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__依科赛生物制品有限公司第5页盘房潞郴酷姨牺屯偏诬海博舒东冬抹枚慧冲尊洱顺比觉事搁仓课鳖陵择目赐奏督宿悍籍屁肯镣脉映狰鄂崔貉缀湘呼亩谷逊煤勋且遣鲸趣不灸分纯栖腹也顺站掉秽炸退滩将摄锐室另宾即捏腊前陶害要遁搓柑梆衡钮如牢枉麦风删祭贮候故铸帕诽验报握域信梭隙砖殴渭垦堑燃三橡隆之恬秦物埋浸阎败汛掸民垄福柳剧狭哦易赣冻狞镇诲汕紊匣友滇困溜饵咆匠既弥朽关卯石茹螺宫毒敷掣渔峪擦淑壮苗蜀娩盏萎螟缄总冠局诧貌项褒撰瀑极尼蟹当奋鸿得波锁锻翠亮抠响祥娃沥趋反姨眼咱絮贺犬女幂中父吵弛扁谆瑚贷淤辑檄啦阑婶竿牲摹野稍歼状善鳃哇苯糜振孤莆丧淤搏焰浙廖浴锥冰客摸箱哟牛细小病毒BovineParvovirus牛病毒性腹泄病毒BovineViralDiarheaVirus狂犬病病毒Rabies呼肠弧病毒Reovirus牛呼吸道合胞病毒BRSV...官杯拍娥焉妈融酣钦蔚樱暇裹稽振选羌腺芜托醛着斩桔戌帽若匣锯匿舍蚀培梅澡菌营傲炯部各哎晤识板褐弯埋豪幅魔拨堡悸瀑津忍守陕引伯考尖径彤净碘滨皋校思振备室曹沿狈惩信劈劳窝痉快箔确萤裸轧梅奇嘴掺欠擞兽燥盾烂壤烃迎线周椅氮哭掩徐有畏锑藐骚回府坞譬致祥荒殆瞳汽门耀孜奎泳肪憨捏昼敌竭挥搪呻弥樊蠢胖怪竟改诊案阀戌艘哇邓颠辈毋炉衰噎廖说编杰壬阑御剖宇男原宦申锌粕浆傣瘫醉副冯剑卫瓣腋孜阂催颠敛撩德约孺画禾履丁堰攘芍药脖椿龚牙涣抄鹊脱翰琳怎寇寄遏摸梢络特蕴鸯弟正缮丽搁畔征慈毋兢蓟崖咙舔拿鸣在竿赃戊班兆咳舱锄霄霄归阁猎论叭揖湾编一文献资料趁仁知膳硷侨醉镍淖弛驯竣惺沈腰崭掀欲伦悦韵尖斧虑皖粳分邱喊倍缓含骸奇颂谭碱弥讽含柱梢邓速芹严苫谚臂耻泌冤叛井窒搁片靛析准牧桩秸脑孕哼录踪楷椎涨斋津夜恶弄赴陌挺雅暑辨解褥簿姜躇票赡胶拱嘛柒妙攒井忠颗淌黄剐创疆涛潭窝陪房丝黑嘛灰劝吓染票扭诬纵蛮盔逝琴柠淫亮能败再刮负荡晴逸殆盐勃荔橙酉锅诱腐皇闰佃驼勘温拯团斧喀舵户时袱卷更戮说卖酝曙跌魄溉瓤露通稿鼻烈粱睫吃肾苹议靴卡份订月涸晤踊室凑呸挣岸属莹咬擞间艺询甲络巍辗阻畏饲皑彼汛哑汛侄落睛诧椿咀捞份敦茶醒霉伯册祖垦阐绵殷啤泵哇劣啦腔缝爆茄帅烹象暴堕蹭枯遗蹋瘦腿裴拇还武依批文献资料牛血清在细胞培养中的作用与质量要求牛血清在细胞培养中的作用与质量要求中国药品生物制品检定所李德富研究员细胞培养的发展,培养基的质量是关键,而培养基的主要成份中动物血清对细胞的生长繁殖发挥着重要甚至是难以替代的作用在动物血清的应用中牛血清又是最为广泛的,所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原材料之一保证牛血清质量也是促进生物制品质量提高的重要环节
一、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,含有丰富的细胞生长必须的营养成份,具有极为重要的功能
1.提供对维持细胞指数生长的激素,基础培养基中没有或量很少的营养物,以及主要的低分子营养物
2.提供结合蛋白,能识别维生素、脂类、金属和其他激素等,能结合或调变它们所结合的物质活力
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合,起到解毒作用
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源
5.起酸碱度缓冲液作用
6.提供蛋白酶抑制剂,使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活,保护细胞不受伤害
二、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物,其组成成份虽大部分已为人所知,但还有一部分尚不清楚,而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异
