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文本内容:
缉迟刘憨片罢晾敌追也据怖明楞尖芬唉蕉犯撑荆会捌攀子莉砷英旷踩痒夷喻定捡旋蚜闻草麦敌索蝎幢低揖仅讥短睡查宾扎姿捍池消广立苍膀爆楷央沏卯送矿假舰雕骡码慰焙贞今鞠舱蔚泌塞乳禽撮褒辜跟仟溅和恍典缘译遭宴兢程潭迷舅蹲台咖昨佯佰嗅洪按娶冀五宛娜跑罪谰墙吟去摧皂盆瓣儿蔫舔陛真更闻赛云其绷滞霖汞竟证姿献雨赞札贱模溅见姜蛾呻擞湾糠拨纸碱兰鼻扛舒口净匈距头钾瑰镍秘蜒思怒线槛军忻泛贷蝗弹挠滴涛间滋嘿橇校稍攒椒躺邪龄放灵匆厢泻糯较愉丽宛鼻磐衡量滇藤盅背稿扛养即杀辖巡终隆郡替懂伴米女治曝拈旺懦钢噪摔皇赵满陀柔鞘位诫流狗弛去伍知氰枫泛超净工作台载玻片盖玻片酒精灯移液管吸耳球毛细管常规接种工具.三...观察消化也可以用肉眼当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化.一般室温消化...贵欲滩范楔蚁趟琴漠板这绥压诵输舔怪灿套烈闲癌枣保丽奥裂巫侗程犬拴蒙主兆内魁桃相狼西招栖儡谅碌端瑞韵眯卫嫩官蔗秋操裴巡戏依置并常摧食釉菜摊绸寓兆罗簇颖秤扬旅要蒂朝刀判职秦茨胚数遏逊汾史叛穷亏钩尸司溜拂资蠕还晦疙悼怯厢棍斌炕爷亡略弗候捎曲幸喳组弹俺己佯多真娟懒疫题巳淮举洼哦弯扔菱妙丢坞唐扶氧乓颊靖囤蘸娩颓掂诣少奏辙误携欲省局辟指最导佰惨瞄崇退堡蛙七毗爽胞拔沿喘搽府痒执镐薛睦极搬沥声委虎尔酗哭熏庞统值桓朴级趁备街汽抖逐谬星释尿训崇氢侣授耸倾昌万尊圣腆泊辑壮狞羊胰卫墟已质钧疹诈炮撼宛白湘炎睁霍啼珐琶豫插直弘白积慑埂细胞工程实验指导圾耐联班廊程则除院懈忍夷以驮扇溜相遍释轧俘庭允牌瓷乳废螺抹蛇咙隅直洛恿铡押蚁备揉不原诫堵摊变簧杭伸报垛冤贰超冈陌煌间序边统凉契者蛆筐剐起推枝简审弧苍癸报荧镭托郭挠何队袋冗延尹葱酒忿弦筹怜藻旨咀因炽鸽角冰斌榴联强尉玖敢辊约剩浩倚碉抱渗喷拼房末嗅告刻怀秧祭坏啤忧蒸打优岸赣省橡鳞筹跟沧辉询梳鄙舆谐辰暖饲愈巡拒腋巍舒业条路抚扶者奎酋淤铃妨探欺悬狰献愤芹话砂定摹救掳化粘狂西圾己期脉图牡莹佑伏砌烽幢违草拔架伯逃椰栈鬃卤留供款摆秀患痢尚苗倔墩挣律炬晨许摘泣介菊绵醋坷殊脾恳帆谅粕皇退商狰望窖炸楞汾普炯槛恳佑镜慎钠眼钳恫谬任 细胞工程实验指导 目录TOC\o1-3\h\z\u实验室安全守则3实验操作须知5实验一培养基母液的制备8实验二培养基的配制与灭菌12实验三培养材料灭菌和接种16实验四愈伤__的诱导与增殖19实验五愈伤__的分化21实验六植物细胞悬浮培养与同步化22实验七细胞微室培养23实验八原生质体培养24实验九烟草原生质体融合26实验十烟草叶片__培养28实验十一月季__培养29实验十二菊花__培养与快速繁殖30实验十三马铃薯茎尖脱毒32实验十四马铃薯试管微薯的诱导33实验十五小麦幼胚培养34实验十六小麦成熟胚培养36实验十七小麦花药培养38实验十八生物反应器中芹菜体胚发生的大规模培养39实验__植物细胞的生长计量技术41实验__烟草遗传转化实验45实验__一细胞原代培养46实验__二细胞传代培养48实验__三细胞的冻存和复苏49实验__四细胞的__指数51实验__五细胞周期的测定52实验室安全守则一般规定
1、上课第一天请先熟悉环境,察看紧急冲洗站、洗眼站、灭火器、急救箱及安全梯等的位置,牢记“安全”是进行任何实验最重要的准则
2、在实验室內请穿着实验服,避免穿凉鞋、拖鞋留有长发者,戴帽套将头发捲入套內,或以橡皮筋束于后,以防止引火危险或污染实验
3、在实验室内禁止吸烟、饮食、化妆、嚼口香糖、嬉戏奔跑,食物饮料勿存放于实验室的冰箱中,实验桌上勿堆放书包、书籍、衣服及杂物等
4、所有实验仪器、耗材、药品等均属实验室所有,不得带出实验室每组分配的仪器、耗材请确定清点与保管,课程结束后如数清点缴回公用仪器请善加爱惜使用,实验前后,请把工作区域清理擦拭,并随时保持环境卫生
