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第10章纳米诊断试剂生物学及生物医学的飞速发展对传统的检测及诊断方法提出了新的挑战,要求建立活体invivo、原位insitu、实时realtime、动态dynamic的检测及诊断新方法传统的光、电生物化学传感器已不能适应这些新的要求,使用这些传感器经常会导致生物学损伤及相关的生化恶果因此,发展新型、无创、实时、动态检测及诊断探针已经成为人们的一个研究热点近年来,随着纳米技术的迅速发展,以纳米粒子为基础的新型生物传感技术不断涌现,这些新型生物传感器,不仅可以解决一些生命活动中的重大问题,还将在疾病的早期诊断及治疗中发挥巨大的作用国家863计划将生物和现代农业技术领域中的纳米生物技术研究集中在医用纳米生物传感器和成像技术、纳米药物制剂或载体、纳米生物农药等三个方面
[1]目前已__出基于荧光纳米颗粒的白血病、红斑狼疮和某些癌症的早期诊断方法,用这样的生物纳米试剂诊断白血病比现有试剂的灵敏度高数千倍
[2]用于疾病早期诊断的纳米试剂很多,如半导体量子点、纳米金及磁性纳米粒子纳米诊断试剂等本章前三节将重点介绍这三类纳米粒子及其诊断试剂的最新研究进展,第四节将简要介绍其它纳米诊断试剂的进展情况,最后一节介绍芯片技术在疾病诊断中的应用
10.1量子点及其在医学诊断中的应用
10.
1.1引言量子点是三维受限的、近似球状的无机半导体纳米晶体,尺寸通常在2-8__之间,由200-_____个原子组成
[3]与传统的有机荧光染料相比,荧光量子点具有极其优良的光谱特性1发射波长可通过控制它的粒径大小和组成来“调谐”,大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布,谱峰的半峰宽在30__左右,且斯托克斯位移较大,因而几种不同发射波长的量子点用于不同靶点的同时监测时,可避免光谱干扰;2激发光谱范围宽,因而采用单个激发波长可同时激发不同发射波长的荧光量子点,而激发不同荧光染料,通常需不同的激发波长;3具有荧光量子产率高、光稳定性好等优点,适合于对标记对象进行高灵敏、长时间、实时动态观测;4具有空间兼容性,一个量子点可以偶联两种或两种以上的生物分子或配体[4-5]自1998年Chan,Bruchez等人首次将量子点用于生物体系研究以来
[67],量子点作为一种新型荧光诊断试剂,在生物、药物以及生物医学等领域显示出巨大的优势,并且得到了越来越广泛的应用如图10-1所示
[8]到目前为止,人们已经发展了多种量子点表面修饰及偶联方法,可以将量子点与一些生物识别分子如蛋白质、多肽、核酸、小分子等偶联同时,以量子点为基础的多功能材料的制备也得到了长足的发展最近,Scien__、NatureBiotechnology等多个国际著名__发表了关于量子点诊断试剂方面的评论性文章,评述了量子点的最新应用进展
[910]下面介绍量子点及其诊断试剂在一些疾病诊断与治疗方面的进展情况
10.
1.2量子点的发光机理通常在半导体材料中,只有极少数电子填充在导带,绝大部分电子填充在价带,使价带几乎处于全满状态当加热、加电压或光照等外界__时,一些电子会从价带跃迁到导带,在价带中形成空穴,空穴通常被认为是带有一个正电荷的离子电子和空穴通过库仑引力互相“键合”,形成准粒子,这种互相“键合”的准粒子被称为“激子”
[11]激子被认为是一种类氢粒子,因而可用玻尔近似方法计算激子中电子-空穴之间的距离,其计算公式如下r=εh2/πmre2r表示激子中电子-空穴的距离,ε是半导体的介电常数,mr是电子-空穴对的约化质量,h是普朗克常数,e表示电子的电荷不同的半导体具有不同的激子玻尔半径,对于大多数半导体而言,其激子玻尔半径在1~10__之间由于量子点的半径小于或接近激子玻尔半径,其带隙随着量子点尺寸的变化而变化随着量子点半径的减小,带隙逐渐增大,伴随着激子吸收峰的位置发生紫移,其荧光发射光谱也会发生紫移Brus等人曾经提出一个公式用于计算不同大小量子点的带隙
[12]Egquantumdot=Egbulk+h2/8R21/me+1/mh–
1.8e2/4πε0εREgquantumdot表示量子点的带隙,Egbulk表示体相材料的带隙,R是量子点的半径,me表示电子的有效质量,mh表示空穴的有效质量,ε0表示真空介电常数,ε表示半导体的介电常数对于CdSe量子点而言,当其半径从1__变化到
3.5__时,其荧光发射峰将从450__红移到650__另外,不同组成的量子点,其发射光谱也不同Nie等人研究发现,对于半径
2.5__的不同组成的Cd___Te1-x量子点,其荧光发射峰将从610__变化到800__
[13]见图10-
210.
1.3量子点的制备方法高质量量子点的制备是生物标记、医学诊断以及疾病治疗的基础,如何制备发射波长窄而可调、量子产率高、性能稳定的量子点一直是材料科学家追求的目标和__的热点1993年,Bawendi课题组
[14]采用有机金属盐高温反应体系合成了高效发光的CdSe量子点纳米晶体,用氧化三辛基瞵TOPO作为有机配位溶剂,二甲基镉[CH32Cd]和TOPSeTOP为三辛基膦分别作为Cd和Se的前体,在340~360℃高温条件下反应,得到较高质量的CdSe量子点经过尺寸选择性沉降后,可以提高量子点的单分散性,所合成量子点的量子产率约为10%,通过改变反应温度、反应时间等条件,可以调节量子点的粒径
2.4~23__然而由于[CH32Cd]和TOP等试剂有剧毒、不稳定,因而实验条件要求苛刻2001年,Peng课题组
[15]采用CdO代替CH32Cd,制备出高质量的CdS、CdSe、CdTe量子点,并对CdSe量子点的成核规律进行了详细的研究,这种方法制备量子点具有制备方法简单、可制备的量子点种类多、并可用多种手段控制粒径分布但这种方法因采用TOP或三丁基膦TBP等一些剧毒、极易燃、易爆的化合物为原料从而导致的合成条件仍比较苛刻,在实验过程中必需使用手套箱,针对以上问题,本课题组采用一种更安全、廉价的试剂代替原有试剂,无需手套箱就可制得高质量的CdSe量子点
[16]尽管采用目前的技术已经能够制备出高质量的CdSe量子点,然而,将CdSe量子点转移到水相之后,其荧光几乎完全被猝灭相比之下,核-壳量子点具有更好的稳定性,将CdSe/ZnS核-壳量子点转移到水相之后,量子点仍然能够保持较高的荧光量子产率目前,CdSe/ZnS核-壳量子点在生物体系中得到广泛的应用1996年,Hines和Guyot-Sionnest
[17]采用二甲基锌和六甲基二硅硫烷为原料,成功合成了CdSe/ZnS核-壳量子点然而,由于原料中采用了易燃、易爆的金属有机化合物二甲基锌,从而限制了该方法的广泛应用针对该方法所存在的缺陷,武汉大学Xie等人
[18]采用醋酸镉和醋酸锌等简单的无机盐代替金属有机化合物,在相对温和、安全的条件下,成功制备出CdSe/CdS和CdSe/ZnS核-壳量子点采用此方法,原料稳定、易于储存、成本低廉,使实验室大规模制备成为可能最近研究发现,CdSe-ZnS掺杂量子点
[19]及CdSe/CdS/ZnS核-壳-壳量子点
[20]比CdSe/ZnS核-壳量子点具有更好的稳定性,预计不久的将来,这些新型的量子点将会代替目前使用的CdSe/ZnS核-壳量子点,用于生物医学分析
10.
1.4水溶性量子点的制备由于在高温有机溶剂中合成的量子点表面被一些烷基链保护,所合成的量子点仅仅溶于非极性或弱极性有机溶剂,如正己烷、氯仿等使用前一般需要对量子点表面进行修饰,使其表面覆盖极性的基团,从而能够分散在水或缓冲溶液中到目前为止,已经发展了多种制备水溶性量子点的方法一般来说,可以分为两类一类方法是将量子点表面的试剂用修饰试剂取代;另一类方法是通过两性聚合物与量子点表面作用,改变量子点表面的极性,从而使量子点能够分散在水或缓冲溶液中1998年,Nie课题组
[6]发明了用巯基乙酸修饰量子点的方法,成功将量子点从有机溶剂转移到水中此后,巯基丙酸、巯基乙醇等一些带巯基的试剂均用来制备水溶性量子点由于巯基上的S容易与Cd或Zn作用,而极性羧基可以增加量子点的水溶性,用这些简单的巯基试剂修饰量子点具有操作简便、成本低、重复性好等优点,然而,所制备的量子点稳定性并不太好Bruchez等人
[7]采用硅烷化试剂修饰量子点,有效地解决了稳定性的问题,但其制备过程非常复杂,不易重复其它的修饰方法如二硫苏糖醇DTT
[21]、二氢硫辛酸DHLA
[22]、枝状有机化合物
[2324]等均在不同程度上增加了量子点在水溶液中的稳定性,但这些方法同样存在操作复杂、所制备的水溶性量子点量子产率低等不足2002年,Dubertret等人
[25]采用磷脂胶束直接与量子点表面的憎水基团如TOPO作用,成功制备出高量子产率的水溶性量子点,这种方法操作简单,重复性好,所制备水溶性量子点的稳定性好,但由于磷脂胶束不易合成,限制了此法的__及应用Osaki等人
[26]采用类似的方法,成功将多糖修饰到量子点表面,并制备出不同大小的微球最近,Gao等人
[27]将高分子共聚物吸附在量子点表面的憎水基团上,所制备的水溶性量子点稳定性好,当pH值从1变化到14,盐浓度从
0.01mol/L变化到
1.0mol/L时,量子点的光学性质不发生改变可以预计,利用两性聚合物制备水溶性量子点的方法将是未来的发展趋势见图10-
310.