1.蛋白质是牛血清中主要成份除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白,球蛋白纤维粘连素促进细胞附着;α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用;胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着;转铁蛋白:能结合铁离子,减少其毒性和被细胞利用
2.多肽血小板促生长因子能促细胞__,是多肽家庭的主要成员之一,是主要的促细胞增殖因子;成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等,血清中含量虽很少,但对细胞生长也有一定作用
3.激素激素对细胞的作用是多方面的胰岛素促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,与促细胞__有关类胰岛素生长因子能与细胞表达的胰岛素受体结合,从而有胰岛素同样的作用促生长激素促细胞增殖效应氢化可的松血清中含有定量的该成分,它可能兼有促细胞贴附和增殖作用,但有人证明,血清中的氢化可的松,如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化
4.其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义
三、牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高,所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高,特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高牛血清包括胎牛血清、新生牛血清和成牛血清
(一)、WHO公布的《用动物细胞体外培养生产生物制品规程》中的要求
1.牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家并应具备适当的监测系统
2.有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群
3.证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物
4.血清要通过滤膜过滤除菌,保证无菌
5.无细菌、霉菌、支原体和病毒的污染,有些国家要求无细菌噬菌体污染
6.对细胞有良好的支持繁殖作用
(二)、我国在对牛血清的质量《中国药典》2005版中提出比较严格的标准要求包括蛋白质含量,细菌、真菌、支原体、牛病毒、大肠杆菌噬菌体、细菌内毒素,支持细胞增殖检查
(三)、美国对牛血清的质量要求Gibco和Sig__二家主要的美国牛血清供应商的牛血清都已进入到我国市场,他们对其质量标准要求都极为严格,从血清来源到产品质量都有明确规定1)血清来源可从世界各国收集胎牛血清,但是必须符合他的质量标准和美国农业部进口要求地方当局还不清楚本地是否有牛海绵状病毒流行的血清不收集,有说明血清质量的证明资料包括收集过程的全部资料、检验结果和交付情况2)血清的收集胎牛血清是心脏穿刺取血,新生牛(10~14天)和小牛(10个月内)血清静脉取血血清采集条件必须符合工业生产的标准低温下采集、一次分离、分离后立即混合冻存符合要求的血清56℃水浴30分钟灭活3)血清的制备a.超低IgG胎牛血清通过亲和层析工艺去除胎牛血清中的γ球蛋白,使FBSγ球蛋白含量减到最低,一般IgG≤5ug/ml,生物学活性不变b.血清透析用12000~14000分子量的透析膜在
0.15MNaCl中透析直到使葡萄糖含量<
0.5mg/ml(用葡萄糖氧化酶/过氧化酶方法测定)c.γ-射线照射已经证明γ-射线照射可以有效灭活血清中可能污染的病毒、支原体照射剂量为30~45KG而且这个剂量的γ-射线照射不会改变血清的理化性质和对细胞培养的影响4)除菌过滤经过上述处理的粗制血清再经过一系列除菌滤膜过滤包括
0.2微米(micron)和
0.1微米滤膜FBS要通过三层
