还剩7页未读,继续阅读
文本内容:
内容摘要各种生物的染色体数目是恒定的,大多数高等动物是二倍体,即每一个细胞含有两组同样的染色体,染色体是显微镜下可见细胞有丝__过程中出现的结构,是遗传物质的载体携带着丰富的遗传信息
[1]在人类,只有__和卵子是单倍体,其他细胞都是双倍体如果一个人类胚胎部分染色体为多倍体,多数不能正常发育,但如果是性染色体是多倍体(XXX或XYY)、三套第21对染色体(唐氏综合症)、三套第18对染色体(爱德华氏症)、三套第13对染色体(巴陶氏症),则有机会长大__
[2]实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法人外周血液中的小淋巴细胞,几乎都在G1期(或G0期),一般情况下是不再__的,当在培养液中加入植物凝血素(PHA)时,这种小淋巴细胞受__转化为淋巴母细胞,使其恢复增殖能力,随后进入有丝__经过短期培养,秋水仙素的处理,低渗和固定,就可获得大量的有丝__细胞,从而进行核型分析通过实验发现,人类每个体细胞有46条染色体,22对常染色体和1对性染色体本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用关键词外周血培养、低渗技术、组型分析引言正常人类染色体的数目为46条23对,_____的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数,将常染色体(22对)按大小用___数字标记,顺次排列为1~22号,性染色体用X和Y标记;并按染色体大小和着丝粒位置,把人类染色体分为七个组,用大写字母A~G表示染色体经显带处理后,每条染色体都显示出其特定的形态特征,根据这些特征,可以对染色体进行组型分析本次实验在操作过程中,主要采用了外周培养技术和低渗技术外周血培养是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素,使纺锤体微管解聚,这样细胞停留在中期,可以获得大量的__细胞用低渗盐溶液(一般是
0.075mol/L的KCl)处理,使其中的红细胞及__相细胞膜和一部分细胞质除去,最后以气干法制片,可获得较好的染色体养基中进行培养人类外周血细胞本来是终末分化细胞,一般没有__能力,但经PHA(植物血球凝集素)或ConA等药物__后,转变成可__的转化细胞通过许多学者的改进和革新,培养基由天然的动物血浆改为合成培养基,促进细胞生长的物质从胎汁改为动物血清,本实验中用的小牛血清体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体,动物细胞的大规模培养,微生物制药技术,基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面
[3]低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入,导致转化的淋巴细胞,染色体进一步分散而利于分析同时,低渗处理还可使红细胞质膜破裂,经后血影浮于上清中被去除,后续的固定过程主要针对淋巴细胞,改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量
[4]
1.实验材料与用品
1.1材料人的外周血淋巴细
1.2实验药品RPMI“1640”培养基肝素秋水仙素植物凝血素PHA硫酸链(蓝季科技发展有限公司,5g,2-8℃保存)青霉素(蓝季科技发展有限公司,
0.8g2-8℃保存)保存吉姆萨染液
0.1mol/L磷酸缓冲液
1.3药品配置以下药品按20人份来配置
1.
3.1RPMI“1640”培养基称取“1640”粉末
0.84g,用80ml的双蒸水溶解,如溶液中出现浑浊或难以溶解时,可用干冰或CO2气体处理,如pH值降至
6.0时,则可溶解而透明每80mL溶液加NaHCO
30.088g,以干冰或CO2气体矫正pH至
7.0--
7.
21.
3.2肝素作为抗凝剂使用称取该粉末mg(126单位/mg),用mL生理盐水溶解,此溶液的浓度为L500单位/mL
[5]
1.
3.3秋水仙素作为有丝__的阻止剂,它能改变细胞质的粘度,抑制细胞__时纺锤体的形成,使细胞__停留在中期称取秋水仙素
0.01g溶于333mL生理盐水中,此时秋水仙素的浓度为30mg/L,置于冰箱4℃保存使用时取该溶液
0.1mL加入5mL的培养物中,其最终浓度为
0.6mg/mL
[6]
1.
3.4植物凝血素(PHA):是淋巴细胞有丝____剂取2支针剂加4mL蒸馏水溶解,每人用
0.2mL
1.
3.5小牛血清
1.
