鱼简介白姑鱼(Argyrosomusargentatus)属鲈形目(Perciformes),石首鱼科(Sciaenidae),白姑鱼属(Argyrosomus),为暖温性近底层鱼类,广泛分布于印度洋和太平洋西部海域,我国沿海均有分布,是产量较高的重要经济鱼类
[1]在东黄渤海和南海北部,白姑鱼的分布范围较广,从河口、海湾和沿岸浅海至水深110m陆架海域均有出现,以渤海湾、长江口、台湾浅滩和海南岛以东陆架区包括整个粤东陆架区以下简称陆架区分布为主,此外还分布于印度-西太平洋区的波斯湾和阿拉伯海从阿曼到印度的西海岸;中国南海和印度尼西亚、爪哇外海也有分布
[3]栖息于热带海洋沿岸泥沙质底部,深度10-60米生殖季节结群向近海洄游大部分2龄性成熟(少数1龄),绝对生殖力为
2.3万~
19.0万粒产卵期为春季直夏初,卵浮性肉厚而细嫩隶属白姑鱼属,本属吻圆钝,吻褶完整;吻上孔3个,吻缘孔5个颏孔细小,一般6个,有时4个鳃盖骨后上方具2个扁棘鳔前部圆形,前端不突出成囊,具24~27对侧肢;侧肢一般具腹分支,不具背分支耳石腹面有蝌蚪形印记(印记尾区呈T字形),我国产5种近海暖水性中下层鱼类,体呈椭圆形,一般体长20厘米左右、体重200~400克、口大,上颌与下颌等长,上颌牙细小,排列成带状向后弯曲,下颌牙两行,内侧牙较大、锥形,排列稀疏.额部有6个小孔,无颜须、体被栉鳞,鳞片大而疏松,体侧灰褐色,腹部灰白色尾鳍楔形,胸鳍及尾鳍均呈淡黄色喜栖息于海水澄清、水深40-100米、底质为泥或泥沙的海区捕食性鱼类,喜食端足类、头足类、虾类、蟹类及小型鱼类,还食少量蛇尾类2龄鱼大部分性成熟并参加生殖洄游,生殖期间常发出咯咯声,产浮性卵,球形,卵径
0.73-
0.8毫米集群产卵,产卵后分散索饵,属重要经济鱼类
[3]图1-1白姑鱼示意图Fig.1-1PictureofWhitecroakerArgyrosomusargentatus白姑鱼每年有两个产卵期,分别为春季的3~4月和秋季的10~11月春季为主要产卵期;陆架区的主要产卵期为5~8月,其中6月为全盛期目前有关经济鱼类生物学的分析已有相关报道,而关于白姑鱼的生物学特性方面则未见报道本文利用近年来与1964和1992年调查相比,当前南海北部陆架区和北部湾白姑鱼自然死亡系数均小于往年,而捕捞死亡系数则相反由参数E开发率可以看出,进入20世纪90年代以来,开发率不断增大同20世纪60年代相比,当前资源的开发力度大大加强了2龄以上的鱼所比例在北部湾和大陆架中分别仅为为
4.15%和
12.14%,而20世纪60年代的资源调查中,2龄以上的比例在北部湾和大陆架区域分别占
62.19%和
71.15%由于过度捕捞南海北部白姑鱼资源群体结构简单化、小型化,性成熟提前,幼鱼和补充群体已成为渔业生产的主要捕捞对象白姑鱼最适开捕年龄应大于1190龄,相应地开捕体长为211mm;而陆架区则大于1195龄,相应地开捕体长为168mm
1.2遗传多样性及其研究方法从远古时代进行动物驯养、植物栽培起,人类就开始了对生物遗传多样性的利用和认识但是科学地总结并提高到理论高度进行系统化的首推达尔文他引用大量资料论证“在家养状况下的变异”,说明了栽培植物和家养动物种内丰富的显然是可遗传的,并称之为多样性(Diversity)在随后出版的《动物和植物在家养下的变异》一书做了更全面详尽的论述
[7]达尔文还进一步讨论了自然状况下的变异,虽然当时孟德尔遗传定律尚未被世人所知,但他根据野外观察认为,很多野生生物的个体差异是遗传的变异是如此丰富和普遍,他专门写了“可疑的物种”一节,特别提到得康多尔(AdeCandolle)关于栋树的著作
[7],其中对变异的频率还进行了统计达尔文正是在总结遗传多样性的基础上提出了进化理论1900年孟德尔遗传规律被广泛证实以及随后用生物统计方法对微小差异的遗传分析,为群体遗传学奠定了基础Fisher、Haldane和Wright的学说要点是群体内突变产生不同的基因型,即遗传多样性,自然选择和遗传漂变改变基因频率导致物种形成,后来被称为新达尔文主义20年代摩尔根染色体遗传学及后来发展成的细胞遗传学为群体遗传学理论提供实验证据,例如Dobzhansky对果蝇自然群体染色体倒位的研究