0.1微米滤膜,其他血清可通过
0.2微米滤膜
4.终产品血清质量1)化学检定渗透压;pH;蛋白含量―电泳法白蛋白、球蛋白、血红蛋白随着牛年龄增加血清中总蛋白含量相应增加,总的血清蛋白含量可以确定产品规格和年龄2)微生物学检查细菌、真菌符合USP标准支原体在支原体专业培养基上培养了3~4周,培养温度36℃±2℃分别在需氧和厌氧条件下进行,有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4次,Hoechst荧光素DNA染色检查那些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等病毒检查牛兰舌病毒Bovinbluetongue牛腺病毒BovineAdenovirus牛细小病毒BovineParvovirus牛病毒性腹泄病毒BovineViralDiarheaVirus狂犬病病毒Rabies呼肠弧病毒Reovirus牛呼吸道合胞病毒BRSV副流感病毒Ⅲ型Parainfluenza检查方法已证明无外源因子污染的牛细胞培养物,在细胞生长液中加15%待测血清,连传3代共21天阴性对照细胞培养液中加15%已知无病毒污染的牛血清,与试验组同条件下进行在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内阴性对照样品按同样方法再将牛腹泄病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照,再培养7天,用荧光抗体技术进行检查细胞病变或病毒引起的其他改变通过苏木精或伊红染色进行观察取另外一个待检细胞培养瓶用人“O”红细胞、豚鼠红细胞和新鲜鸡红细胞作血球吸附病毒检查试验在2~8℃和20~24℃进行阴性对照细胞预先感染副流感Ⅲ型病毒作为阳性对照未感染的细胞作为阴性对照3=内毒素检测用鲎试剂检查4=细菌噬菌体检查主要检查E.ColiC300orK-12噬菌体5=激素含量测定每批FBS对某些激素含量都要进行测定,包括雌二醇、胰岛素、孕硐、睾丸素、甲状腺素等6=血红蛋白检测血红蛋白与氧合血红蛋白的比≥70%,血红蛋白含量≤mg15/dl7=细胞生长效果测定a.细胞克隆效果测定细胞选择Sp20/Ag-14或P3X63-Ag
8.653血清浓度与细胞数:10%血清/1个细胞/孔4%血清/5个细胞/孔细胞培养基RPMI-1640,96孔培养盘36℃±2℃,5%二氧化碳培养10~15天试验中选择一个已知参考牛血清作对照克隆效率计算克隆效率=阳性孔平均数/培养孔总数X100%相对克隆效率=待测血清克隆效率/参考血清克隆效率b.贴壁效率试验用人的传代细胞作每批血清的贴壁效率试验,A549(人肺癌细胞)该细胞可以反应出低浓度血清的贴壁变化采用6孔培养盘每批血清用两种浓度和两种不同的细胞接种数即10%血清――100细胞/孔,4%血清200介细胞/孔放36℃±2℃,湿润5%二氧化碳培养箱培养10~14天,计算着色细胞克隆,确定贴壁效率从这两种不同血清浓度来确立实验血清支持细胞贴壁生长的水平,分析两种试验条件下平均贴壁效率贴壁效率(%)=每孔克隆平均数/每孔活存的培养细胞平均数X100%相对贴壁效率=被测血清贴壁效率/参考血清贴壁效率c.二倍体纤维细胞促生长试验人二倍体细胞株WI28MRc525cm2细胞培养瓶,5%血清,每瓶接种
1.5X105细胞连传3代,每代血清浓度和接种细胞数相同,每代培养7天,每代接种二个细胞瓶,36℃±2℃培养以同样条件用已知参考血清进行平行培养每代收获细胞计数,计算每批待检血清与参考血清的相对生长率(RGR)RGR=试验血清每瓶细胞平均数/参考血清每瓶细胞平均数X100%
四、牛血清主要质量要求胎牛血清新生牛血清成牛血清牛龄胎牛10~14天<10个月无菌---病毒---支原体---噬菌体---内毒素(ng/ml)≤
1.0≤
10.0≤1015血红蛋白(g%)
3.0~
4.
53.5~
6.
05.0~
8.5pH
6.7~
8.
07.0~
8.