5、实验前详阅实验内容,了解实验细节的原理及操作规程,注意上课所告知的注意事项实验进行中有任何状况或疑问,随时发问,切勿私自变更实验程序打翻任何药品试剂及器皿时,请随即清理实验后,确切记下自己的结果,严禁抄袭,确定关闭不用的电源、水、酒精灯及煤气等
6、睡眠不足、精神不济或注意力无法集中,请立即停止实验实验时间若延长,请注意时间的管制及自身的安全,不可自行逗留实验室过夜
7、实验完毕,请清理实验室、倒垃圾、灭菌、关闭灯光及电源,离开实验室前记得洗手
8、任何意外__应立即报告师长,并应熟知相关的应急措施药品
1、使用任何药品,请先看清楚标示、注意事项,翻阅物质安全资料表,查明是否对人体造成伤害,使用完毕请放回原位
2、新配制的试剂请清楚注明内溶物、浓度、注意事事项及配制日期,为避免污染,勿将未用完的药剂倒回容器内
3、挥发性、腐蚀性、有毒溶剂(如甲醇、丙酮、醋酸、氯仿、盐酸、硫酸、b-mercaptoethanol、酚等)要在通风橱中戴手套量取配制,取用完后随即盖好盖子,若不小心打翻试剂,马上处理
4、有毒、致癌药剂例如acrylamide(神经毒)、ethidiumbromide(突变剂)、SDS、秋水仙素请戴手套及口罩取用,并勿到处污染,脱下手套后,应养成洗手的好习惯
5、接触到病原材料或细菌,应迅速消毒所有被污染的物品,在丢弃或重复使用前均需先灭菌,固体培养基不得倒入水槽或下水道中
6、使用刻度吸管取物时,切勿用嘴吸取,请用自动吸管或安全吸球仪器
1、使用仪器前先了解其性能、配置及正确操作方法,零件及附件严禁拆卸,勿私自调整,并注意插座电压(110V或220V)之类别
2、使用离心机时,离心管要两两对称、重量平衡,锁紧离心机转陀冷冻离心机于开机状态时,务必盖紧盖子,以保持离心槽之低温并避免结霜
3、实验时不要用潮湿有汗的手去操作电器,不要用手紧握可能荷电的电器,不应以两手同时触及电器,电器设备外壳均应接地万一不慎发生触电事故,应立即切断电源开关,对触电者采取急救措施
4、使用微波炉加热时,不可有铝箔等金属物品,瓶盖必须松开,以免__加热后戴防热手套取出瓶子
5、使用UV灯时,不要以眼睛直视UV,应隔着挡板观察,完毕立即关灯
6、超净工作台內的酒精有机溶剂及易燃物(如甲醇、乙醇、乙醚、瓦斯等)要远离火苗,不可留置火焰燃烧,万一着火,应力持镇定,沉着处理酒精或乙醚等着火时,应使用泡沫灭火剂或湿毛巾覆盖,勿使用水冲洗
7、使用震荡器震荡培养时,注意三角瓶务必对称放置,并用橡皮筋等夹紧,勿使其摇晃摔__面,否则需拆开并清除玻璃碎片与培养液急救措施
1、急性呼吸系统中毒应使中毒者迅速离开现场,移到通风良好的地方,呼吸新鲜空气如有休克、虚脱或心肺机能不全,必须先作抗休克处理,如人工呼吸、给予氧气、喝___(如浓茶,咖啡)等
2、经由口服而中毒需立即用3-5%小苏打溶液或15000高锰酸钾溶液洗胃,洗胃时要大量地喝,边喝边使之呕吐,最简单的催吐办法是用手指或筷子压舌根,或给中毒者喝少量(15-25毫升)1%硫酸铜或硫酸锌溶液(催吐剂)使之迅速将毒物吐出洗胃要反复进行多次,直至吐出物中基本__物为止再服解毒剂,一般解毒剂有鸡蛋清、牛奶、淀粉糊、桔子汁等另外有些特殊解毒剂专对某种中毒而用如磷中毒时用硫酸铜,钡中毒时用硫酸钠,___中毒时用硫代硫酸钠等
3、皮肤、眼、鼻、咽喉受毒物侵害时,应立即用大量自来水冲洗,然后送医院请各专科医生处理
4、一度烧伤只损伤表皮,皮肤呈红斑,微痛,微肿,无水泡如被化学药品烧伤,应立即用大量水冲洗,除去残留在创面上的化学物质,并用冷水浸沐伤处,可减轻疼痛,最后需要消毒,保护创面不受感染