1.5量子点诊断试剂的制备采用巯基羧酸制备的水溶性量子点,在中性缓冲溶液中其表面带有很多负电荷,因而可以通过静电引力将带有正电荷的分子如亲和素、锌指蛋白
[2829]等吸附到量子点表面再将生物素化的分子与亲和素修饰的量子点结合,锌指蛋白用于分离未结合的分子一些含有氨基或巯基的生物分子可以直接与量子点表面的Cd或Zn配位,取代量子点表面的修饰分子另外,共价偶联也是制备量子点诊断试剂的一种方法,一些偶联试剂如1-乙基-3[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺EDC
[6]、丁二酰亚胺基-4-马来酰亚胺基环己烷-1-羧化酯__CC
[30]等常用于生物分子与量子点偶联
10.
1.6量子点在疾病诊断及治疗中的应用
10.
1.
6.1量子点用于基因芯片病毒测定人类疾病基因型的确认以及病毒的检测,主要依赖于相关核酸及蛋白质的测定生物芯片技术在基因型病毒的检测上具有高通量、方便、试剂用量少等优点
[31]量子点以其独特的优越性在生物芯片中具有广阔的应用前景Parak等人
[30]用sulfo-__CC偶联试剂将表面带有巯基的硅烷化量子点与氨基修饰的单链DNA偶联,将其与固定在玻片表面的DNA杂交,他们发现当玻片上的DNA与量子点偶联的DNA互补时,可以观察到量子点结合到玻片表面,反之则观察不到这种现象Gerion等人
[32]将DNA标记的量子点进一步用于DNA芯片的研究,表明DNA标记的量子点可在芯片上进行单核苷酸多态性SNP分析以及多色杂交,并对杂交条件进行了优化,这是首次将不同颜色量子点标记的DNA探针用于芯片杂交检测在此基础上,他们将DNA标记的量子点用于乙肝、丙肝病毒的检测,取得了较好的效果这使量子点同时高灵敏度检测多种病原体成为可能,例如同时检测甲、乙、丙、丁、戊肝病毒以及艾滋病毒等在不久的将来,以量子点为基础的量子点诊断试剂可能会作为目前聚合酶链反应PCR检测技术的一种补充,而广泛用于临床诊断
10.
1.
6.2量子点用于免疫分析及疾病诊断免疫分析是目前疾病诊断的一项重要手段,在现有的免疫诊断方法中,固相免疫法以放射免疫检测法RIA和酶免疫检测法EIA应用最为广泛
[33]Gold__n等人
[34]使用荧光免疫分析法成功将抗体标记的量子点诊断试剂用于葡萄球菌肠毒素BSEB的检测,SEB的检测限为2ng/mL然而,由于固相免疫法操作复杂,存在误检;相比较而言,液相法的免疫反应和__测定在溶液中一步完成,因此反应速度较快,操作也相对简单Gold__n等人
[35]用多色量子点标记的抗体进行多元荧光免疫分析,在溶液中成功实现了志贺样毒素SLT、SEB、__毒素CT、篦麻毒素ricin四种蛋白质毒素的同时测定,使量子点探针用于实际样品中多种毒素及其相关疾病的同时检测成为可能以荧光共振能量转移FRET为基础的均相免疫分析方法不仅可以测定生物大分子抗原、抗体,在小分子半抗原的测定上也具有独特的优势,是最简便的均相测定方法之一荧光共振能量转移也称为非辐射能量转移,即处于激发态的供体以偶极-偶极相互作用形式将激发能转移给邻近的处于基态的受体供体-受体对之间荧光共振能量转移的效率与供体的发射光谱和受体的吸收光谱重叠的程度以及供体与受体之间的距离密切相关
[36]量子点作为荧光共振能量转移的供体有许多优点量子点具有宽的激发光谱、窄而对称的发射光谱、大的吸收截__,这样就可以通过选择合适的激发波长尽可能减少对受体分子的直接激发,从而提高荧光共振能量转移的效率相对一般有机染料而言,量子点的体积较大,单个量子点表面可以结合多个受体分子或染料标记蛋白质,形成多受体体系,大大提高荧光共振能量转移效率另外,由于量子点的发射光谱可以通过其成分及大小来调节,因而,针对不同的受体分子,通过调节量子点的组成或尺寸可以使供体量子点的发射光谱和受体染料的吸收光谱达到最大的重叠[37-39]Willard等人
[40]将生物素化的牛血清白蛋白bBSA偶联到水溶性的CdSe/ZnS核-壳量子点表面,与四甲基罗丹明TMR标记的亲和素作用,通过生物素-亲和素之间特异的相互作用,观察到量子点与四甲基罗丹明之间发生了荧光共振能量转移__ttoussi及其合__
[41]将大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP通过自组装的方式结合到量子点表面,当MBP的糖结合部位预先结合了猝灭剂beta-cyclodextrin-QSY9后,由于量子点与QSY9之间存在FRET,量子点的荧光就会被猝灭,当体系中加入麦芽糖以后,麦芽糖会占据MBP的糖结合位点,beta-cyclodextrin-QSY9脱离MBP,量子点的荧光得到恢复见图10-4A他们还将beta-cyclodextrin-Cy
3.5结合到Cy3标记的MBP上,量子点发生两次荧光共振能量转移,加入麦芽糖以后,beta-cyclodextrin-Cy
3.5脱离MBP,仅发生一次荧光共振能量转移,从而建立了麦芽糖检测新方法见图10-4BClapp等人
[42]将不同荧光发射波长的量子点510,530,555__表面修饰不同量Cy3标记的MBP,研究发现,量子点的发射光谱与Cy3的吸收光谱重叠越大,量子点表面修饰的Cy3标记的MBP越多,荧光共振能量转移效率越高Medintz等人
[43]研究了罗丹明红RR标记的MBP与最大发射波长在555__的量子点之间的荧光共振能量转移,一个量子点表面连接六个RR-MBP,他们通过荧光共振能量转移数据计算出每个RR-MBP与量子点中心的距离,及其在量子点表面的位置,为发展新型量子点荧光共振能量转移传感器、诊断试剂以及一些疾病标志物的快速检测技术奠定了基础
10.
1.
6.3量子点用于多元光学编码高通量分析诊断2001年,Han等人
[44]首先提出用量子点进行多元光学编码及高通量分析诊断他们将不同数量、不同尺寸的量子点包埋到聚苯乙烯微球中,然后将单链DNA偶联到微球表面,进行高通量核酸杂交分析从原理上讲,使用六种不同颜色的量子点,并将每种量子点区分为十个强度,就可以实现一百万个寡聚核苷酸序列的编码和检测单个光源就可以读出所有微珠的编码成像及光谱测定表明这些量子点标记的微珠具有高度统一性,并可多次重复使用,在最佳实验条件下生成微珠的精确度高达
99.99%Xu等人
[45]随后将多元编码微珠用于单个核苷酸多态性分析,得到了满意的结果,并证明量子点多元编码微珠分析非常精确可靠Nie课题组
[46]在研究中还发现,使用聚苯乙烯微球包埋量子点时,量子点仅仅进入微球表面,很难进入微球的内部,他们改用多孔硅包埋量子点,大大提高了微球的亮度,然而多孔硅的单分散性还不太好,他们又采用多孔聚苯乙烯微球包埋量子点
[47],大大提高了微球的亮度及单分散性,与同样大小的无孔聚苯乙烯微球相比,多孔聚苯乙烯微球包埋量子点的亮度提高了约1000倍最近,Gao等人
[27]将这种编码微球用于检测小鼠前列腺的癌细胞,取得了很好的效果这种技术与DNA芯片相结合,可大大简化分析过程,并提高分析的灵敏度这些编码微珠可望用于基因组学、蛋白质组学、高通量药物筛选及医学诊断等领域
10.
1.