3.6双抗青霉素(每瓶80万单位)、链霉素(每瓶500万单位)以每1mL生理盐水溶解10万单位青霉素来溶解(100万单位=1g)
1.
3.
70.075mol/LKCl溶液:称取KCl粉末
0.56克,用100毫升蒸馏水溶解,终浓度为
0.075摩尔/升
1.
3.8固定液甲醇冰醋酸=
311.
3.
90.9%生理盐水称取
0.9g的氯化钠,溶解于100mL的蒸馏水中
1.4实验用具离心管、培养瓶、试管、试管夹、试管架、吸管、玻璃棒、烧杯、酒精灯、镊子、烧杯、载玻片、pH试纸、毛细吸管、高速冷冻离心机ROTANTA 460R 德国、电子分析天平(梅特勒-托利多仪器__有限公司,AB204-N)、恒温培养箱(青岛海尔特种电冰柜有限公司 ,HRHS24)、显微镜(XS-212-201 JNOEC)、恒温水浴锅(青岛海尔特种电冰柜有限公司,HRHS24)、冰柜(青岛海尔特种电冰柜有限公司,BD-255LTA)
2.实验方法
2.1培养液的分装配置好20人份后,进行分装,每瓶量为培养液(RPMI1)4mLPHA1mL肝素
0.2mL双抗(青霉素加链霉素)
0.05mL培养液中最终浓度各为100单位/mL用
3.5%NaHCO3调pH到
7.2—
7.4分装到20mL的玻瓶中,用瓶盖拧紧,置于0℃条件下保藏用前从冰箱内取出,放入37℃恒温锅中温育10min
2.
1.1采血用碘酒和酒精消毒皮肤,用采血针扎破手指,用毛细吸管吸取血放入培养液中,拧紧瓶盖
2.
1.2培养置37℃温箱内培养66—72h
2.
1.3秋水仙素处理培养终止倩在培养物中加入浓度为40mg/mL的秋水仙素
0.05—
0.1ml,最终浓度为
0.4—
0.8mg/mL,置温箱中处理2—4小时
2.
1.4低渗处理小心地从温箱中取出培养瓶,放入37℃水浴锅中温育10min,用吸管吸弃上清液,培养物沉积在瓶底,然后加入温育的低渗溶液5mL,用吸管轻轻冲打成细胞悬液,装入离心管中,静置20min,使红细胞破碎,白细胞膨胀
2.
1.5离心以1000r/min离心5min,弃去上清液,收集白细胞
2.
1.6固定离心管中加入固定液2—4mL,片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液,在室温中固定15min,离心,弃去上清液,留下白细胞
2.
1.7再固定加入固定液2mL,用滴管轻轻打散,室温下继续固定15min
2.
1.8再离心除去上清液,留下白细胞制片
2.
1.9制片向上述离心管中滴入固定液
0.5mL,用滴管小心冲打成悬液,从冰箱中取出载玻片,每片滴加悬液1—3滴,在酒精灯火焰上微微烤干
2.
1.10染色用磷酸缓冲剂(pH
7.4)稀释后的姬姆萨染色液染色20min(染液不能干)倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗
2.
1.11镜检待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的__相,再用高倍镜观察
3.实验结果分析
3.1实验结果
3.
1.1显微镜下观察到的人外周血淋巴细胞(染色体图)
3.
1.2在显微镜下应该观察到的人体外周血淋巴细胞染色体如下 HYPERLINKhttp://images.google.cn/imgresimgurl=http://www.bbioo.com/bio101/UploadFiles/200804/
2008042121495284.jpgimgrefurl=http://www.bbioo.com/bio101/2008/21436_
3.htmusg=__0p5hexpv9b7smAWUtgxsNenELLw=h=518w=600sz=69hl=zh-CNstart=1um=1tbnid=XWJh9JXrRBDsbM:tbnh=117tbnw=135prev=/images%3Fq%3D%25E4%25BA%25BA%25E6%259F%2593%25E8%2589%25B2%25E4%25BD%2593%25E5%259B%25BE%26um%3D1%26hl%3Dzh-CN%26newwindow%3D1%26sa%3DX\t_blankINCLUDEPICTUREhttp://tbn
0.google.cn/imagesq=tbn:XWJh9JXrRBDsbM:\*MERGEFORMAT
3.2分析及讨论
3.