[2]1975年Southern发明DNA片段经琼脂糖电泳按分子大小进行分离后转移到硝酸纤维素膜上用标记的探计进行DNA-DNA杂交可以检测出同源片段的技术DNA序列多样性开始可以检测出,即限制片段长度多态性(RFLP)证明DNA有比蛋白质更丰富的多样性
[8]Saiki1985发明聚合酶链式反应(PCR)后,快速检测DNA多样性的方法如随机扩增多态DNA(RAPD)和DNA扩增指纹(DAF)在1990年问世生物基因图谱和DNA全序列分析正在有组织地进行,完全检测生物遗传多样性有了可能
[8]遗传多样性是生物多样性的重要组成部分广义地讲,遗传多样性就是生物所携带遗传信息的总和;狭义上,则指种内不同群体和个体间的遗传多态性的程度,或称遗传变异
[4]遗传多样性是生物多样性的核心问题,蕴藏于物种内或种间的分子、细胞和个体水平的遗传变异,是遗传多样性的基础,也是物种保持进化潜能的基本条件,与生物多样性的形成、消失和发展休戚相关遗传多样性是物种进化的本质,也是人类社会生存和发展的物质基础遗传多样性的研究无论是对生物多样性的保护,还是对生物资源的可持续利用,以及未来世界的食物供应,都有重要的意义遗传多样性的研究工作是生物多样性就地保护的基础遗传资源的保护和利用,不仅是生物多样性保护的关键因素,也是大农业持续发展的需要,关系到世界未来的食物供应问题
[9]最早的蛋白质凝胶电泳(Smithies1955)是淀粉凝胶电泳(简称SGE,下同)分离人的血清蛋白,并有不同人群有不同的蛋白谱的报道,氨基酸顺序不同的蛋白质因所带电离基团的不同而有不同的净电荷,在电场中显示不同的淌度而相互分离,用染蛋白质的染料可以显示出来
[7]不久,Hunter和Markert
(1957)用酶组织化学染胶片,发现了酶的多分子形式,称为同工酶(Isozyme)
[4]同工酶电泳技术是遗传多样性研究的主要手段之一,凝胶电泳技术结合酶的特异性染色用于遗传变异的研究可以说是遗传多样性研究乃至进化研究史上重要转折点,30多年来利用同工酶技术已对大量生物群体的遗传变异进行了广泛研究,同工酶技术目前仍是遗传多样性研究的主要方法它们可以表现特定的差异,从而鉴别不同的基因型,间接的研究基因的变异
[5]蛋白质电泳的原理是利用淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色反应,通过检测DNA表达产物电泳谱带的不同来显示蛋白质(同工酶)在遗传学上的多态性同工酶电泳的应用掀起了群体遗传学的一场革命,因为基因流、等位基因频率等对于群体生物学至关重要的参数均可由若干个同工酶座位信息的组合得到同工酶电泳技术除了用于遗传多样性研究外,还用于品系鉴定和遗传结构等方面有大量的研究RFLP法的基本步骤是用限制性内切酶消化从生物中提取的DNA(模板DNA)为不同长度的片段,用琼脂糖电泳分离开,并转移到硝酸纤维素或尼龙膜上,然后用专一序列的标记DNA(探针DNA)在膜上与模板DNA杂交最后用自显影或显色或发光分析显示与探针同源的DNA片段因为限制酶识别专一的碱基序列,因此,DNA序列的变异会导致酶切点的消失或增加,限制片段的长度发生变化显示多样性RFLP为Grodzicker等1974年所创Grodzickeretal.1974
[6],是最早的分子标记,1980年Bostein首先提出了利用RFLP作为标记构建遗传图谱Botsteinetal.,1980
[10]RFLP作为第一代DNA分子标记开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记的新阶段RFLP的探针来源主要是基因组DNAgDNA克隆和cDNA克隆两种cDNA探针的保守性较强,故许多同科物种可以通用,是研究物种起源演化的较好探针,但是这类探针检测多态性频率较低RFLP在渔业上的应用研究仅次于同工酶,是在以DNA为基础的分子生物技术学中研究最早,应用最广,文献资料最多的技术Saiki