6.4量子点用于细胞中疾病标志物的测定及细胞成像分析诊断细胞是相对__的生物功能体,对单个活细胞的一些活动过程进行高效、灵敏的监测,将有助于阐明一些重要的细胞生理过程和药物代谢机制,有利于了解生物体的复杂性及动力学特性量子点在细胞成像分析诊断中主要有以下优点1亮度高,可在单个量子点水平对细胞过程进行分析;2光稳定性好,可对细胞进行长时间监控;3宽的激发光谱,可以一元激发,多元发射;4窄而对称可调的发射光谱,可以避免细胞自发荧光的干扰;5高的光化学稳定性,低的背景,且比较容易通过生物素-亲和素作用与蛋白质、核酸、小分子等细胞靶分子偶联;6偶联试剂一般对量子点的荧光无干扰;7空间兼容性好,允许一个量子点偶联两种或两种以上的生物分子或配体[48-50]Wu等人
[5152]将免疫球蛋白GIgG、链亲和素等偶联到量子点表面,并证明了这些功能化的量子点探针能特异地识别亚细胞水平的分子靶点他们首先将SK-BR-3乳腺癌细胞与单克隆的抗-Her2抗体结合后,再将偶联抗鼠IgG的QD535及QD630与细胞一起培养,结果发现,结合抗-Her2抗体的细胞可以被量子点特异性标记,而没有结合抗-Her2抗体的细胞则不能被量子点特异性标记,只有很弱的非特异性吸附__见图10-5同时,他们还用生物素-亲和素模型检测了细胞表面的Her2标志物当SK-BR-3乳腺癌细胞与单克隆的抗-Her2抗体结合后,再将细胞与生物素化的羊抗人IgG结合,然后将链亲和素偶联的量子点与细胞共培养,结果发现结合生物素化的羊抗人IgG的细胞可被链亲和素偶联的量子点特异性标记,而空白实验中仅仅观察到很低的非特异性吸附__为了研究量子点探针在医疗诊断中的可行性,他们将表达Her2的鼠乳腺肿瘤__与兔的抗血清这些抗血清可以与Her2的细胞质区域反应、生物素化的羊抗兔IgG以及链亲和素偶联的QD630一起培养,发现量子点可以特异性标记这些肿瘤细胞为了研究量子点探针标记细胞内部蛋白的可行性,他们将链亲和素偶联的量子点与鼠3T3纤维细胞、抗-α-微管蛋白抗体以及生物素化的抗鼠IgG共培养,发现链亲和素偶联的QD630量子点可以特异性标记细胞微管为了研究功能化量子点探针对细胞核靶点标记的特异性,他们将固定的人类上皮细胞与人类抗核抗原ANA抗体、生物素化的抗人IgG以及链亲和素偶联的QD630一起培养,结果发现核抗原可以被链亲和素偶联的QD630特异性标记为了进一步研究链亲和素偶联的量子点探针的特异性,他们将人类上皮细胞与生物素标记的二抗和特异性单抗以及链亲和素偶联的QD535及QD630一起培养,量子点探针可同时识别细胞表面的Her2和核抗原,也能同时识别胞浆微管蛋白和核抗原这些开创性的研究工作,为量子点用于癌症的早期诊断以及癌症的治疗奠定了基础表皮生长因子EGF与其受体酪氨酸激酶RTKs结合后可导致受体的二聚化和自我磷酸化,诱发细胞内__传导,控制细胞的一系列功能Lidke等人
[50]将生物素化的EGF结合到中国仓鼠卵巢细胞CHO的表面,在4℃时与亲和素修饰的量子点共培养,可以观察到量子点也结合到了细胞表面,再将温度升到37℃,可观察到细胞对量子点快速而广泛的内吞作用他们将EGF修饰的量子点直接与CHO细胞共培养,也观察到了同样的内吞作用这些研究结果表明量子点并没有影响EGF的生物功能他们还研究了细胞对EGF-QD内吞作用的动力学过程,表明量子点在空间上对试剂之间的结合没有干扰这些研究工作证明量子点在__转导研究方面具有巨大的优越性,为未来的受体靶向治疗提供了参考细胞核是细胞的重要组成部分,它不仅携带着细胞的遗传信息,许多__白直接参与细胞的重要活动过程,如DNA__、重组,RNA转录,DNA损伤及修复,细胞周期控制等Chen等人
[53]用电穿孔的方法将偶联细胞核定位__多肽SNL的量子点导入Hela细胞,发现量子点可以穿过细胞核孔,与靶目标特异性结合,而偶联任意序列多肽的量子点则在细胞内部呈自由分布状态在研究中他们发现,量子点的表面电荷对量子点在细胞内的传输及定位起着重要的作用
10.
1.
6.5量子点用于活体成像及疾病诊断Åker__n等人
[54]将不同的多肽GFE、F3和LyP-1,其中,GFE能够与肺部血管上内皮细胞膜的二肽酶特异性结合;F3优先在各种不同的肿瘤中与血管和肿瘤细胞结合;LyP-1可以识别某些肿瘤上的肿瘤细胞及淋巴血管分别连接到巯基乙酸修饰的CdSe/ZnS核-壳型量子点表面,他们首先将偶联GFE的发绿色荧光的量子点注射到正常小鼠的尾部静脉中,5分钟后,在激光共焦荧光显微镜下切片检测,结果发现,结合GFE的绿色荧光量子点在肺脏__中积聚;但在其它器官脑,肾则没有发现类似的积聚现象随后,他们将F3和LyP-1修饰的红色荧光量子点注射到患肿瘤的小鼠体内,结果发现,偶联F3的量子点在肿瘤血管发生聚集,偶联LyP-1的量子点则在淋巴血管聚集然而,这些量子点除特异性的结合外,还能在小鼠的肝脏及脾发生非特异性聚集为了解决这些网状内皮__中的团聚问题,他们将量子点表面吸附了部分的聚乙二醇,结果发现非特异性的吸附现象减少了95%这一结果预示着量子点可能用于疾病诊断和药物传递等方面的研究见图10-6Gao等人
[27]以量子点为基础,发展了一种多功能的纳米探针,用于活体肿瘤的靶向定位及成像诊断这种多功能量子点表面由两性共聚物、肿瘤抗原识别试剂、PEG分子三部分组成其中两性共聚物是为了保护量子点荧光不被猝灭,肿瘤抗原识别试剂可以与肿瘤细胞特异性结合,PEG分子可以提高探针的生物相容性他们从细胞以及活体水平上研究了这种多功能的纳米探针在生物体内的分布、非特异性吸附、细胞毒性以及药代动力学将这些多功能的纳米探针注入患有前列腺癌的小鼠尾部后,探针便聚集在前列腺的癌细胞上当用适当的光线照射这些小鼠时,它们体内的量子点便开始发光,这种方法可指示1000个细胞构成的肿瘤的位置和大小这是量子点第一次在活体动物中找到目标细胞,并且显示出它们的位置观察这种多功能纳米探针可以通过主动量子点表面抗体与肿瘤细胞表面抗原键合及被动量子点在肿瘤细胞上的渗透及保留两种方式在肿瘤位置聚集这一成果使癌细胞转移及入侵的多种生物标志物同时检测成为可能如果这一探针表面不偶联肿瘤抗原识别试剂,而偶联一些用于癌症诊断和治疗的药物试剂,如合成有机分子、寡聚核苷酸或多肽,就可以进行早期的诊断及靶向治疗呼吸道合胞体病毒RSV是导致婴幼儿呼吸道感染的主要原因,F蛋白和G蛋白的存在是RSV病毒感染细胞的标志Bentzen等人
[55]成功将量子点用于RSV的测定他们首先将生物素化的F蛋白抗体与细胞共培养一段时间,洗涤去除未结合到细胞上的抗体,然后加入亲和素偶联量子点,当细胞表面有F蛋白存在时,量子点就会结合到细胞表面用同样的方法检测了细胞表面的G蛋白通过测定细胞表面的F蛋白及G蛋白的浓度变化,发现了RSV病毒感染的规律,比碳纳米及磁性纳米粒子用于病毒检测的灵敏度更高,这意味着量子点可以用于病毒感染的早期诊断
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1.
6.6量子点光动力疗法PDT治疗癌症光动力学肿瘤治疗是世界范围广泛__的重要课题肌体注射的光敏剂将在肿瘤部位聚集,受激光照射后产生光化学作用,可以选择性地杀死肿瘤细胞Bakalova等人
[5657]__出了利用量子点简单识别癌细胞与正常细胞的技术,并通过这项技术,发现了将癌细胞单独找出来进行杀灭的方法他们将量子点与anti-CD抗体偶联,发现它们可特异性结合到白血病细胞表面,然后将量子点标记的白血病细胞与正常的淋巴细胞混合培养,通过血凝素亲和柱色谱将细胞分离,用激光共焦荧光显微镜和流式细胞仪确定细胞类型,用流式细胞仪和甲基四唑确定细胞的存活能力结果表明anti-CD抗体偶联量子点可以提高磺化铝酞菁染料SALPC在UV照射下对白血病细胞的杀伤效果,这是由于CdSe量子点在光照作用下产生自由基,并且释放游离Cd2+而引起的这仅仅只是一个初步的结果,在量子点真正用于癌症治疗之前,必需对量子点在体内的吸收、代谢、毒性做一个全面的了解,减小其在治疗中的副作用
10.
1.7量子点的生物效应研究量子点在临床诊断、治疗以及生物学领域有着广阔的应用前景,但其生物安全性目前还没有定论,在把它应用于人体和其它生物体之前,应该首先了解它的生物效应Derfus等人
[58]以肝细胞为模型,研究了CdSe量子点的生物效应他们发现CdSe量子点在一定的条件下会表现出明显的毒性,其毒性与合成过程、表面修饰和紫外光照有关,他们认为其细胞毒性与CdSe晶格所释放的Cd2+有__,表面修饰物质的不同可以不同程度的阻止Cd2+的释放,起到降低毒性的作用;而紫外光照将催化量子点表面氧化,释放Cd2+Hoshino等人
[59]报道了采用不同分子修饰的量子点的潜在细胞毒性,发现表面修饰改变了它们的物理化学性质,其毒性与量子点本身无关而与表面修饰分子有关Kirchner等人
[60]研究了CdSe量子点及CdSe/ZnS核-壳结构量子点的细胞毒性,他们用巯基丙酸、硅微球和高分子微球分别修饰量子点并与细胞混合培养结果发现这些功能化的量子点除释放Cd2+外,其表面化学性质对细胞也有很大的影响,量子点可以吸附在细胞表面并对细胞造成伤害不同试剂修饰的量子点其细胞毒性也不相同Green和How__n
[61]研究了水溶性CdSe/ZnS量子点和超螺旋DNA的相互作用,发现CdSe/ZnS量子点核-壳型量子点能损伤DNA,他们认为这种损伤是由于CdSe/ZnS量子点产生自由基所致
10.
1.8前景与展望由于量子点在细胞生物学、医学诊断及治疗等方面有着广阔的应用前景和商业价值,很多科学家都加入到这方面的研究中来,并取得了很大的进展但目前仍有一些问题有待解决1如何进一步阻止量子点荧光在水溶液中的猝灭;2发展一些简单可靠的方法将量子点与特定的分子结合;3在分析过程中防止量子点的非特异结合及团聚;4进一步开展量子点生物毒性研究;5发展一种简单、通用的方法将功能化量子点转移到细胞中可以预计,在不远的将来,多功能的量子点探针在肿瘤诊断和治疗中将扮演重要的角色利用这些探针对癌细胞进行捕获及定位,将可能实现癌症的早期诊断及治疗;将量子点编码微球与不同的靶分子结合,可实现高通量药物筛选、药物示踪及寻找新的药物
10.2纳米金及其在医学诊断中的应用
10.