2.1培养成功的关键首先,在实验前,要根据实验人数与实验指导书中所给的用量配置计算好所需用量,计算好后最好参考历年的实验数据进行比较,得到正确的数据其次,在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要如果在培养人的外周血淋巴细胞时没有保证适宜的温度(
36.5℃~
37.5℃)的话,则有些细胞可能不会发生有丝__,从而使实验者在显微镜下很难找到良好的有丝__相,进而导致了整个实验的失败那么如何保证pH的准确度,就要在pH试纸上尽量选择跨度比较小的试纸,并且要及时测试,可多测几次,随时掌握培养基酸碱度的变化再次,培养基的保存很关键,若不是马上使用,需放入0℃下保存,防止药品失活
3.
2.2采血及培养的时间采血之前要注意消毒,排除其他因素的干扰而后的培养时间要尽量充分,以便得到充分的淋巴母细胞
3.
2.3低渗液(hypotonicsolution)低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液,渗透压低于__液,与外周血混在一起时,水分迅速进入细胞,使其膨胀,甚至破裂,获得分散良好的染色体__象常见的低渗液水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾(
0.65mol/L)、氯化钾(
0.075mol/L)等低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展,同时可使黏附于染色体的核仁物质散开,以便能在一个平面上观察所有染色体形态
[8]实验室中一般选用
0.075mol/LKCl为低渗液,其优点有
①染色体轮廓清楚,可染色性强,染色时间短
②用于显带染色时能充分显示带型特点低渗处理为37℃,25~30min,以预实验条件为准
3.
2.4Carnoy固定液固定液的重要特性是能迅速穿透细胞,将其固定并维持染色体结构的完整性,还要能够增强染色体的嗜碱性,达到优良染色效果单纯的固定液一般难以达到这些要求,因此在实验中使用两种混合的固定液由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液Carnoy固定液(甲醇∶冰乙酸=3∶1)每次使用前需临时配制,长时间放置影响固定效果,固定时间15min至24h,冰箱、室温均可必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例,冰乙酸比例增加,利于细胞膨胀、染色体铺展,但易导致细胞破裂、染色体散失
[7]
3.
2.5染色体标本质量不佳的原因
[8]如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好,但制成的标本质量不佳时,其原因可能为
[1]秋水仙素处理不当一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系,如果处理时间太短,则标本中的__细胞就少,相反,如果处理时间太长,则标本中的__细胞虽多,但其染色体缩得太短,以致形态特征模糊,不容易观察
[2]低渗处理不当低渗处理细胞时间过长,细胞膜往往过早破裂,以致__细胞或染色体丢失;如果处理时间不足时,细胞膨胀不够,则染色体分散不佳,难以进行染色体计数分析
[3]离心速度不合适如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低,细胞可能被丢失;如果细胞被低渗后离心速度过高,往往使__细胞过早破裂,分散良好的__相丢失,以致制出的标本__相较少或大部分为剩余的分散不好的__相
[4]标本固定不充分如固定液不新鲜,甲醇、冰醋酸的质量不佳,此时染色体形态模糊、不分散,其周围有细胞浆的蓝色背景
[5]载玻片清洗不__玻片有油迹,致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散,且细胞随液体流动而丢失
[6]玻片冷冻不够合适的冰湿玻片,从冰水中拿出时,其表面有一层霜雪如冷冻不够则无此现象,此时细胞难以贴附在载玻片上
[7]滴片的高度不够进行滴片时,载玻片要倾斜45·角,高度要在1m以上才能让细胞足够分散,否则细胞容易重叠,难以看到染色体4结论