(1988)用耐热的DNA聚台酶完善了聚合酶链式反应第一步是用专一的一对引物(寡脱氧核苷)与变性的模板DNA形成部分双链(退火38~65℃)第二步是聚合酶催化从引物开始的DNA合成,即延伸阶段(45~75℃),第三步把合成的双链DNA再变性(88~97℃)为两条单链模板,模版DNA加倍再经过一个退火、延伸和变性周期,模版增加到4倍通过30个周期,模版DNA扩增百万倍Williams等
(1990)用单个人工合成的随机排列的10个碱基作为引物进行各种生物DNA扩增,用琼脂糖电泳可以检测到丰富的多态性,称为随机扩增多态DNA(RAPD),原理是这种短引物能同时识别模版DNA上不止一个同源位点,同时扩增几个DNA片段,Caetano-Anolles等
(1991)改变扩增的条件,用更短的引物(6-9)碱基进行DNA扩增,然后用PAGE及银染显示扩增产物,得到极高水平的多样性,称为DNA扩增指纹(DAF)类似的方法还有扩增片段长度多态性(AFLP)和微卫星DNA标记(Microsatellite)
[7]这些方法不经过花费时间的杂交阶段,所用的模版DNA量从微克级降到纳克甚至皮克级(1微克=103纳克=106皮克),大大节省时间、实验材料和实验费用
1.3线粒体DNA及其作用DNA分子是遗传物质的载体其自身拥有丰富的变异;每个DNA分子的碱基顺序构成了DNA分子的特异性,DNA序列的差异和多态性为遗传分析提供了更直接、更完全的信息
[22]在进化历程中,变异首先发生在DNA分子上然后表达在蛋白质分子上最后表现在形态水平上DNA分子序列的每一个碱基都是一个相对独立的特征因此直接分析DNA核苷酸组成上的变异以DNA分子序列提供的信息为依据是遗传多样性研究中最准确、最有效的分析方法近几年来由于PCR技术的广泛应用配之以全自动测序仪和高灵敏度的荧光检测手段使得DNA序列分析成为一种快速而方便的常规手段DNA序列分析除了可用于高级分类阶元群的系统学研究外近年来用于群体水平的研究也逐渐增多以DNA序列为核心的分子标记中最重要的是表达序列标定ExpressedsequencetagsEST标记、核DNA片段序列多态及线粒体DNAmtDNA多态性标记前者是对核基因组的标记而后者则是对细胞器线粒体基因的标记EST标记主要是在cDNA文库中随机筛选克隆并进行单向测序Singiepasssequencing而产生的250-800bp的核苷酸序列片段由于EST来源于cDNA克隆因此它部分反映了基因组的结构及不同组织中基因的表达模式核DNA片段序列多态性标记用于核DNA片段序列多态分析的主要是核糖体RNA基因是高度复制的串联序列单位它由18S、
5.8S、28S以及被
5.8S所分隔的基因转录间隔区ITSI和ITS2共同组成其中的转录间隔区是核基因组中进化较快的DNA片段由于ITS区序列在科以下阶元的分类中有非常明显的优势而18S序列的高度保守性又使它成为科以上水平系统演化研究中最常采用的基因序列自80年代以来线粒体DNAmtDNA分析在动物进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护学领域得到了广泛应用权洁霞等,1992;戴继勋等,1997
[19]鱼类具有同其它脊椎动物一样的基因序列且较为保守,鱼类线粒体基因组包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA编码基因和1个非编码区鱼类线粒体DNA大小在
15.2Kb-
19.8Kb之间,同核DNA相比mtDNA编码效率较高,mtDNA基因组结构非常紧凑,进化速度快,一般认为mtDNA的进化速率是核基因的5-10倍,mtDNA是母系遗传,故有效种群大小为核DNA两性遗传方式的1/4因此较少的样本能反映群体结构
[22]目前有关线粒体DNA多态性检测方法主要有直接测序方法和限制性内切酶法直接测序方法是根据研究目的测定mtDNA全序列或部分基因片段,用于比较不同物种或个体间相关序列的差异,从而进行种群遗传结构或进化关系的研究此法可以获得大量可靠数据,但技术要求高,花费大,尚不适合大群体和大样本的遗传、进化研究但是,由于其可以直接揭示生物的本质,随着相关技术的发展和改进以及测试费用的降低,该种方法可能成为mtDNA多态研究的主要方法;限制性内切酶法该方法利用识别特定碱基序列的限制性核酸内切酶对mtDNA进行单酶、双酶或不完全酶消化,并采用琼脂糖凝胶电泳将各消化片段分开,测定它们的迁移距离,计算各片段的大小分析结果可确定限制酶在mtDNA上的消化座位的位置,构建出该mtDNA的限制性酶切图谱