2.1引言纳米金是指金的微小颗粒直径1-100__,一般为分散在水中的水溶胶,又称胶体金
[62]受电子能级跃迁和表面等离子体共振的影响,纳米金的颜色随其粒径大小的不同而呈现红色到紫色的变化
[63]利用还原剂如白磷、抗坏血酸、硼氢化钠、柠檬酸钠等可将氯金酸还原,制得纳米金其中,柠檬酸钠还原法因制备简单而应用较多
[62]受相互间诱导偶极的影响,纳米金的凝聚会引起溶液的颜色变化,且这种变化依赖于纳米金颗粒之间的距离和凝聚体的大小
[64]利用分析物能诱导纳米金凝聚的特性,可将纳米金用于DNA、蛋白质、糖类等生物分子的检测及相关疾病的诊断,为此,人们对表面功能化的纳米金给予了广泛的兴趣并进行了深入的研究本节将从分析检测和医学诊断的角度对DNA功能化的纳米金、蛋白质功能化的纳米金以及糖功能化的纳米金诊断试剂进行简单介绍
10.
2.2DNA功能化的纳米金诊断试剂DNA序列的检测在疾病诊断和致病基因的研究等方面具有潜在的应用价值,为此,日益受到人们的重视以酶标记、放射性同位素标记、荧光标记、化学发光标记及其它探针标记技术为基础,已建立了许多有关DNA序列的检测方法但是,这些方法往往存在着灵敏度低、重现性差、过程复杂、仪器昂贵、污染环境等缺点或不足,因而在应用方面受到了很大的限制
[65]正因为如此,Mirkin课题组
[6667]建立了用烷巯基化寡核苷酸探针标记纳米金并用于检测DNA序列的新方法,该法具有以下优点1杂交体系的“熔点曲线”很陡,熔解温度的范围很窄,通过调节温度即可辨别互补、错配、缺失、插入等各种不同情况下的DNA靶片段,选择性很高;2未优化的体系即可检测出10-14mol/L的DNA靶片段,应用金标银染法可将__放大105倍,使检测的灵敏度大大提高;3检测过程快速、简便,无需特殊、昂贵的仪器设备
[68]不论是基于光学还是电化学方法的DNA检测及相关疾病的诊断,都要先制得纳米金标寡核苷酸探针Mirkin课题组
[6667]先将寡核苷酸探针烷巯基化、再与纳米金偶联的方法,被人们普遍采用值得注意的是,在合成烷巯基化寡核苷酸探针时,在靠近烷巯基的一端往往要留出一定数目的碱基作为连接臂,其余的碱基则是与DNA靶片段互补的序列合成好的烷巯基化寡核苷酸探针脱去保护基团后,用反相高效液相色谱进行纯化,再与纳米金溶液按一定比例混合、孵育,并置于缓冲溶液中保持一段时间后,经离心、洗涤等一系列后处理步骤即可在纳米金颗粒表面修饰好烷巯基化寡核苷酸探针
10.
2.
2.1光学检测及其诊断纳米金的最大吸收波长依赖于颗粒之间的距离和凝聚体的大小单分散纳米金和标记有寡核苷酸探针的纳米金呈红色而当DNA靶序列与纳米金标寡核苷酸探针杂交后,通过DN__段的相互联结,纳米金会形成延伸的三维网状结构,于是体系的吸收峰发生红移,颜色变为紫红色随着凝聚体的继续增大,这种红移将使体系的颜色最终变为蓝色
[68]基于以上光学原理,纳米金标寡核苷酸探针-DNA杂交体系可用于DNA靶序列的检测基因芯片可对微量样品中的核酸序列信息进行准确、快速、高通量的检测与分析,是进行分子生物学研究和核酸诊断的有力工具
[68]Mirkin课题组
[69]采用三明治杂交分析法,使DNA靶序列的两端分别与固定在基因芯片上的寡核苷酸捕获探针和纳米金标寡核苷酸探针互补、杂交,产生粉红色斑点,经银染法加强显色,通过目视化观察灰度,即可定量研究DNA靶序列的杂交及单碱基错配的情况见图10-7在Mirkin课题组研究工作的启发下,国内不少研究者利用纳米金特定的光学性质,将金标银染加强的DNA杂交分析法与基因芯片技术相结合,用于DNA的目视化检测和疾病的诊断例如,庞代文课题组
[6570]利用自制的肝炎病毒基因芯片,目视化检测病人血清样本中的HBV和HCV基因型,该法具有灵敏度高、专一性强、操作简单、检测迅速、__低廉等优点,有望用于肝炎疾病的临床诊断李轶杰等人
[71]将固定在硅烷化片基上的寡核苷酸捕获探针与单链人__瘤病毒16型__株E6HPV16E6基因的扩增片断相结合,再与互补的纳米金标寡核苷酸探针杂交,经银染加强显色,目视化检测HPV16E6基因,该法快速、灵敏,为进一步应用于临床宫颈癌的早期诊断提供了技术支持另外,刘和平等人
[72]将生物素化的DNA靶序列与生物芯片上的捕获探针杂交,利用生物素-亲和素之间特异性的作用,与亲和素修饰的纳米金结合后,经银染法目视化鉴定了大肠杆菌的4种血清型,该法简单、方便,无需复杂的仪器,适合于普通实验室的常规检测,更能满足现场检测的需要,故可用于某些传染病的早期诊断与监控另有不少研究者在核酸的超灵敏检测方面进行了积极地探索,并取得了良好的效果例如,He等人
[73]将纳米金加强的表面等离子体共振用于DNA阵列分析及寡核苷酸的超灵敏检测,其检测限为10pmol/L,即使不进行优化,该法的灵敏度也可与传统的荧光法相媲美Storhoff等
[74]将DNA杂交分析法与散射法相结合,使杂交反应在均相中进行,无需靶扩增和__扩增即可检测出DNA靶序列,是一种简单、廉价的核酸诊断方法当纳米金表面吸附有柠檬酸根等阴离子时,受负电荷间排斥力的影响,纳米金不会发生凝聚若向体系中加入双链寡核苷酸,由于双链寡核苷酸上的磷酸根带负电荷,会与柠檬酸根相互排斥,因此它无法吸附到纳米金的表面;相反,单链寡核苷酸能灵活伸展其碱基,碱基与纳米金之间相互吸引,于是单链寡核苷酸在纳米金的表面得以吸附Li和Rothberg
[75]正是基于以上纳米金与寡核苷酸之间静电相互作用的原理,设计了一种DNA分析的新方法,该法具有以下特点1静电吸附,无需共价修饰纳米金、探针或目的DNA;2杂交与检测阶段分离;3目视化观察目的产物的颜色变化,简单、快速5min、检测限低10-13mol
10.
2.
2.2电化学检测及其诊断除光学方法外,也可用电化学方法进行DNA的检测例如,将DNA靶序列固定在特定的电极上,与寡核苷酸修饰的纳米金标探针杂交,通过溶出伏安法测定溶解的金属离子的浓度,即可检测出
5.0pmol/L的DNA靶序列
[7677],Authier等人
[78]运用该法已成功测得人细胞巨化病毒HCMV的单链DNA靶序列Lee等
[79]用电沉积银的方法来扩增DNA杂交分析的__,该法简单、快速、重现性好、选择性和灵敏度都很高,在临床诊断和环境监测等方面具有潜在的应用价值而Lin等人
[80]将纳米金固定到石英晶体微天平QCM上,经寡核苷酸连接后,与溶液中的DNA靶序列杂交,并通过QCM频率的变化来监测上述DNA的固定与杂交过程,研究表明,该法重现性好、灵敏度高,为DNA传感器的制作及临床应用奠定了基础DNA序列上的核苷酸突变可能会导致疾病的产生,研究这些核苷酸的突变对疾病的临床诊断和治疗将产生深远的影响在临床诊断中,单核苷酸多态性SNP可作为识别疾病基因的遗传生物标志
[81]由于传统技术无法确定所有可能的SNP,并在灵敏度、检测速度、__等方面需要进一步地完善,为此,Ker__n等人建立了对SNP组合进行区分和编码的新方法,并对与肿瘤坏死因子αTNF-α有关的DNA探针所有可能的突变形式进行了编码研究表明,单碱基修饰的纳米金不仅能显示SNP的存在,还能确定突变碱基的类型
[82]
10.
2.3蛋白质功能化的纳米金诊断试剂自从1971年,Faulk等开创免疫纳米金标记技术以来,该技术在生物学、医学等众多领域得到了应用这是因为1纳米金对蛋白质的吸附能力较强,使得蛋白质的标记过程更加简单,且标记后的蛋白质不易失活,同时纳米金也处于更稳定的状态,有利于__保存;2通过制备不同粒径的纳米金,可进行蛋白质的多重标记;4检测速度快,且纳米金和检测样本的用量都很少
[62]目前,与纳米金成功实现偶联的蛋白质主要有抗体、酶等随着蛋白质类型及分析检测方法的不同,偶联方__有所不同,但总体来说有两种一种是直接偶联,即利用蛋白质分子半胱氨酸残基上的巯基,通过共价作用实现免疫球蛋白IgG、血清白蛋白等与纳米金的连接
[83];或调节体系的pH值,使蛋白质分子带正电,通过静电吸附至带负电的纳米金表面,该法在电化学传感器的制备中应用较广[84-__]另一种是间接偶联,即通过化学方法使蛋白质分子衍生出巯基基团
[83],再与纳米金偶联;或将纳米金表面进行改性,再用偶联剂如戊二醛
[90]、1-乙基-3[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺EDC/N-羟基琥珀酰亚胺NHS
[91]等实现蛋白质与纳米金的连接而Zhou等研究者
[92]另辟蹊径,运用蛋白质原位氧化还原技术,制得了纳米金-蚕丝蛋白的结合物在纳米金与蛋白质的偶联过程中,有以下问题值得注意1为避免蛋白质分子失活,需选择适当的缓冲体系,通常使用磷酸盐缓冲溶液(PBS);2对温度、浓度、pH值等偶联条件需进行优化;3为避免或减轻蛋白质的非特异性吸附,需用牛血清白蛋白BSA、聚乙二醇PEG或辣根过氧化物酶HRP等物质封闭蛋白质可能的活性位点
10.