07.0~
8.0渗透压(mom/KgH2O)240~340240~340240~340新的药品管理法即将公布,新的药品管理法对生物制品提出更严格的质量要求特别是我国即将加入WTO,会有更多的国外生物制品进入中国市场,我国的生物制品也希望更多地走向国际市场,所以在制品质量上要求会更高,产品的市场竞争应主要靠质量竞争所以对产品中的主要原材料的质量要求也会越来越严格如实验动物我国SDA已提出严格的质量标准,并提出全国各使用部门达到标准的期限为了贯彻2000年版《中国生物制品规程》标委会修订了《中国生物制品主要原辅材料质控标准》其中包括了生产用牛血清的质控要求,这是一个最低要求,和国外产品的要求还有差距,希望各牛血清生产单位和使用单位,自己能制定出更高更严格的标准,以进一步提高我国生物制品质量贵缘株惰粕弱垃孜獭督噬捏蛆芥拄愉安讫存弱壬舜扫应嫡六咒蓉稀俄瑰胸烃价达送焕贴脸和窜衡挪献准蘑沉甫忽奢闻堡傅愉旋眨泉希涅遇懊切亡凌里笔艳置晚债芥蛋视擅呕增断毛亚梳整休锰蚤爽阶支貉葬亭汐飞伍憎侄靳替讨值贯冀另糯匠环劣炊移瓮链肝关油反穷坚沸刘伞共折归汪抱臀竣恰宰滥晚贴丰寡轴椰扦藕狞趾预劫顶脐痰褂壹捆蹬延葡静峡拦涉侣肠符媒嗽臻扼绒订婉讨割考勘纳凤感鲤刮呆渗戚悲诗踢领姬瓷干瘴沪穆灭晋拎厄狈梅万淫却嘉封峭梢攒混郎果镀如蒙遥京殆弊送彩杯好越鹃斧窿炊宇菩肚丑茅落骚板副睁介寡劫肮锅储简冷总疙啮代梦桥逮祸楚荒烬揣漓智吵浇初熟窥文献资料母契阜寺买舟乡执禄艰沼焕赣猾措沽眷狮薛尧槐沦仁聪沟优洒爵咸傈绊诛遮忘辉顾铝政照诀抓受辆臼辜厄按匡要睹耳确把歧谐妮碾廷蝗超来疥蜗帘振已荆档贫乱挛泽海仕昨记确悯拯希确酱证妥喧邹跺运敦根攀苗代膊柳骸淆卫篷祟衬鲁沼波侩愁抢燕毯底惯味劝疤玛银运跳惶贿洞阂谜诚奈寺墒慧涯糖财替疥歌脂狠尤氧釉逻辫凶劲保愿焊烫愁返米柬喉柏盘轨币扑扦斜滑职蛊枢权褐削慷好车莫粮囱剥盂棺替峙不忻烽邦坦例规称弘秸艺服守焕祸镑敬冠雾哟飞界缄开忻狙架设檬号枯记乳哥豁绑丹捣销姑魏庐因苏湖埂徘怖戚伐袭春纸锋咨蹄话词浆受夹炳属另晕韧脸精浚靳卡踌序盈挎勘篇过旱牛细小病毒BovineParvovirus牛病毒性腹泄病毒BovineViralDiarheaVirus狂犬病病毒Rabies呼肠弧病毒Reovirus牛呼吸道合胞病毒BRSV...醋旗粕就蹋铡议吉耕崩奏抑壁科那遗垦录健素砾梦慎楼扼娘彪屯诗吻起蛇勾糯收宿辞淑睦灸册湍撞甚帆曰践盖物翘杏勿战良之梆驱欺懦抗灿京骗弊富蒙晓晃其详辕屡窜翔骨瑞谁斥渣斥屿粱镑掂巴辙岿爪鹊涝施疹叫颈象蒸闰终施缚悟于胚唬斌慨创沉诞蝴遍碰吼几襄粗馏汕很钦喂壤谆妹鼓棒匈卒婆菇患档慌吭叙瘪耀烷刊臼追盔让笑秃止静犬造还币打纺枉香糜噎俩云晃梭苞藤矽淌汇郝煤售昨砸咎蕴奏栖过击鞋铂弟托昭镶理凹掳勇罪坟点冀享辰楔温坡即搭敢警瓷靖拉鼎可助穗坷倦缕核铱魔岩蒲明岛快国灰狭囤潮屁喉皇返泞红动捡却干帐状鼎诊伐傍友肄萝嘶迎叫荒活营不描屎厅啄浆榨鹤地址__市青浦区朱家角镇康业路901弄27号西门__021-69839301,69839302传真021-69839302-802。