[21]鱼类mtDNA是一种共价闭合环状的双链DNA分子结构比较简单仅编码少量蛋白质呈母系遗传且进化速度快其碱基置换率为核DNA的5~10倍从而增大了种群间及近缘物种间的遗传差异使之易于被检测因此mtDNA为研究种群遗传结构和差异提供了一种灵敏的检测方法另外mtDNA不同的区域进化速度存在差异用mtDNA检测地理隔离在鱼类群体间产生的遗传差异是近年来鱼类分子遗传学研究的热点之一
[16]线粒体细胞色素bCytb基因是目前线粒体中结构和功能了解得最为透彻的基因之一进化速度适中是线粒体DNA上的蛋白质编码基因适合种群水平差异的检测而且容易为保守序列扩增研究最为广泛是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记其中的一个基因片段就包含了从种内到种间乃至科间的进化遗传信息在系统进化和分类研究上有较强的适用性为阐明三者之间的遗传多样性和进化特点有必要使用合适的相对稳定的分子标记来研究线粒体DNAmitochondrialDNAmtDNA是核外DNA由于它具有分子结构简单、母系遗传、进化速率快、缺少重组等特点已成为群体遗传结构、地理变异、系统发育及物种特性研究等领域的有效的分子标记其做为群体遗传分析的工具具有广泛的优点
[22]细胞色素bcytochromeb,cytb基因的结构和功能在mtDNA的13个蛋白质编码基因中被了解的最为清楚且进化速度适中因此其在鱼类群体与进化遗传学中的应用较为广泛同其它脊椎动物一样鱼类线粒体DNAmtDNA是共价闭合双链环状DNA包括一条重链H链和一条轻链L链是细胞核外具自主复制转录和翻译能力的遗传物质由22个tRNAs基因、2个rRNA基因12SrRNA和16SrRNA、D-Loop区及13个疏水性蛋白质多肽基因组成与核DNA相比鱼类mtDNA具有分子小、结构简单、具有恒定的信息容量、基因排列具有相对稳定性、编码效率高、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点是一个相对独立的复制单位已成为鱼类群体遗传与系统演化研究的重要分子标记在无背景资料的情况下为了获得较为客观的生物间进化关系一般主张选择mtDNA不同区域或整个mtDNA全序列进行分析研究的方法
[22]目前,过度捕捞、海洋环境污染和海洋生态环境的不断恶化已经使白姑鱼种群资源面临枯竭的危险(周发林等,2001)
[14]近年来,东海区白姑鱼的渔获量急剧下降,2000年的渔获量从历史最高的20000吨跌至220吨此前的研究多集中于白姑鱼种群的生物学特征,而对白姑鱼种群遗传结构的研究较少,因此使白姑鱼种群资源的保护、发展和可持续利用措施的制订相对滞后
[17]线粒体DNA为测定生物种群遗传结构、判别种群归属的方法之一,已经在多种海洋鱼类上开展过研究,研究表明相同水域间的种群基因结构分化可能会因为洋流影响和个体迁徙而随时间的推移慢慢降低,或者遗传分化的影响会随着时间的推移而得到强化从海洋自身的深度和广度来看,海洋鱼类的遗传分化水平较低海洋鱼类的浮性卵、仔鱼和成鱼的广泛分布性和在水体中自由迁移的特性大大方便了基因在种群内部的流动然而,中日海洋鱼类种群的显著遗传差异正被不断发现,例如鲈鱼、梭鱼等本研究主要通过线粒体DNA细胞色素b基因研究了中日白姑鱼种群的基因结构和遗传分化,实验结果将有助于对白姑鱼种群资源的保护和管理
[17]2材料方法
2.1材料来源白姑鱼样品于2005年4—10月采自黄海(青岛)、东海(上海)和南海(广州)以及日本有明海,鱼体肌肉取出并立刻冷冻至,并运至实验室每个地点的样品鱼取5条(其中东海区样品鱼为4条)共计19尾进行分析
2.2样本组DNA提取按传统法(酚/氯仿抽提法)从肌肉中提取基因组DNA的详细方法和步骤如下
[11]