2.
3.1光学检测及其诊断将纳米金与预先精制的抗体混合,可制得纳米金-抗体复合体,利用抗原-抗体特异性结合的反应,可对抗原进行快速检测由于间接法比直接法的灵敏度更高,目前,人们较多采用先将抗体与抗原反应、再与纳米金标二抗结合的方法检测抗原斑__免疫渗滤试验正是基于“抗原-抗体-二抗-纳米金”夹心法,将纳米金凝聚时所伴随的颜色变化在固相载体上显示出来,人通过肉眼观察,即可判断反应是否呈阳性
[62]早孕诊断就是该技术商业化应用的最好例证
[93]例如,蓝十字生物药业北京有限公司生产的胶体金早早孕检测试纸由人绒毛膜_____HCG抗体、抗鼠IgG、固相硝酸纤维膜和胶体金标记的抗HCG单克隆抗体固相或液相及其它试剂组成,该试纸可测得女性尿液中的HCG,操作简单、快速、结果明确
[94]与早孕诊断类似,试纸检测也可用于微生物和病毒如流感病毒的检测将样本加至试纸底部,流感病毒会与抗体修饰的纳米金结合形成复合体并在纸上显现当流感病毒-纳米金复合体遇到纸上的流感抗体,它们将键合,若键合数目达到百万个,反应线将变为红色试纸检测虽然简便,但不够灵敏,若病毒数目太少,可能出现误诊为此,DonStraus__将数码成像技术应用于流感疾病的诊断中当载满病毒的荧光颗粒到达检测线时,系统会对颗粒进行逐个计数,使病毒的检出水平提高几千倍
[95]光学技术的发展为非介入性分子成像技术注入了新的活力,内镜显微术如X射线断层摄影术、反射共焦显微术和光反射成像等为获得清晰的细胞__的三维图像提供了可能,但内镜显微术对与癌症相关的生物标记物的成像能力有限为此,Sokolov等研究者选择与特定生物标记物有高度亲和性的探针连接纳米金,发展了一类用于反射成像的对比剂结果表明,这类新型对比剂可用于早期癌症的分子成像,并为__低廉的成像系统用于疾病的拍摄、诊断和治疗奠定了基础
[96]光声X射线断层摄影术OAT是一种新型的医学成像技术,它以光吸收为基础,运用光学发光和超声检测对深度__进行成像畸变血管是OAT的内源型对比剂,在癌症晚期,可用以区分肿瘤和正常细胞;但在早期,对肿瘤和正常细胞不足以区分,为此,需借助外源型对比剂Copland等人正是利用纳米金能产生很强的光声学__的特点,将纳米金与单克隆抗体Her__ptinR结合,经过一系列的离体试验表明,该外源型对比剂可选择性地瞄准人的SK-BR-3乳癌细胞因此,将上述对比剂与OAT技术相结合,用以检测那些与抗原有关的深度肿瘤具有可行性
[97]纳米金在细胞质中一般以凝聚体的形式存在,能提供生理标记信息,但对于癌细胞不具有特异性而用抗-EGFR抗体连接的纳米金能特定地键合到癌细胞表面,其亲和性比正常细胞高出6倍,并伴随有表面等离子体共振吸收峰的红移为此,将金标抗-EGFR抗体和非恶性表皮细胞混合培养后,与纳米金连接,并用表面等离子体共振散射及表面等离子体共振吸收波谱进行表征,可用于口腔表皮癌细胞的活体和离体诊断
[98]通常,蛋白质的结构与功能之间具有密切的__为此,斯坦福大学的Zare课题组
[99100]__了一种用于确定蛋白质构型变化的“传感器”他们将细胞色素cCytc吸附到纳米金的表面,此时溶液的pH值为
10.1,呈粉红色见图10-8A若向该体系不断加入盐酸,溶液的颜色将随pH值的变化而变化见图10-8B这是因为,当pH值从
10.1下降至
4.0时,盐酸使Cytc的状态由折叠变成展开,诱导纳米金发生凝聚,使溶液由粉红色变为紫色,最终变为浅蓝色;相反,当pH值从
4.0上升至
10.1时,浅蓝色溶液再次变为粉红色,这意味着Cytc再次折叠成最初的结构这种检测蛋白质结构变化的方法类似于测定溶液的pH值,过程十分简单由于该法具有通用性,可用于检测其它结构更为复杂的蛋白质,成为检测抗体、血液和其它疾病标志物的有效方法
10.
2.
3.2电化学检测及其诊断基于蛋白质功能化纳米金的电化学检测方法,人们已经建立了安培免疫传感器、电位免疫传感器和磁性免疫传感器等,并将它们用于抗原/抗体的生化分析例如,Liang等
[101]将巯丙基三甲氧基硅烷MPS水解,在金电极上组装硅的凝胶网络,经纳米金和B型乙肝抗体HBsAb吸附,用于检测人体血清中的B型乙肝抗原HBsAg该安培免疫传感器的检测结果与酶联免疫吸附分析ELISA方法一致,且灵敏度高、专一性强、重现性好、稳定性长,具有用于临床诊断的潜能而Tang等研究者
[102103]用循环伏安法表征金、银混合纳米粒和白喉抗体在硅凝胶网络上的吸附过程,并通过反应前后电位响应的改变情况来检测人体血清样本中的白喉抗原研究表明,该电位免疫传感器的电位响应快,线性范围宽22-800ng/mL,检测限低
3.7ng/mL,检测结果与ELISA方法一致,可用于白喉抗原的临床诊断Liu和Lin
[104]用磁铁将抗IgG抗体修饰的磁珠固定到碳糊电极的表面,通过三明治免疫分析法将纳米金包被到磁珠表面由于样品溶液中IgG的浓度与纳米金的电化学__密切相关,利用纳米金高灵敏的电化学__即可简单、快速地检测IgG,无需使用酶标记和底物该电化学磁性免疫传感器可用于多种蛋白质的同时测定,为疾病的诊断带来了新的机遇
10.
2.4糖功能化的纳米金诊断试剂糖尿病易引起心血管疾病、眼睛失明等多种并发症,__影响人们的身体健康,其危害程度仅次于癌症如何有效地监测血糖浓度是治疗糖尿病的关键性问题,遗憾的是,目前尚无一种连续、非介入性监测血糖的方法鉴于葡聚糖和伴刀豆球蛋白ConA之间、ConA和葡萄糖之间的特定作用会引起纳米金吸光特性的变化,KadirA等研究者实现了纳米金与葡聚糖的偶联见图10-9A,并通过加入ConA使葡聚糖修饰的纳米金发生凝聚,导致650__吸收峰的吸光度增加;随后加入葡萄糖,凝聚的纳米金发生离解,从而使650__吸收峰的吸光度降低见图10-9B因此,通过吸收光谱既可检测出体液如尿液、血液、眼泪等中的葡萄糖浓度,为相关疾病的诊断和治疗提供重要依据
[64]有报道指出
[105],__研究人员提出了一种简单、快速、稳定、无生物毒性、用于诊断疾病的方法他们将纳米金与糖类物质结合,由于生物体内的识别系统具有特异性,该纳米金-糖类复合体会与特定的细菌进一步结合运用该法,他们已成功检测出尿道炎的细菌
10.
2.5前景与展望基于纳米金自身所特有的光学和电化学性质,结合生物技术和现代仪器分析方法,纳米金已用于DNA分析、免疫标记、疾病的早期诊断等诸多研究领域到目前为至,纳米金真正用于临床诊断的实例并不是很多,大多数还仅限于基础研究和试验阶段,但随着人们对生命健康需求的不断提高,可以预见纳米金在生物分子检测及疾病诊断等方面将发挥更加重要的作用
10.3磁性纳米粒及其在医学诊断中的应用
10.
3.1引言磁性纳米粒具有核-壳式结构,通常由铁、钴、镍等金属的氧化物组成磁性核,高分子材料组成壳由于磁性纳米粒具有良好的磁导向性、生物相容性、药物缓释性、能定期排出体外等特性
[106],将其与DNA、蛋白质、糖类等生物分子偶联,在靶向药物、免疫测定、细胞分离等领域有着广泛的应用价值
[107]将FeⅡ、FeⅢ、NH3·H2O、双链DNA溶液在室温下真空混合
[108]可实现磁性纳米粒与DNA的直接偶联将FeⅡ、FeⅢ按一定比例混合,加至质粒溶液中,通过加入过量NH3·H2O以提高溶液的pH值,也可得到磁性纳米粒-DNA的连接物
[109]磁性纳米粒与DNA的间接偶联过程较为复杂,需进行磁性纳米粒与DNA的双向衍生采用油/水微乳化法制得氨基修饰、硅包被的磁性纳米粒A__NP后,以戊二醛作交联剂,可将A__NP与氨基修饰的单链DNA连接也可利用链亲和素-生物素之间特异性结合的反应,实现A__NP与单链DNA的偶联
[110111]而Zhang等人
[112]另辟蹊径,将放线菌素D修饰到磁性纳米粒的表面,利用放线菌素D易插入双链DNA某特定区域的特点,诱导双链DNA与磁性纳米粒的偶联磁性纳米粒与蛋白质的直接偶联,可采用油酸作油相、蛋白质和Fe3O4纳米粒的混合液作水相、超声波引发的微乳液法进行
[113]将磁性纳米粒的表面进行改性,利用化学键合法可实现磁性纳米粒与蛋白质的间接偶联目前,以碳二亚胺作交联剂,已完成了磁性纳米粒与牛血清白蛋白[___]、羊抗鼠IgG[___]、乳铁传递蛋白
[115]、血浆铜蓝蛋白
[115]的偶联在磁性纳米粒表面衍生出氨基,通过戊二醛交联,实现了磁性纳米粒与脂肪酶
[116]、牛血清白蛋白
[117]、抗羊IgG
[118]的偶联利用高碘酸钠氧化磁性纳米粒表面修饰的葡聚糖,再与结肠癌单克隆抗体CL-3单克隆抗体的氨基端结合,获得了磁性纳米粒-CL-3单克隆抗体的复合物
[119]与纳米金和蛋白质的偶联过程相对应,为避免蛋白质分子失活,磁性纳米粒与蛋白质的偶联同样需要选择特定的缓冲溶液为反应体系最终,可通过施加外磁场[___]、凝胶过柱
[119]等方法完成磁性纳米粒-蛋白质连接物与体系的分离
10.
