还剩12页未读,继续阅读
本资源只提供10页预览,全部文档请下载后查看!喜欢就下载吧,查找使用更方便
文本内容:
三、核酸电泳相关试剂、缓冲液的配制方法50×TAEBufferpH
8.5组份浓度2MTris-醋酸,100mMEDTA配制量1L配制方法
1.称量下列试剂,置于1L烧杯中Tris242gNa2EDTA·2H2O
37.2g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加入
57.1ml的乙酸,充分搅拌
4.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存10×TBEBufferpH
8.3组份浓度890mMTris-硼酸,20mMEDTA配制量1L配制方法l.称量下列试剂,置于lL烧杯中Tris108gNa2EDTA·2H2O
7.44g硼酸55g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存10×MOPS3-吗啉基丙磺酸Buffer组份浓度200r__MOPS,20mMNaOAc,10mMEDTA配制量1L配制方法
1.称
41.8gMOPS,置于1L烧杯中
2.加约700mlDEPC处理水,搅拌溶解
3.使用2NNaOH调节pH值至
7.
04.再向溶液中加入下列试剂1MNaOAcDEPC处理20ml
0.5MEDTApH
8.0DEPC处理20ml
5.用DEPC处理水将溶液定容至1L
6.用
0.45m滤膜过滤除去杂质
7.室温避光保存注溶液见光或高温灭菌后会变黄变黄时也可使用,但变黑时不要使用溴乙锭10mg/ml组份浓度10mg/ml溴乙锭配制量100ml配制方法
1.称量1g溴乙锭,加入到100ml容器中
2.加入去离子水100ml,充分搅拌数h完全溶解溴乙锭
3.将溶液转移至棕色瓶中,室温避光保存
4.溴乙锭的工作浓度为
0.5g/ml注意溴乙锭是一种致癌物质,必须小心操作Agarose凝胶配制方法
1.配制适量的电泳及制胶用的缓冲液通常是
0.5×TBE或1×TAE
2.根椐制胶量及凝胶浓度,准确称量琼脂糖粉,加入适当的锥形瓶中
3.加入一定量的电泳缓冲液总液体量不宜超过锥形瓶的50%容量注用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须统一
4.在锥形瓶的瓶封上保鲜膜,并在膜上扎些小孔,然后在微波炉中加热熔化琼脂糖加热过程中,当溶液沸腾后,请戴上防热手套小心摇动锥形瓶使琼脂糖充分均匀熔化此操作重复数次,直至琼脂糖完全熔化必须注意,在微波炉中加热时间不宜过长,每次当溶液起泡沸腾时停止加热,否则会引起溶液过热暴沸,造成琼脂糖凝胶浓度不准,也会损坏微波炉熔化琼脂糖时,必须保证琼脂糖充分完全熔化,否则,会造成电泳图像模糊不清
5.使溶液冷却至60℃左右,如需要可在此时加入溴乙锭溶液终浓度
0.5µg/ml并充分混匀注溴乙锭是一种致癌物质使用含有溴乙锭的溶液时,请戴好手套
6.将琼脂糖溶液倒入制胶模中,然后在适当位置处插上梳子凝胶厚度一般在3~5min之间
7.在室温下使胶凝固大约30min~1h,然后放置于电泳槽中进行电泳注凝胶不立即使用时,请用保鲜膜将凝胶包好后在4℃下保存,一般可保存2~5天琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖浓度最佳线形DNA分辨范围bp
0.5%
0.7%
1.0%
1.2%
1.5%
2.0%1000~30000800~12000500~10000400~7000200~300050~20006×LoadingBufferDNA电泳用组份浓度30mMEDTA36%V/VGly__rol
0.05%W/VXyleneCyanolFF
0.05%W/VBromophenolBlue配制量500ml配制方法
1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中EDTA
4.4gBromophenolBlue250mgXyleneCyanolFF250mg
2.向烧杯中加入约200ml的去离子水后,加热搅拌充分溶解
3.加入180ml的甘油Gly__rol后,使用2NNaOH调节pH值至
7.