(1)将样品放入离心管剪碎,加入600μLSTE(10mmol/LTris-Cl,pH
8.0;
0.1mol/LEDTA,pH
8.0;1%m/vSDS),于振荡器上震荡均匀
(2)加蛋白酶K(20μg/μL)15μL终浓度
0.5μg/μL,颠倒混匀,于50℃烘箱内培育过夜(>8小时)
(3)烘箱内取出后凉至室温加600μL(pH
8.0)平衡酚,温和颠倒混匀至乳浊(》10min)离心(12000g,10min),小心吸取上清至另一干净离心管
(4)加等体积的反应液各反应液体积比为苯酚氯仿异戊醇
(25241),颠倒混匀10min,离心(12000g,10min),小心吸取上清至另一干净离心管
(5)加等体积氯仿异戊醇
(241)颠倒混匀10min,离心(12000g10min),小心吸取上清至另一干净离心管加入2倍体积的预冷乙醇,颠倒混匀,-20℃存放2小时以上
(6)离心(10000g10min)产生白色沉淀,轻柔倒去乙醇,再加入300μL75%的预冷酒精,缓慢颠倒洗涤DNA沉淀,再离心(10000g,10min)
(7)重复步骤
(6)(注不要将DNA沉淀倒掉)
(8)将DNA样品置于真空干燥器干燥或烘箱干燥视管中乙醇残留量多少适当调整干燥时间,加入适量TE(10mMTris-HCL,1mMEDTA,pH
8.0)溶解,置4ºC冰箱待用或长期保存于-20ºC待用
2.3PCR扩增、产物纯化及测序使用本实验室设计的特异性引物扩增白姑鱼线粒体cytb基因
[14],引物序列如下L14734:5’-AACCACCGTTGTTATTCAACT-3’,Cytb:5’-CTCAGAATGACATTTGTCCTCA-3’PCR反应液体积为25µL,其中包括50mmol/LKCl,10mmol/LTris·HCl,pH
8.3,MgCl
21.5mmol/L,各种dNTP200µmol/L,ExTaq酶
1.25units,每个引物各
0.2mmol/L,模板DNA1µL,加灭菌蒸馏水至25µLPCR反应在EppendorfMastercycler5333扩增仪上进行PCR反应条件为94℃预变性3min,然后进行40个循环,每个循环包括94℃45s,50℃45s,72℃1min,最后72℃延伸10min以上反应均用阴性对照来检查是否有DNA污染取
1.5µL扩增产物用
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物用
1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测每个样品取2μL检测,对于扩增效果良好的样品进行回收回收时用
1.5%的琼脂糖凝胶,150V电压电泳分离,用小量胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)进行回收和纯化,回收步骤如下
(1)紫外透射仪割下含目的DNA条带的琼脂糖块,放入
1.5mL离心管中
(2)按每100mg琼脂糖加入300μLS1液的比例加入S1液,置50℃温浴30min,使琼脂糖完全融化每5min颠倒混匀一次
(3)当目的片段500bp时,加入1/3S1液体积的异丙醇,混匀50℃温浴1min后,混匀当目的片段500bp时,省略此步
(4)将融化的琼脂糖溶液移入吸附柱,10000g离心30s倒掉收集管中的液体,再将吸附柱放入收集管中
(5)向吸附柱中加入500μLW1液,静置1min后,10000g离心15s倒掉收集管中液体,将吸附柱放入收集管
(6)重复步骤
(5),10000g离心1min
(7)将吸附柱放入干净的
1.5mL离心管中,在吸附膜中央加入30μLT1(2mMTris)液,静置1min后,12000g离心1min将
1.5ml离心管(DNA)储存于-20ºC待用DNA模板(纯化后PCR产物)2μL(约20-50ng);引物1μL(3pmol/uL);BigDye-DNAsequencingKit2μL(PEABI公司的BigDyeTMTerminatorCycleSequencingKitPerkin-Elmer)反应总体积5μL96℃变性10sec,50℃退火5sec,60℃度延伸4min,循环25次,然后4℃保温所有测序PCR均在PE9700热循环仪上进行测序反应产物的纯化步骤如下