3.2超顺磁性氧化铁及其在医学诊断中的应用磁共振成像__gneticResonan__I__ging,MRI将水、磷脂和蛋白质等人体__中的氢原子的磁学特性用于人体非介入性扫描的三维成像,是目前最重要的医学诊断方法之一
[120]由于临床上用来增强MRI的主要对比剂——二乙二胺五醋酸钆Gd-DTPA存在着明显的不足,而超顺磁性氧化铁Superpara__gneticIronOxide,SPIO具有体内__特异性高、安全性好、放射线不透过性等优点,人们将其用于临床MRI,对肿瘤进行诊断
[121]SPIO的基本结构为亲水性大分子如葡聚糖、淀粉、肝磷脂和蛋白质等包裹铁氧化物的纳米颗粒如Fe3O
4、Fe2O3或其它不溶的铁酸盐在大分子溶液中碱性共沉淀FeⅡ和FeⅢ,可一步制得SPIO而新一代的SPIO则较多采用多步法制备,并可通过控制体系的稳定性、葡聚糖的分子量等条件来调节SPIO的颗粒大小
[120]根据SPIO的颗粒大小,可将它分为普通的超顺磁性氧化铁直径一般在40-400__和超微型超顺磁性氧化铁最大直径不超过30__两大类普通的超顺磁性氧化铁可用作肝脏、脾脏等部位的MRI,而超微型超顺磁性氧化铁可用作血管成像及磁共振淋巴成像,成像原理及临床应用详见著作
[122]肝癌是危害人类健康与生命的恶性疾病之一,其患者在早期没有明显的症状,而一旦发现通常已到晚期,难以治愈,死亡率很高根据肝肿瘤与正常肝__所表现的MRI__差异,以SPIO作MRI的对比剂,可用来诊断良性肝肿瘤、恶性肝肿瘤及肝硬化、肝炎等肝脏疾病
[122]而超微型超顺磁性氧化铁更有助于肝血管瘤的检出和定性诊断,国外很早就将这种造影剂用于临床诊断,但由于它的制作工艺复杂,而且__昂贵,在我国很难广泛使用为此,中国医科大学的陈丽英教授与中科院金属研究所合作,研究超微型超顺磁性氧化铁脂质体,该物质可用于发现直径小于3mm的肝肿瘤,对于肝癌的早期诊断与治疗具有十分重要的意义
[123]结合SPIO的MRI技术除用于肝病的诊断外,还可用于心肌缺血、脑血流灌注等心、脑梗阻疾病的定位和诊断
[122]经静脉、皮下或肌肉注射,超微型超顺磁性氧化铁可用于淋巴结疾病的诊断,其关键在于制备出能被淋巴结巨噬细胞识别、而无法被肝脏和脾脏识别的对比剂表面用葡聚糖修饰、直径不等的两种对比剂Sinerem和MION-46可用于小鼠体内增生、受损的淋巴结磁共振成像
[124]而Illum等
[125]报道,用PEG修饰SPIO的表面,经小鼠体内静脉注射表明,可用作靶向区域性淋巴结的诊断试剂为提高SPIO在恶性肿瘤中累积的高效性和专一性,人们将磁核与不同的配体如抗体IgG、人的多克隆IgG和L6抗体等结合,经动物实验表明,该磁性标记在靶部位可获得高浓度的富集,但所需抗体量较大为此,Zhang等人先用3-氨丙基三甲氧基硅烷处理直径为10__的磁性颗粒,再与叶酸连接,该连接物可被小鼠的巨噬细胞和人的乳癌细胞内化,但可控性较差;Sonvico将表面修饰以葡聚糖的超微型超顺磁性氧化铁与叶酸连接的PEG键合,该键合物仅内吞到含有叶酸受体的细胞里
[120]基于此,Choi等人
[126]利用靶向释放SPIO至肿瘤部位,进行活体MRI研究结果表明,当SPIO与叶酸连接且细胞上有叶酸受体时,SPIO可快速、有效地内吞至靶细胞中经活体肿瘤MRI前后对比发现,__强度降低了38%,是正常肌肉MRI__强度改变值的3倍通过与其它的诊断试剂相结合,该连接物可用于肿瘤诊断和靶向性治疗
10.
3.3其它磁性纳米粒及其在医学诊断中的应用纳米免疫磁珠因具有高特异性、高分离性和高__性等优点,被用于疾病的早期诊断中例如,王晓光等利用抗细胞角蛋白7/8单克隆抗体包被的纳米免疫磁珠富集肺癌早期患者外周血中极少量的肿瘤细胞,经免疫染色后,在光学显微镜下直接观察阳性细胞,该法的准确性高,为肺癌的早期诊断提供了有效的途径
[127]Chen等研究者用外皮细胞抗体修饰的磁性纳米粒分离前列腺癌晚期患者的癌细胞,并对癌细胞进行计数由于癌细胞的数目反映了当前的疾病状况,因此,该法为前列腺疾病的临床诊断奠定了基础
[128]通常,需要经过PCR扩增技术才能对病毒进行直接检查,而且时间长、结果不可靠为此,哈佛大学医学院的研究人员将特定病毒的抗体与外层包裹有糖链的氧化铁磁性纳米粒结合,注射至人体内,经MRI检测病毒运用这种新技术,他们在血液样品中已成功检测到了单纯的疱疹病毒和一种腺病毒由于该项技术所需构件均为商业化产品,相信它将很快应用于相关疾病的临床诊断
[129]
10.
3.4前景与展望目前,超顺磁性氧化铁已成功用于临床医学的磁共振成像,对肿瘤的诊断具有十分重要的意义但是,如何提高超顺磁性氧化铁在恶性肿瘤中累积的高效性和专一性,获得靶向性释放的能力,还需要在超顺磁性氧化铁的表面功能化方面进行探索而普通磁性纳米粒的应用范围还将进一步地拓展
10.4其它纳米粒及其在医学诊断中的应用除了上述三种主要的纳米诊断试剂外,还有一些其它的纳米诊断试剂,如硅纳米粒子、聚苯乙烯纳米粒子、银纳米粒子以及稀土金属纳米粒子等下面就简要介绍这些纳米粒在医学诊断中的应用
10.
4.1硅纳米粒诊断试剂用亲和素,含硫、氨、羧酸酯等基团的物质修饰硅纳米粒的表面,再与生物素化的物质、寡核苷酸、酶、抗体等连接,可用于生物分子的分析检测和疾病诊断
[130]谭蔚弘等以荧光免疫分析法为基础,建立了硅纳米粒检测O157:H7型大肠杆菌的新方法,该法简单、快速检测时,只需将硅纳米粒放入食品样本溶液中,如果样本里存在大肠杆菌,经抗原-抗体特异性的作用,纳米粒就会与大肠杆菌结合由于纳米粒装有很多荧光染料,通过荧光检测即可获得样本中大肠杆菌的含量该法在其它细菌的检测及细菌的同时检测等方面具有较大的应用潜能,并在生化试剂、食品、临床及环境样品的检测中具有广阔的应用前景
[131132]目前,对硅纳米粒的研究主要集中在生物标记
[133]、分子成像
[134]和DNA的分离与检测
[135]等方面虽然这方面的研究尚处于基础和试验阶段,有关反应机理、探针修饰及荧光猝灭等诸多问题还有待解决
[130],但鉴于硅纳米粒的光稳定性和荧光检测的超灵敏性,相信硅纳米粒会和量子点、纳米金、磁性纳米粒诊断试剂一样,成为疾病诊断的有力工具
10.
4.2聚苯乙烯纳米粒诊断试剂田小东等人以重氮基聚苯乙烯为载体,首次研制出登革病毒特异性重氮乳凝快速诊断试剂,该试剂在登革病毒1-4型间交叉明显,对登革病毒以外的其它虫媒病毒无明显交叉反应,最低检出抗原量达15ng/ml病毒蛋白水平
[136]曾年华等人应用纯化的痢疾多价抗体致敏新型免疫载体重氮基聚苯乙烯乳胶,制成痢疾重氮乳凝试剂,在国内首次用于诊断志贺氏菌属痢疾杆菌
[137]钱应娟等人应用新型的聚醛化聚苯乙烯载体微球与最佳的旋毛虫抗原共价交联制备成特异性强、敏感性高、重复性好的快速诊断试剂,应用于猪旋毛虫病的生前诊断
[138]近年来,随着科学技术的不断发展,人们已经制备出多种新型的聚苯乙烯掺杂纳米材料,如聚苯乙烯/丙烯酸丁酯/纳米碳酸钙
[139]、聚苯乙烯/纳米二氧化铈
[140]、二氧化硅/聚苯乙烯
[141]、纳米Fe3O4/聚苯乙烯
[142]、纳米银/聚苯乙烯
[143],这为__新一代诊断试剂奠定了基础
10.