04.用去离子水定容至500ml后,室温保存10×LoadlngBufferRNA电泳用组份浓度10mMEDTA50%V/VGly__rol
0.25%W/VXyleneCyanolFF
0.25%W/VBromophenolBlue配制置10ml配制方法
1.称量下列试剂,置于10ml离心管中
0.5MEDTApH
8.0200µlBromophenolBlue25mgXyleneCyanolFF25mg
2.向离心管中加入约4ml的DEPC处理水后,充分搅拌溶解
3.加入5ml的甘油Gly__rol后,充分混匀
4.用DEPC处理水定容至10ml后,室温保存
四、核酸、蛋白质杂交用相关试剂、缓冲液的配制方法20×SSC组份浓度
3.0MNaCl,
0.3MNa3citrate·2H2O柠檬酸钠配制量1L配制方法
1.称量下列试剂,置于lL烧杯中NaCl
175.3gNa3citrate·2H2O
88.2g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解3滴加14NHCl,调节pH值至
7.0后,加去离子水将溶液定容至1L
4.高温高压灭菌后,室温保存20×SSPEBuffer组份浓度
3.0MNaCl,
0.2MNaH2PO4,
0.02MEDTA配制量
1.L配制方法
1.称量下列试剂,置于lL烧杯中NaCl
175.3gNaH2PO4·H2O
27.6gNa2EDTA·2H2O
7.4g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加NaOH调节pH值至
7.4约
6.5ml的10NNaOH
4.加去离子水将溶液定容至lL
5.高温高压灭菌后,室温保存50XDenhardt’S溶液1%W/VFicoll400菲可400/水溶性聚蔗糖4001%W/VPolyvinylpyrrolidone聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮1%W/VBSA组份浓度配制量500ml配制方法
1.称量下列试剂,置于500ml烧杯中Flcoll4005gPoLyvlnylpyrrolldone5gBSA5g
2.加去离子水约400ml,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至500ml
4.用
0.45µm滤膜过滤后,分装成每份25ml
5.-20℃保存
0.5M磷酸盐Buffer组份浓度
0.5MNa2HPO4配制量lL配制方法
1.称量134gNa2HPO4·7H2O置于lL烧杯中
2.加入约800ml的去离子水充分搅拌溶解
3.加入85%的H__O4浓磷酸调节溶液pH值至
7.
24.加去离子水定容至1L
5.高温高压灭菌后,室温保存SalmonDNA鲑鱼精DNA组份浓度10mg/mlSalmonDNA配制量约100ml配制方法
1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中,加入约200ml的TEBuffer2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h,溶解后加入4ml的5MNaCl,使其终浓度为
0.1M
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次
4.回收水相溶液后,使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次,以切断DNA
5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀
6.离心回收DNA后,溶解于100ml的去离子水中测定溶液的OD260值
7.计算溶液的DNA浓度后,稀释DNA溶液至10mg/ml
8.煮沸10min后,分装成小份1ml/份-20℃保存
9.使用前在沸水浴中加热5min后,迅速冰浴冷却DNA变性缓冲液组份浓度
1.5MNaCl,
0.5MNaOH配制量1L配制方法
1.称量下列试剂,置于lL烧杯中NaCl
87.7gNaOH20g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至lL后,室温保存预杂交液/杂交液DNA杂交用6×SSC或SSPE5×Denhardt’s
0.5%W/VSDS100µg/mlSalmonDNA组份浓度配制置100ml配制方法
1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中20×SSC或SSPE30ml50×Denhardt’s10ml10%SDS5ml10mg/mlSalmonDNA1mldH2O54ml
2.充分混匀后,使用
0.45µm滤膜滤去杂质后使用预杂交液/杂交液RNA杂交用6×SSC或SSPE5×Denhardt‘s
0.5%W/VSDS100g/mlSalmonDNA50%V/VFor__mlde组份浓度配制量100mL配制方法
1.称量下列试剂,置于200ml烧杯中20×SSC或SSPE30ml50×Denhardt’s10ml10%SDS5ml10mg/mlSalmonDNA1mlFor__mide甲酰胺50mldH2O4ml
2.充分混匀后,使用
0.45µm滤膜滤去杂质后使用膜转移缓冲液Western杂交用组份浓度39mMGlycine,48mMTris,
0.037%W/VSDS,20%V/V甲醇配制量1L配制方法
1.称量下列试剂,置于lL烧杯中Glycine
2.9gTris
5.8gSDS
0.37g