(1)测序反应结束后,据测序反应体系按照测序反应混合物75%异丙醇=14的比例加入75%异丙醇,涡旋混匀,避光静置20min
(2)2750g离心30min,将96孔板倒置于吸水纸上,50g离心1min
(3)据测序反应体系按照测序反应混合物75%异丙醇=18的比例加入75%异丙醇,2750g离心10min
(4)将96孔板倒置于吸水纸上,50g离心1min
(5)加入25-30μL去离子水溶解,瞬时离心,于ABI3700测序仪测序反应在PCR扩增仪上经94℃预变性5min后进行30个循环每个循环包括94℃1min56℃1min72℃1min最后于72℃延伸7minPCR产物由美国ABI公司3700型全自动序列分析仪进行双向测序以确保DNA序列的可靠性,并在导师的指导下,由本人对测序结果用DNAstar、DNAsp、Arlequin和MEGA等软件进行统计分析
2.4数据分析用Dnastar软件(Dnastar,Madison,WI,美国)对测得序列进行编辑、排序比对通过MEGAmolecularevolutionarygeneticsanalysisKumar等,1993软件统计所测序列的碱基组成,计算不同个体间的遗传距离,并构建UPGMA系统树用DNASP(DNASequencespolymorphiwm)软件进行多态位点数(S)、核苷酸多样性(Pi)、平均核苷酸差异数(K)等遗传多样性参数的计算3结果
3.1单倍型及核苷酸多样度表3-1白姑鱼群体的遗传多样性参数Tab.3-1 Parameterofgeneticdiversityof4populationsofA.argentatus群体样本数量单倍型数单倍型多样度平均核苷酸差异数核苷酸多样度有明海
520.6006±
0.
17530.6000±
0.
56220.0015±
0.0016广州
520.6000±
0.
17531.2000±
0.
90850.0029±
0.0026上海
420.8333±
0.
22242.5000±
1.
68550.0060±
0.0049青岛
530.9000±
0.
16102.8000±
1.
76860.0068±
0.0050总计
1990.8480+
0.
00460.0125+
0.
01110.0111+
1.9020表3-2白姑鱼群体的单倍型分布频率Tab.3-2 Haplotypefrequencesof4populationsofA.argentatus单倍型编号有明海广州上海青岛H10322H20010H30010H40001H50001H60001H73000H82000H90200测序得到白姑鱼的cytb基因片段长度为402bp,在19个样本鱼个体中总共检测到9种单倍型各单倍型间的变异全部是转换或颠倒无插入和缺失核苷酸多样度以中国青岛群体最高为
2.8000±
1.7686,其它两个中国群体较低,最低的日本有明海群体则只有
0.0015±
0.0016其中日本有明海样本含有单倍型H7和H8,而中国样本中则全部不含这两种单倍型;中国白姑鱼群体中的主要单倍型为单倍型1,此外广州群体还含有单倍型9,上海群体还含有单倍型2和3,这说明在中国白姑鱼群体内的遗传分化也是存在的群体内的遗传距离为-
0.1022至-
0.0424之间,群体间的遗传距离为
0.8300至
0.9063之间青岛白姑鱼群体与上海白姑鱼群体之间的遗传距离为-
0.0424上海白姑鱼群体与广州白姑鱼群体间的遗传距离为-
0.1022而青岛和广州白姑鱼群体之间的遗传距离为-
0.0870中日白姑鱼群体的平均遗传距离为
0.8638,提示群体间分化是总变异的主要来源
3.2碱基组成经过MEGA
3.0软件计算,四个群体内的碱基组成如下图所示日本有明海群体中的C含量显著高于中国群体,青岛、广州、上海群体中碱基C的平均含量为
34.23%,比日本有明海群体中的碱基C含量少了近1%青岛和广州群体的碱基含量最为接近,只有