4.3银纳米粒诊断试剂三角形的纳米银粒子具有优良的光谱特性
[144145],利用这种粒子对环境的敏感性可以制备一类新的纳米诊断试剂,研究表明,这类诊断试剂具有灵敏度高、选择性好、成本低等优点,在未来的医学诊断中具有潜在的应用价值Haes等人
[146]研究了不同形状的纳米银的表面等离子体基元共振光谱,发现在十六硫醇的诱导下,同样体积的三角形纳米银比半球形的纳米银具有更大的峰位移,若将这种三角形的纳米银设计为传感器用于诊断,将比传统的传感器具有更高的灵敏度Docherty等人
[147]研究了生物分子标记的纳米银粒子的表面增强拉曼光谱,并讨论了该体系用于生物检测及诊断的可行性
10.
4.4稀土金属纳米粒诊断试剂Yi等人
[148]合成了掺杂Yb和Er的NaYF4纳米晶体,所合成的纳米晶体尺寸分布窄,粒径可调控,这种纳米晶体可发射上转换荧光,量子产率可达1%,这种上转换荧光标记试剂在未来有望进一步用于生物诊断Soukka等人
[149]将相关抗体标记到EuIII螯合的聚苯乙烯纳米球上,使用两步非竞争免疫分析法测定了前列腺癌标志物PSA-F,检测限可达
0.21ng/LFeng等人
[150]成功制备出功能化的氧化铕探针,发现这种发射红色荧光的探针的发射波长窄,荧光寿命长,该探针用于免疫分析灵敏度可达到亚ppb级近年来,我国在纳米材料粉体的制备上有长足的进展,目前很多纳米材料都已商品化,如纳米氧化物方面有纳米氧化锌、纳米氧化钛、纳米氧化硅、纳米氧化锆、纳米氧化镁、纳米氧化钴、纳米氧化镍、纳米氧化铬、纳米氧化锰、纳米氧化铁等,纳米金属和合金方面有银、钯、铜、铁、钴、镍、钛、铝、银-铜合金、银-锡合金、铜-钛合金、镍-铁合金、镍-钴合金等,纳米碳化物方面有碳化钨、碳化硅、碳化钛、碳化铬、碳化铌、碳化硼等,纳米氮化物有氮化硅、氮化铝、氮化钛、氮化硼
[151]这些产品的__为发展新一代纳米诊断试剂奠定了坚实的基础,在未来的几年,这方面的研究工作将是人们的一个研究热点我们有理由相信,在不久的将来,会有更多的纳米诊断试剂用于医学诊断领域,将进一步提高诊断的灵敏度及准确性
10.5微芯片技术在医学诊断中的应用生物芯片的出现是近年来高新技术领域中极具时代特征的重大进展,是物理学、微电子学与分子生物学综合交叉形成的高新技术
[152]若以使用功能区分,生物芯片可分为微阵列芯片MicroarrayChip与微流控芯片MicrofluidicChip两大类微阵列芯片是将成千上万的微型生物传感器有如数组般排列在不同材质的载体上,如玻璃、尼龙、硅芯片或塑料等材质,借着生物传感器上的生物探针与样品中的特定对象进行生化反应,再经换能器将反应结果转换成讯号输出若以载体上排列物质分类,微阵列芯片又可以分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片及__芯片等
[153],其中,基因芯片和蛋白质芯片已经得到了较为广泛的应用微流控芯片是采用微__方法,在平方厘米级大小的芯片上刻蚀出扁平的通道和其它功能单元,通过不同的通道网络、反应器、检测单元等的设计和布局,实现样品的进样、反应、分离和检测的微型实验装置,具有快速、高效和低耗等特点
[154]生物芯片技术的成熟和应用,一方面将为本世纪的疾病诊断和治疗、新药__、分子生物学、____、司法鉴定、食品卫生和环境监测等领域带来一场__;另一方面则为人类提供了能够对个体生物信息进行高速、并行采集和分析的强有力的技术手段,必将成为未来生物信息学研究中的重要信息采集和处理平台目前,生物芯片市场增长势头迅猛2000年,全球生物芯片市场为120亿美元;到2001年,这一数额已上升到170亿美元据预测,2005年,全球生物芯片市场将达到200亿美元,仅美国用于基因组研究的芯片销售额将达50亿美元
[155]关于生物芯片的研究,目前已经有很多专著问世,如马立人教授编写、化学工业出版社出版的《生物芯片》一书
[31],李瑶编写、化学工业出版社出版的《基因芯片技术解码生命》
[156],马文丽编写、广东科技出版社出版的《DNA芯片技术的方法与应用》
[157]等,这些专著详细介绍了生物芯片相关的基本知识、制备、检测技术以及应用等方面的内容方肇伦院士编写的《微流控分析芯片的制作及应用》一书
[158],介绍了微流控芯片的设计、制备、检测及其在生命科学中的应用鉴于此,本章仅简要介绍目前应用较多的基因芯片、蛋白质芯片及微流控芯片在医学诊断中的应用情况
10.
5.1基因芯片在医学诊断中的应用基因芯片又称DNA芯片,它是在基因探针的基础上研制出来的所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交__的强度及分布来进行分析
[31155156]上个世纪90年代以来,随着“人类基因组计划”和“人类后基因组计划”的开展,科学家们发现,几乎所有的遗传疾病、环境相关疾病及感染性疾病,都可以通过DNA来进行分析这些疾病包括癌症、帕金森症、类风湿性关节炎、糖尿病、艾滋病、肝炎、血友病、地中海贫血、杜氏肌营养不良、异常血红蛋白病、苯酮尿症等基因芯片可识别易患某些疾病的个体基因倾向性,从正常人的基因组中分离出DNA,与芯片杂交可得出标准图谱,然后将不同患者的DNA与芯片杂交,比较两种图谱的细微差异可得到病变的DNA信息,这样患病可能性最大的人就可以进行预防监控、护理及早期治疗
[159]肿瘤是目前对人类有严重危害的疾病之一,其发生和发展往往涉及多种基因的异常,如慢性粒细胞白血病可检测到融合基因bcr-abl,急性早幼粒白血病常可检测到融合基因pml-rarα等,此外原癌基因c-myc、ras以及抑癌基因p
53、Rb等的异常也常可在多种类型的肿瘤细胞中检测到,研究这些肿瘤相关的基因,对于肿瘤的早期诊断及治疗具有重要的意义
[31]BRCA1基因是乳腺癌和卵巢癌基因诊断的分子标志Guo等人
[160]将96600种含20个碱基的寡聚核苷酸探针排列在DNA芯片上,用于检测BRCA1基因第11外显子
3.45kb的突变在被检测的15例病人样品中,有14例检测到突变,而在20例对照样品中,无假阳性结果出现此结果展示了DNA芯片技术在疾病基因诊断中很好的应用前景,未来有可能代替某些常规的诊断技术Wen等人
[161]用P53基因芯片和传统的DNA序列分析法,分别检测了108例卵巢癌患者的基因突变结果表明,总共有77例突变被两种方法检测出来,其中71例被芯片技术检测出来,63例被传统的DNA测序法检测出来不一致的结果中,有14例被基因芯片检测出来而常规的方法未检测出来,有6例被常规的方法检测出来而未被基因芯片检测出来,表明芯片技术具有94%的准确性、92%的灵敏性及100%的特异性
10.
5.2蛋白质芯片在医学诊断中的应用蛋白质芯片又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列,它是将大量的蛋白质、蛋白质检测试剂或检测探针以预先设计的方式固定在玻片、硅片、纤维膜等固定载体上组成密集的阵列,能够高通量地测定蛋白质的生物活性、蛋白质与大分子和小分子的相互作用,或者用于高通量定性、定量检测蛋白质
[162]近年来,蛋白质芯片已成为人们研究的热点之一由于蛋白质芯片具有快速、高效、高通量的特点,因而,该项技术在医疗诊断等方面有着很大的发展前景澳大利亚科学家Blelov
[163]制备了一种含有60个CD抗体的微阵列,可用它来区分常规的白血病和非常规的白血病,并提供了一种新的疾病标记物和抗原的发现方法,在病人的治疗过程中,该法可测定很少量的残留病毒CiphergenBiosystem公司研究小组的科学家们
[164]应用蛋白质芯片研究了健康个体和不同发病阶段癌症病人的血清样品,仅仅三天时间,他们就发现了前列腺癌的六种潜在标记物,而常规的方法则需要几个月到几年的时间Brown等人
[164]选择来自肿瘤不同阶段200多个激光俘获微分析LCM衍生的上皮性卵巢癌细胞进行研究,应用表面增强激光解析离子化SELDI疏水性蛋白质芯片进行分析,结果发现上皮卵巢癌三个阶段5~8个不同细胞重量的多肽现象指纹Boyle等人
[165]使用SELDI蛋白质芯片系统分析了链球菌生脓微生物分泌的链球菌外毒素BSpeB他们将SELDI-TOF-MS与CiphergeBiosystem公司的蛋白质读数体系相结合,鉴定了Mr~41000的SpeB蛋白质的酶原形式及Mr~28500的SpeB全活性酶,并观察到SpeB表达特征在SpeB酶原形式自动活化的动力学研究中,他们发现了全活性酶积聚之前相继产生的四种SpeB中间体
10.
5.3微流控芯片在医学诊断中的应用近几年来,微流控芯片技术在疾病早期诊断方面也得到了快速的发展中科院大连化物所Zhou等人
[166]对发热型病毒性呼吸道疾病早期检测系统研究取得重大进展,已能在自制的芯片分析仪和芯片上用自行设计的聚合酶链反应PCR试剂盒进行____冠状病毒____-CoV的阳性和阴性对照测定该项研究的突出特点在于即使是待检测者的样本中含有极微量的病毒RNA,也可以利用RT-PCR与微流控芯片在线检测技术做到早期诊断与常规的PCR-平板凝胶电泳相比,该系统的灵敏度提高了100倍在实际应用中,研究人员使用了____-CoV的以____病毒cDN__断为阳性对照物,以副流感病毒作为阴性对照物,正反两面的结果证明,用自行设计的引物和相关模板得到的试剂盒,阳性诊断率为94%,而采用常规的PCR-平板凝胶电泳方法阳性诊断率仅为67%Sato等人
[167]将表面吸附抗癌胚抗原抗体的聚苯乙烯微珠导入微通道,与含有癌胚抗原的血清样品、一抗、标记胶体金的二抗依次反应,最后用热透镜法TLM检测固定在微珠表面的抗原-抗体配合物与ELISA方法相比,该方法将整个反应过程时间从45小时缩短到35分钟,使微芯片技术用于癌症的早期诊断成为可能Christodoulides等人
[168]采用夹心免疫的方法,在微流控芯片上实现了人血清中心脏病危险因子C反应蛋白和白细胞间色素-6的同时检测,该技术为发展心脏病快速诊断芯片奠定了基础____1http://___.