2.向烧杯中加入约600ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定溶至800ml后,加入200ml的甲醇
4.室温保存TBSTBufferWestern杂交膜清洗液组份浓度20mMTris-HCl,150mMNaCl,
0.05%V/VTween20配制量1L配制方法
1.称量下列试剂,置于lL烧杯中NaCl
8.8g1MTris-HClpH
8.020ml
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.加入
0.5mlTween20后充分混匀
4.加去离子水将溶液定容至lL后,4℃保存封闭缓冲液Western杂交用组份浓度5%W/V脱脂奶粉/TBSTBuffer配制量100ml配制方法
1.称5g脱脂奶粉加入到100mlTBSTBuffer中,充分搅拌溶解
2.4℃保存待用本封闭液应该现配现用
五、实验室常用培养基的配制方法Ampicillin氨卡青霉素100mg/ml组份浓度100mg/mlAmpicillin配制量50ml配制方法
1.称量5gAmpicillin置于50ml离心管中
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml
3.用
0.22µm过滤膜过滤除菌
4.小份分装1ml/份后,-20℃保存IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷24mg/ml组份浓度24mg/mLIPTG配制量50mL配制方法
1.称
1.2gIPTG置于50ml离心管中
2.加入40ml灭菌水,充分混合溶解后,定容至50ml
3.用022µm过滤膜过滤除菌4小份分装1ml,份后,-20℃保存X-Gal20mg/ml组份浓度20mg/mlX-Gal配制量50ml配制方法
1.称量lgX-Gal置于50ml离心管中
2.加入40mlDMF二甲基甲酰胺,充分混合溶解后,定容至50ml
3.小份分装1ml/份后,-20℃避光保存LB培养基组份浓度1%W/VTryptone胰蛋白胨,
0.5%W/VYeastExtract酵母提取物,1%W/VNaCl配制量1L配制方法
1.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加5NNaOH约
0.2m1,调节pH值至
7.
04.加去离子水将培养基定容至1L5高温高压灭菌后,4C保存LB/Amp培养基组份浓度1%W/VTryptone
0.5%W/VYeastExtract1%W/VNaCl
0.1mg/mlAmpicillin配制量1L配制方法
1.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加5NNaOH约
0.2mL调节pH值至
7.
04.加去离子水将培养基定容至1L
5.高温高压灭菌后,冷却至室温
6.加入1mlAmpicillin100mg/ml后均匀混合
7.4℃保存
1.2%W/VTryptone
2.4%W/VYeastExtract
0.4%V/VGly__rol17mMKH2PO472mMK2HPOaTB培养基组份浓度配制量
1.L配制方法
1.配制磷酸盐缓;中液
0.17MKH2PO4,
0.72MK2HPO4100ml溶解
2.31gKH2PO4和l
2.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone12gYeastExtract24gGly__rol4m
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
4.加去离子水将培养基定容至1L后,高温高压灭菌
5.待溶液冷却至60℃以下时,;加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液
6.4℃保存TB/Amp培养基组份浓度
1.2%W/VTryptone
2.4%W/VYeastExtract
0.4%V/VGly__rol17mMKH2PO472mMK2HPO
40.1mg/mlAmpicillin配制量1L配制方法
1.配制磷酸盐缓冲液
0.17MKH2PO4,
0.72MK2HPO4100ml溶解
2.31gKH2PO4和
12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone12gYeastExtract24gGly__rol4ml
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
4.加去离子水将培养基定容至lL后,高温高压灭菌
5.待溶液冷却至60℃以下时,加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液
6.均匀混合后4℃保存SOB培养基组份浓度2%W/VTryptone
0.5%W/VYeastExtract
0.05%W/VNaCl
2.5mMKCl10mMM__l2配制量1L配制方法
1.配制250mMKCl溶液在90ml的去离子水中溶解l.86gKCl后,定容至100ml
2.配制2MM__l2溶液在90ml去离子水中溶解19gM__l2后,定容至100ml,高温高压灭菌
3.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone20gYeastExtract5gNaCl
0.5g
4.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
5.量取10m1250mMKCl溶液,加入到烧杯中
6.滴加5NNaOH溶液约
0.2m1,调节pH值至
7.