0.05%的差异,而上海群体的碱基组成则介于有明海和广州之间从地理角度来看,中日白姑鱼群体的遗传分化程度也与碱基组成的百分比有一定关系图3-1中日白姑鱼群体的碱基含量百分比Fig.3-1Baseratioin4populationsofA.argentatusinChinaandJapan图3-2中日白姑鱼群体的配对碱基含量百分比Fig.3-2Basepairingratioin4populationsofA.argentatusinChinaandJapan在所调查的四个群体中,碱基组成有着明显的区别日本有明海群体的白姑鱼碱基组成中A+T含量最高,为
50.27%大于G+C的含量
49.73%,而白姑鱼群体的(A+T)平均值为
49.9925%,G+C含量平均值为
50.0075%(G+C)碱基含量最高的则是广州和青岛群体,均为
50.12%下图是各样本鱼基因的主要变异位点图结果显示,群体序列中一共有16个变异位点,总变异率为
3.89%其中上海群体内的变异率为
0.0122,广州群体内的变异率为
0.0146,而青岛群体内的变异率为
0.0243,中国白姑鱼群体的平均变异率为
0.0170,而中国白姑鱼群体相对于日本白姑鱼群体内的总变异率仅为
28.32%,因此中日白姑鱼群体遗传分化程度还是较显著的图3-3中日白姑鱼群体线粒体cytb基因片断变异位点图Fig.3-3 Variablesitesofmitochondrialcytbgenesegmentsequencesin4populationsofA.argentatus
3.3遗传分化指数FST及NJ系统树由表3-3可以看出,中国三个群体间的FST值为-
0.1022至-
0.0424之间,中日群体间的FST值为
0.8300至
0.9063之间青岛白姑鱼群体与上海白姑鱼群体之间的FST值为-
0.0424上海白姑鱼群体与广州白姑鱼群体间的FST值为-
0.1022而青岛和广州白姑鱼群体之间的FST值为-
0.0870中国三个群体的遗传分化不显著(P
0.05),但中日间存在极显著的遗传分化P
0.01各个体间的遗传距离采用Kimura双参数法计算,用MEGA
3.0软件构建了19个个体的系统进化树
[20]由图3-5可以看出基于cytb基因序列构建的NJ基因系统树显示出19个个体的亲缘关系中日群体分成两个地理分支,说明中日白姑鱼种群间存在着一种地理隔离中国个体间未按照地理群体形成不同过的分支,说明中国三个群体间的基因流较强表3-2白姑鱼群体间的FST值和对应的P值Tab.3-2 FSTvaluesin4populationsofA.argentatusinChinaandJapan有明海广州上海青岛有明海
0.
0050.
0110.005广州
0.
90630.
6010.999上海
0.8552-
0.
10220.531青岛
0.8300-
0.0870-
0.0424和淡水鱼类相比,海洋鱼类不同地理种群大都显示出较低的遗传分化由本实验结果可以知白姑鱼中国三个群体遗传分化程度较低,差异不显著,而中日群体的遗传分化极显著,提示中日群体间可能存在生殖隔离,是不同的亚种或种目前许多研究结果表明,某些鱼类中日种群间的生殖隔离却是十分明显的,例如花鲈、梭鱼等图3-5基于cytb基因序列构建的NJ基因系统树Fig.3-5 NeighbourJoiningtreeofA.argentatusbasedoncytbsequencesbootstraprepetitionof500times4小结白姑鱼在其浮游卵、幼鱼或成鱼的各个阶段中,所具有的潜在的高分散度,而中国沿岸流(包括台湾暖流和千岛寒流以及黄渤海冷水团)的影响对中日白姑鱼群体的遗传分化影响也非常显著,显然可以看出呈现出低水平的单体型频率的分化
[20]因为这一物种的稚鱼和幼鱼都能生存在广盐度的海水中,长江流域所造成的低盐度海域可能无法成为一个有效的屏障,以防止白姑鱼幼鱼的分散成对的FST值清楚地表明白姑鱼的群体遗传结构分化主要在中日群体间系统树显示存在中日两个完全隔离的地理分支