863.org.cn/863_105/applyguide/guide_bioagri/
200406010016.htmlhttp://___.
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01.isiknowledge.com:80/SID=A4IlCAGK@__3gLK4ClhFunc=Abstractdoc=12/1.J__gn__gn__ter20052931:33-40112ZhangSLPengTZYangCF.Apiezoelectricgene-sensorusingactinomycinD-functionalizednano-microspheresasamplifyingprobeshttp://wos
01.isiknowledge.com:80/SID=A4IlCAGK@__3gLK4ClhFunc=Abstractdoc=4/4.JElectro____Chem20025222:152-157113谭家驹张春富冯彦林等.靶向治疗用Fe3O4及其白蛋白包被磁性纳米粒子的制备.中国医学工程__2003116:30-32114WangFHYo____akeTKimDKetal.Determinationofconjugationefficiencyofantibo___sandproteinstothesuperpara__gneticironoxidenanoparticlesbycapillaryelectrophoresiswithlaser-indu__dfluores__n__detection.JNanopartRes200351-2:137-146115GuptaAKCurtisASG.Lactoferrinand__rulopla__inderivatizedsuperpara__gneticironoxidenanoparticlesfortargeting__llsu_____re__ptors.Bio__terials20042515:3029-3040116DyalALoosKNotoMetal.ActivityofCandidarugosalipaseimmobilizedongam__-Fe2O3__gneticnanoparticles.JAmChemSoc20031257:1684-1685117PanBFGaoFGuHCetal.Dendrimermodified__gnetitenanoparticlesforproteinimmobilization.JColloidInte_____Sci20052841:1-6118LiJSHeXXWuZYetal.Piezoelectricimmunosensorbasedon__gneticnanoparticleswith______immobilizationpro__dures.____ChimActa20034812:191-198119陈伟张绍祥丁仕义等.磁共振单克隆抗体免疫靶向对比剂McAb-DMP的制备.第三军医大学学报2002246:634-635120MornetSVasseurSGrassetFetal.__gneticnanoparticledesignformedicaldiagnosisandtherapy.J__terChem20041414:2161-2175121磁性纳米材料在临床磁共振成像中的应用.纳米平台:http://___.__pt.com.cnhttp://___.__pt.com.cn122徐辉碧杨祥良.纳米医药.北京:清华大学出版社2004215-218123我国首把纳米技术用于肿瘤诊断.迈博资讯:http://___.medboo.comhttp://___.medboo.com124BriggerIDubernetCCouvreurPetal.Nanoparticlesincan__rtherapyanddiagnosis.AdvDrugDeliveryRev2002545:631-651125IllumLChurchAEButterworthMDetal.Developmentofsystemsfortargetingtheregionallymphnodesfordiagnostici__ging:invivobeh__iourofcolloidalPEG-coated__gnetitenanospheresintheratfollowinginterstitialadministration.PharmRes2001185:640-645126ChoiHChoiSRZhouRetal.Ironoxidenanoparticlesas__gneticresonan__contrastagentfortumori__gingviafolatere__ptor-targeteddelivery.AcadRadiol2004119:996-1004127王晓光胡红刘又宁.应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌循环血中肿瘤细胞.中华医学__20048416:1393-1395128ChenBTLobergRDNeeleyCKetal.Preliminarystudyofimmuno__gneticquantificationofcirculatingtumor__llsinpatientswithadvan__ddisease.Urology2005653:616-621129磁性纳米颗粒注射技术将精确定位人体内的病毒.中国生物技术___:http://___.biotech.org.cnhttp://___.biotech.org.cn130TanWHWangKMHeXXetal.Bionanotechnologybasedonsilicananoparticles.MedResRev2004245:621-638131ZhaoXJHilliardLRMecherySJetal.Arapidbioassayforsinglebacterial__llquantitationusingbioconjugatednanoparticles.ProcNatlAcadSciUSA200410142:15027-15032132美国__出大肠杆菌超灵敏快速检测法.中国教育和科研计算机网:http://___.edu.cnhttp://___.edu.cn133HeXXDuanJHWangKMetal.Anovelfluores__ntlabelbasedonorganicdye-dopedsilicananoparticlesforHepGlivercan__r__llrecognition.JNanosciNanotechnol200446:585-5__134SantraSXuJSWangKMetal.Lumines__ntnanoparticleprobesofbioi__ging.JNanosciNanotechnol200446:590-599135LianWLitherlandSABadraneHetal.Ultrasensitivedetectionofbiomoleculeswithfluores__ntdye-dopednanoparticles.____Biochem20043341:135-144136田小东刘有初饶颐年.登革病毒特异性重氮乳胶的研究及应用.华南国防医学__19944:11-14137曾年华王志斌吴春刚.新型胶乳凝集试验在细菌性痢疾快速诊断中的应用研究.中国公共卫生1999159:85-85138钱应娟张北民张惠英等.PAPS免疫微球快速诊断猪旋毛虫病的研究.中国兽医寄生虫病200082:1-5139张雪琴毋伟曾晓飞等.聚苯乙烯/丙烯酸丁酯/纳米碳酸钙复合微粒的制备与表征.北京化工大学学报2005321:1-4140席宝信王梅邢强等.聚苯乙烯/纳米二氧化铈复合材料的制备与表征.工程塑料应用2005333:57-60141黄忠兵唐芳琼.二氧化硅/聚苯乙烯单分散性核/壳复合球的制备.高分子学报20046:835-838142章永化陈守明陈建华.纳米Fe3O4/聚苯乙烯均匀分散体系的制备及结构.高等学校化学学报2003249:1717-1720143黄琨胡文军范敬辉等.乳液聚合制备纳米银/聚苯乙烯核壳复合粒子.功能高分子学报2003163:304-308144CioffiNDitarantoNTorsiLetal.____yticalcharacterizationofbioactivefluoropolymerultra-thincoatingsmodifiedbycoppernanoparticles.____Bio____Chem20053813:607-616145DanielsJKPargaKA.Silvernanoparticle-basedbiologicalassays.AbstractsofPapersoftheAmericanChemicalSociety2005229:U704-U704146HaesAJZouSLSchatzGCetal.Nanoscaleopticalbiosensor:shortrangedistan__dependen__ofthelocalizedsu_____pla__onresonan__ofnoblemetalnanoparticles.JPhysChemB200410822:6961-6968147DochertyFTClarkMMcNayGetal.Multiplelabellednanoparticlesforbiodetection.FaradayDiscuss2004126:281-288148YiGSLuHCZhaoSYetal.Synthesischaracterizationandbiologicalapplicationofsize-controllednanocrystallineNaYF4:YbErinfrared-to-visibleup-conversionphosphors.NanoLett2004411:2191-2196149SoukkaTAntonenKHar__Hetal.Highlysensitiveimmunoassayoffreeprostate-specificantigeninserumusingeuropiumIIInanoparticlelabeltechnology.ClinChimActa20033281-2:45-58150FengJShanGM__quieiraAetal.Functionalizedeuropiumoxidenanoparticlesusedasafluores__ntlabelinanimmunoassayforatrazine.____Chem20037519:5282-5286151纳米技术与我们的机会
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50.Graph图10-1近几年量子点在生物、药物以及生物医学等领域应用发表文章数目(2005年仅统计了1-9月份的数据)图10-2CdSe量子点及CdSeTe量子点荧光性质随组成及尺寸的变化A CdSe量子点荧光发射光谱随尺寸的变化;B半径为
2.5__的Cd___Te1-x量子点荧光发射光谱随组成的变化
[613]图10-3多功能水溶性量子点的结构示意图,其表面修饰的分子有TOPO、两性共聚物、肿瘤识别试剂如蛋白质、抗体、小分子抑制剂等及聚乙二醇
[627]AB图10-4麦芽糖结合蛋白MBP功能化量子点用于荧光共振能量转移测定麦芽糖A一次荧光共振能量转移法检测麦芽糖;B两次荧光共振能量转移法检测麦芽糖
[41]图10-5使用QD-IgG探针测定癌症标志物Her2A,C固定的SK-BR-3乳腺癌细胞与抗Her2单克隆抗体及抗鼠IgG标记的量子点一起培养,Her2被QD535-IgGA及QD630-IgGC标记B,D细胞与鼠IgG及QD-IgG共培养BQD535-IgG,DQD630-IgG,只观察到很弱的非特异性吸附__
[52]图10-6功能化量子点用于活体成像分析示意图上图表示功能化量子点在老鼠的特定__上聚集的情况下图为多肽左以及多肽和PEG混合右修饰量子点的示意图PEG可以减少量子点在活体内的非特异性吸附
[54]图10-7纳米金标银染加强的三明治杂交分析法用于DNA检测
[69]图10-8pH值变化对Cytc修饰的纳米金溶液的影响A纳米金溶液的颜色;B不同pH值条件下,Cytc修饰的纳米金溶液的颜色pH值从左到右依次为
4.0,
5.0,
5.5,
6.2,
6.7,
7.2,
8.3,
9.2,
10.1;C24小时后,不同pH值条件下,Cytc修饰的纳米金溶液的颜色
[99]图10-9A葡聚糖修饰的纳米金的制备方法;B葡萄糖检测机理
[64]。