07.加入去离子水将培养基定容至lL
8.高温高压灭菌后,4℃保存
9.使用前加入5ml灭菌的2MM__l2溶液SOC培养基组份浓度2%W/VTryptone
0.5%W/VYeastExtract
0.05%W/VNaCl
2.5mMKCl10mMM__l220mMGlucose配制量100mL配制方法
1.配制lMGlucose溶液将18gGlucose溶于90ml去离子水中,充分溶解后定容至100ml用
0.22µm滤膜过滤除菌
2.向l00mlSOB培养基中加入除菌的1MGlucose溶液2ml,均匀混合
3.4℃保存2×YT培养基组份浓度
1.6%WVTryptone,1%W/VYeastExtract,
0.5%W/VNaCl配制量1L配制方法
1.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone16gYeastExtract10gNaCl5g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加5NNaOH,调节pH值至
7.
04.加去离子水将培养基定容至1L
5.高温高压灭菌后,4℃保存Фb×broth组份浓度2%W/VTryptone,
0.5%W/VYeastExtract,o5%W/VMgSO4·7H2O配制量1L配制方法
1.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone20gYeastExtract5gMgSO4·7H2O5g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加1NKOH调节pH值至
7.
54.加去离子水将培养基定容至1L
5.高温高压灭菌后,4℃保存NZCYM培养基组份浓度
0.5%WVYeastExtract
0.1%WVCasaminoAcid(酪蛋白氨基酸)1%WVNZ胺
0.5%WVNaCl
0.2%WVMgSO4·7HO配制量1L配制方法
1.称取下列试剂置于lL烧杯中YeastExtract5gCasaminoAcid1gNZ胺10gNaCl5gMgSO4·7HO2g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加5NNaOH约
0.2m1,调节pH值至
7.
04.加去离子水将培养基定容至1L
5.高温高压灭菌后,4℃保存NZYM培养基组份浓度
0.5%WVYeastExtract1%WVNZ胺
0.1%WVNaCl
0.2%WVMgSO4·7HO配制方法NZYM培养基除不含CasaminoAcid外,其他成份与NZCYM培养基相同NZM培养基组份浓度1%WVNZ胺
0.1%WVNaCl
0.2%WVMgSO4·7HO配制方法NZM培养基除不含YeastExtract酵母提取物外,其他成份与NZYM培养基相同一般固体培养基的配制配制方法
1.按照液体培养基配方准备好液体培养基,在高温高压灭菌前,加入下列试剂中的一种Agar琼脂;铺制平板用15g/LAgar琼脂;配制顶层琼脂用7g/LAgarose琼脂糖;铺制平板用15g/LAgarose琼脂糖;配制顶层琼脂用7g/L
2.高温高压灭菌后,戴上手套取出培养基,摇动容器使琼脂或琼脂糖充分混匀此时培养基温度很高,小心烫伤
3.待培养基冷却至50~60℃时,加入热不稳定物质如抗生素等,摇动容器充分混匀
4.铺制平板30~35ml培养基/90mm培养皿LB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基组份浓度1%W/VTryptone
0.5%W/VYeastExtract1%W/VNaCl
0.1mg/mlAmpicillin
0.024mg/mlIPTG
0.04mg/mlX-GaL
1.5%W/VAgar配制量1L配制方法
1.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone10gYeastExtract5gNaCl10g
2.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
3.滴加5NNaOH约
0.2mL,调节pH值至
7.