[3]本研究结果有力地表明白姑鱼种群在黄渤海和东海之间有很高频率的种群间基因交流,但中日间存在非常有限的基因交流白姑鱼是底栖鱼类,遵循一定的路线进行越冬迁徙后,利用近海或河口栖息地作为幼鱼或稚鱼的育儿场在黄渤海,白姑鱼从黄渤海南部的越冬场洄游到渤海和山东半岛的沿海浅水域产卵然而,在东海,白姑鱼不会像在黄渤海那样迁移很远,北部和南部之间的迁移距离较短产卵场和在黄渤海和东海的越冬场是由洋流相连的由于海洋生物的上层幼鱼能够在这些海流中前行,白姑鱼在越冬场之间的洄游以及群体的混合很可能会发生因此中国海域的三个白姑鱼群体的遗传距离不显著都由此可以推断出来
[3]不过几乎很少的一些研究侧重于在黄渤海和东海的海洋物种的遗传关系,因而也无法与我们目前的研究进行比较虽然梭鱼群体在西北太平洋的三个边缘海(日本海、东海和中国南海)间有显著的遗传差异,但并没有发现梭鱼的黄渤海和东海群体有任何重大的遗传结构虽然梭鱼在黄渤海和东海是一种近岸物种,但它不进行长迁移,仅季节性地移动到浅水产卵,摄食和越冬,但它仍然有关系,因为梭鱼的浮游幼虫阶段能促进其在中国沿海海流、黄渤海暖流和台湾暖流的自由分散日本鳀鱼有明显的洄游,也表明黄渤海和东海之间的群体没有显著的遗传分化,在这个领域提出一个单一的群体混合群体在一定程度上的洄游周期和浮游幼虫的分散能力,可能是因为日本鳀鱼的遗传同质性所引起通常海洋环境缺乏明显的障碍来进行分散作用,因而能有效地降低群体的异质性,往往很难分化离散的群体
[6]黄渤海和东海之间高的基因流动,可能是因为黄渤海和东海的海洋环境方面所导致的水体相互流动所造成黄渤海和东海的海流循环,包括从东海沿着韩国的西海岸到黄渤海的流入(黄渤海暖流)和从黄渤海沿着中国海岸到达东海的流出(中国沿岸流)NJ系统树显示白姑鱼中日群体分为两个有显著分化的单倍型类群,提示两个类群的产生可都能是东海同太平洋在冰期隔离的结果在过去的约80万年里,气候的波动以一个约为十万年的周期进行冰期引起的海平面变化非常强烈,在冰盛期(glacialmaxima),海平面大约下降120-140米(Lambecketal.2002)
[23]在冰期海平面下降,台湾海峡形成陆桥,亚洲大陆与台湾岛通过陆桥相连(Wang1999)
[24]由于日本海海峡较浅(135m),在更新世的冰盛期,东海与太平洋之间几乎被完全隔离白姑鱼的群体有可能被隔离在东海和太平洋,从而导致这中日两个单倍型类群之间的分化日本群体和中国东海群体间的遗传分化在其他的海洋鱼类也曾有研究报道,如花鲈(Latolabraxjaponicus)(YokogawaandSeki1995)
[25]同样,在海洋无脊椎动物中也存在这样的遗传分化(Yokogawa1997;GaoandWatanabe1998)
[26]在中国东海和南海的海洋生物群体间也存在类似的遗传分化(李成华等.2003;潘宝平等2005)本研究结果表明白姑鱼中日群体间存在显著的分化,可能为不同的亚种或种,为验证本研究的结果还需要利用形态学和核基因数据开展更广泛的研究本结果还表明细胞色b基因可作为白姑鱼中日群体的鉴别标记致谢本论文是在韩志强老师的悉心指导和帮助下完成的,韩老师对本论文的撰写、软件使用和理论运用给予了一定的指导,并在论文修改中提供了宝贵的思路和建议,使得论文得以顺利完成韩志强老师对于学生的耐心、认真负责的精神让我印象深刻,他对我论文的完成以及对于我学术精神的养成都有很重要的影响!此外,感谢水柏年老师在论文第二稿定稿时耐心的审阅和提出的关于论文格式、图表结构等方面的修改意见,让我能够臻于完善,精益求精!最后,感谢我的同学和室友,在我的论文完成期间他们给予了我特别的帮助,使我能够顺利地将论文完成在漫漫的求学路上,有他们带给我的欢乐和笑声,我感到无比的温暖和激励再次致谢![参考文献]
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205.ChinaCladeJapanClade
49.40%
49.50%
49.60%
49.70%
49.80%
49.90%
50.00%
50.10%
50.20%
50.30%
50.40%C+GA+T有明海广州上海青岛17。