文本内容:
Hela细胞传代培养实验目的掌握动物细胞培养的基本原理和方法实验用具每组用具(移液枪一把,一盒枪头,长吸管一包(4-6根),培养瓶1个【4-8人为一组,看细胞数量来定,传代比例1;2最多13】实验药品
0.25%胰酶,D-Hanks,1640培养基实验原理HeLa是HenriettaLacks的简称,HenriettaLacks是一位患有__颈癌的美国妇女的名字,在她死后,该细胞走被广泛散发到各研究机构,并无限次地繁殖__下去实验前的准备:培养基的配置RPMI-1640培养粉1袋碳酸氢钠
2.0g青、链霉素各100单位/毫升加三蒸水至1000ml过滤除菌调节pH值至
7.2临用前加血清(终浓度10%)消化液的配置胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用灭菌的D-hanks配置配制常用的胰蛋白酶液浓度是
0.25%用滤器过滤除菌D-hanks配方:氯化钠
8.0g氯化钾
0.4g磷酸氢二钠(Na2HPO·7H2O)
0.06g磷酸二氢钾
0.06gNaHCO
30.35gEDTA二钠
0.2g酚红
0.02g三蒸水定容到1000毫升PH调整到
8.0血清的准备与添加__血清的标准透明,淡黄色,无沉淀物,无细菌、支原体、病毒污染血清的灭活(消除补体活性)56℃水浴,30分钟培养用具的准备所用器具高压灭菌,D-hanks缓冲液酶液,培养液实验步骤
1.打开超净台,把实验中所需用具放到超净台上
2.从冰箱中取出
0.25%胰酶、培养基可以把胰酶和培养基的瓶盖拧松备用
3.取待传代的细胞,倒掉旧的培养基,移液枪加入胰酶2ml(加入的量以覆盖整个细胞培养面为宜)轻轻摇动
4.1-2分钟后迅速将消化液倒掉注意此步消化时间需要根据每次培养的细胞不同状态灵活掌握,没有固定时间消化时间长短是实验成败的关键,宁可短消化,不能过消化否则细胞会变死在倒置显微镜下观察,当细胞质回缩,胞间间隙加大为消化适宜5.取培养基5ml加入培养瓶终止消化,轻轻摇动,如果瓶壁依然有细胞未脱落,用长吸管反复轻轻吹打培养瓶壁,制备细胞细胞悬液吹打的部位均匀,从上到小,从左到右,顺序进行吹打,保证各个部位的培养细胞均能吹打到,成片的细胞已经分散成小的细胞团或者单细胞便停止吹打吹打时用力不要过猛,尽量不要出现气泡,以免损伤细胞6.至所有细胞从培养瓶壁脱落下来,轻轻摇匀,然后按照12或者1;3均分,每个培瓶(50ml)补齐到5ml培养基,放入CO2培养箱中培养,放入之前瓶盖适当拧松,酒精喷雾消毒瓶盖和瓶身7.待培养基(本身为红色),当pH值降低,培养基呈偏淡红色时,一般2天以后,将旧的培养基吸掉,更换新鲜培养基继续培养注意动物细胞特别容易污染,所有环节定要小心消毒。