04.加去离子水将培养基定容至1L后,加入15gAgar
5.高温高压灭菌后,冷却至60℃左右
6.加入1mlAmpicillin100mg/ml、1mlIPTG24mg/ml、2mlX-Gal20mg/mL后均匀混合
7.铺制平板30~35ml培养基/90mm培养皿
8.4℃避光保存TB/Amp/X-Gal/LPTG平板培养基组份浓度
1.2%W/VTryptone
2.4%W/VYeastExtract
0.4%V/VGly__rol17mMKH2PO472mMK2HPO
40.1mg/mlAmpicillin
0.024mg/mlIPTG
0.04mg/mLX-GaL
1.5%W/VAgar配制量1L配制方法
1.配制磷酸盐缓冲液
0.17MKH2PO4,
0.72MK2HPO4100ml溶解
2.31gKH2PO4和
12.54gK2HPO4于90ml的去离子水中,搅拌溶解后,加去离子水定容至100ml,高温高压灭菌
2.称取下列试剂,置于lL烧杯中Tryptone12gYeastExtract24gGly__rol4ml
3.加入约800ml的去离子水,充分搅拌溶解
4.加去离子水将培养基定容至1L后加入l5gAgar
5.高温高压灭菌后,冷却至60℃左右
6.加入100ml的上述灭菌磷酸盐缓冲液、lmlAmpicillin100mg/ml、1mlIPTG24mg/mL、2mlX-Gal20mg/ml后均匀混合
7.铺制平板30~35ml培养基/90mm培养皿84℃避光保存
六、抗生素的贮存溶液及其工作浓度抗生素贮存液*1工作浓度浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素羧苄青霉素氯霉素卡那霉素链霉素四环素*250mg/ml溶于水-20℃50mg/mL溶于水-20℃34mg/mL溶于乙醇-20℃10mg/mL溶于水-20℃10mg/mL溶于水-20℃5mg/mL溶于乙醇-20℃20µg/ml60µg/ml20µg/ml60µg/ml25µg/mll70µg/mL10µg/ml50µg/ml10µg/ml50µg/ml10µg/ml50µg/mL*1以水为溶剂的抗生素贮存液应通过
0.22µm滤器过滤除菌以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理所有抗生素溶液均应保存于不透光的容器中*2镁离子是四环素的拮抗剂,四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基如LB培养基
七、SDS-PAGE浓缩胶5%Acrylamide配方表各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量1m12m13m14ml5ml6m18m110mLH2O30%Acrylamide
1.0MTris-HClpH
6.810%SDS10%过硫酸铵TEMED.
0.
681.
42.
12.
73.
44.
15.
56.
80.
170.
330.
50.
670.
831.
01.
3170.
130.
250.
380.
50.
630751.0l.
250.
010.
020.
030.
040.
050060.
080.
10.
010.
020.
030.
040.
050.
060.
080.
10.
0010.
0020.
0030.
0040.
0050.
0060.
0080.01
八、SDS-PAGE分离胶配方表各种组份名称各种凝胶体积所对应的各种组份的取样量5m110m115m120ml25m130m140m150ml6%GelH2O30%Acrylamide
1.5MTris-HClpH
8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED8%GelH2O30%Acrylamide
1.5MTris-HClpH8810%SDS10%过硫酸铵TEMED10%GeLH2O30%Acrylamide
1.5MTris+HClpH
8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED12%GeLH2O30%Acrylamide
1.5MTris-HClpH
8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED15%GelH2O30%Acrylamide
1.5MTris-HClpH
8.810%SDS10%过硫酸铵TEMED
2.
65.
37.
010.
613.
215.
921.
226.
51.
02.
0304.
05.
06.
08.
010.
01.
32.
53.
85.
06.
37.
510.
012.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
0.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
0040.
0080.
010.
0040.
0080.
0120.
0150.
020.
0240.
0320.
042.
34.
66.
99.
311.
513.
918.
523.
21.
32.
74.
05.
36.
78.
010.
713.
31.
32.
53.
85.
06.
37.
510.
012.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
0.
050.
10.
15020.
250.
3040.
50.
0030.
0060.
0090.0l
20.
0150.
0180.
0240.
031.
94.
05.
97.
99.
914.
915.
919.
81.
73.
35.
06.
78.
310.
013.
316.
71.
32.
53.
85.
06.
37.
510.
012.
50.
050.
10.
150.
20.
25030.
40.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
0020.
0040.
00600080.
010.
0120.0l
60.
021.
63.
34.
96.
68.
29.
913.
21652.
04.
06.
08.
010.0l
2.
016.
020.
01.
32.
53.
85.
06.
37.
510.
012.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
050.
10150.
20.
250.
30.
40.
50.
0020.
0040.
0060.
0080.
010.
0120.
0160.
021.
12.
33.
44.
65.
76.
99.
211.
52.
55.
07.
510.
012.
515.
020.
025.
01.
32.
53.
85.
06.
37.
510.0l
2.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
050.
10.
150.
20.
250.
30.
40.
50.
0020.
0040.
0060.
0080.
010.
0120.
0160.02。