4.1核型分析求取的染色体的短臂长,长臂长,绝对长度,相对长度、臂率、着丝点等指数及于人的外周血淋巴细胞核型分析图单个染色体长度×1000染色体的相对长度=22条常染色体长度+1条X染色体长度短臂长度着丝粒指数=×100染色体全长长臂长度(q)臂比率=短臂长度(p)【总染色体长度为该细胞单倍体全部染色体长度(包括性染色体)之和】
4.2常规染色体核型分析每一个体细胞含有两组染色体组,一组来自父方,一组来自母方,用2n表示染色体是遗传物质的载体,存在于__间期细胞的细胞核内人的染色体有23对,其中前22对叫常染色体,男、女性的常染色体都是一样的;余下一对叫性染色体,男性的这对性染色体由一个X染色体和一个Y染色体组成,写成XY;女性的则由两条相同的X染色体组成,写成XX染色体在__以后,纵向并列的两个染色体,往往通过着丝粒连在一起着丝粒在染色体的位置是固定的由于着丝粒位置的不同,可以把染色体分成相等或不等的两臂,造成中间着丝粒,亚中间着丝粒,亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体此外,有的染色体还含有随体和次级缢痕所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型染色体的核型反映了细胞中染色体数量和结构的特征.根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置,将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型表1人染色体组型及其特征组别染色体序号形态,大小着丝点位置次缢痕随体A1~3最大中部着丝粒(1,3)亚中部着丝粒
(2)1号染色体B4~5次大亚中部着丝粒 C6~12X中等亚中部着丝粒 9号染色体D13~15中等近端着丝粒有 E16~18小中部着丝粒亚中部着丝粒16号染色体F19~20次小中部着丝粒 G21~22Y最小近端着丝粒有 下图为人的外周血淋巴细胞染色体组型分析图男(46,XY)人类的染色体组型分析图男(46,XY)5实验注意事项本实验成功的关键在于1接种的血样越新鲜越好,最好是在采血后24h内进行培养,如果不能立刻培养,应置于4℃存放,避免保存时间过久,否则会影响细胞的活力
[6]2人的外周血淋巴细胞培养的最适温度是
36.5℃~
37.5℃,培养液的最适pH是
7.2~
7.4在培养中成败的关键,除了至为重要的PHA的效价外,培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要
[6]3培养过程中如发现血样凝集,可将培养瓶轻轻振荡,使凝块散开,继续放回37℃恒温箱内培养培养结束以后,大部分培养瓶中都含有白色沉淀,少数没有,可能原因是培养液的pH值没有调好,得到的血淋巴细胞不充足4制片过程中,如发现细胞膨胀的不大,细胞膜没有破裂染色体没有凝集在一团伸展不开,可将固定时间延长数小时或过夜同时正确的掌握制片技术5滴片时,要保证载玻片的温度,要先取好细胞悬液再取载玻片,滴片的高度最好偏高可以将细胞打散便于观察滴片以后要用嘴将滴液吹散,防止细胞重叠____
[1]戴灼华,王亚馥,栗翼玫.《遗传学》[M].高等教育出版社
2008.1
[2]刘凌云,薛绍白,柳惠图.《细胞生物学》[M].高等教育出版社2002
[3]薛庆善.《体外培养的原理与技术》[M].北京科学出版社
2001.2-7
[4]D.L斯佩克特R.D.戈德曼L.A.莱因万德.《胞实验指南》[M].2002:1067~1068
[5]郭善利,刘林德.《遗传学实验教程》[M].科学出版社
[6]刘祖洞,江绍慧.《遗传学实验》[M].高等教育出版社
2010.12
[7]王建波.《遗传学实验教程》[M].武汉大学出版社
[8]张贵友.《普通遗传学实验指导》[M].清华大学出版社后记整个实验周期长,操作繁琐,多环节,易受不确定因素干扰,得实验过程中仍存在一些问题,在整个实验过程中,每一步都要认真完成,不然会像多米诺骨牌一样一步影响一步本次实验收获颇多,在培养基配置时,我掌握了PHA和双抗的生理作用,理解了外周培养这一技术,低渗处理时了解了低渗技术,制片时巩固了滴片方法,而后的核型分析,体验了这一分析方法的繁琐,也享受了分析完成的喜悦整个实验中我理解了科研工作的不易,要有足够的耐心与绝对的专注同时,我也发现了自己所学的不足,今后一定在课余时间学习课本有关知识,丰富自己的知识面本实验历时半个多月(约两周时间),在此期间,实验老师给予了我们非常重要的指导和帮助,并且教会了我们很多书本上没有的知识。