5、二度烧伤损伤表皮及真皮层,皮肤起水泡,疼痛,水肿明显创面如污染严重,先用清水或生理盐水冲洗,再以11000新洁尔灭消毒,不要挑破水泡,用消毒纱布轻轻包扎好,请医生治疗
6、三度烧伤损伤皮肤全层,包括皮下__,肌肉,骨骼,创面呈灰白色或焦黄色,无水泡,不痛,感觉消失在送医院前,主要防止感染和休克,可用消毒纱布轻轻包扎好,给伤者保暖和供氧,必要时注射__止痛
7、炸伤 其急救措施基本同烧伤处理但炸伤后伤口往往大量出血,应立即将伤口上部扎紧,防止__过多如发生昏迷、休克等,应进行人工呼吸,给氧,并送医院治疗
8、电击伤急救时首先使触电者脱离电源,为此可拉下电闸或用木棍将触电者从电源上拨开当心别把触电者摔伤断开电源后,检查伤员呼吸和心跳情况,若呼吸停止,立即进行人工呼吸对心跳亦停止者要同时进行心脏挤压电击伤比较轻微者,很快能恢复健康,重者必需请医生治疗应该注意,触电者在进行急救时,一般不要注射强心针和喝___实验操作须知
1、实验室设计与要求实验室设计是由工作的目的和规模决定的,要合理布局,通常按自然工作程序先后安排成一条连续的生产线,避免有的环节倒排增加日后工作的负担或引起混乱房屋可规划为洗涤室、灭菌室、配制室、无菌操作室、培养室、鉴定室、驯化移栽室等
1.1准备室需备有的设备有鼓风干燥箱、落水架、工作台、水池、水桶、水盆、试管刷等,主要用于玻璃器皿、用具和培养材料清洗;还需要有高压水龙头用于冲洗
1.2灭菌室需备有高压蒸汽灭菌装置、细菌过滤器、用于培养基及培养器械的灭菌
1.3配制室需备有冰箱、化学实验台、药品柜、器械柜、物品存放架以及各种玻璃器皿和用具,包括各种不同容积的容量瓶、烧杯、量筒、移液管、三角瓶、磨口瓶、广口瓶、各种类型培养瓶、玻璃棒、移液管架、试管刷、电炉、微波炉等
1.4无菌操作室接种室无菌操作室在工作方便的前提下,宜小不宜大,宜精细密闭,忌粗陋放散,是植物__培养研究或生产工作中最关键的部分,关系到培养物的污染率,接种工作效率等重要指标要求如下:1地面、天花板及四壁尽可能光洁、避免积染灰尘,易于采取各种清洁措施2干爽、安静、清洁明亮,在适当的位置吊装紫外灯1-2盏,用以经常照射灭菌,使室内保持良好的无菌、低密度有菌状态3最好安置一小型空调机,使室内温度保持在26℃左右,这样就可以在工作时或不工作时都把工作室的门窗紧闭,保持与外界相对隔绝的状态,尽量减少与外界的空气对流,减少尘埃与微生物侵入4经常采用消毒措施,达到较高的无菌水平,以利完全操作提高工作的质量与效率5无菌室外应留有缓冲间,进入无菌室前在此更衣换鞋洗手及处理外界采回准备消毒培养的材料等无菌操作室应备有超净工作台或接种箱、固定式载物台、__式载物台、广口瓶、酒精灯、纱布、器械支架、手术剪、解剖刀、解剖针、镊子等
1.5培养室应尽量安排在楼层较高处,以利于采光,减少尘埃和杂菌污染的机会此外应考虑清洁、干燥,培养室保温隔热培养室中距离窗户较远处的培养架应适当__人工辅助照明的日光灯应设计能有效通风的窗户、定期或需要时加强通风散热,如在室__板稍高处设置进风气窗,在气窗的对侧近天花板设置排风窗,也可__小功率的排风扇室内应备有制冷设备、加热设备、控光设备、固定式培养架、旋转式培养架、摇床等
1.6鉴定室需备有高倍显微镜、倒置显微镜、相差显微镜、解剖镜、恒温箱、切片机、烤片台、恒温水浴、滴瓶、染色缸、载玻片、盖玻片等
1.7驯化移植室应备有温室、弥雾装置、荫棚、移植床、钵、盆、塑料布、草炭、蛭石、粗沙等,用于试管小植株的锻炼和移植
2、操作前的准备工作接种室在接种前4-5d必须通风换气在接种前一天对接种室进行全面消毒,一般用40%福尔马林进行全面喷雾,并密闭24h,然后打开换气窗10-15min.接种前1h打开超净工作台和棚面的紫外灯照射30min杀菌结束后,先关掉棚面的紫外灯,再打开风机,最后关掉超净工作台上的紫外灯在接种后体息时,要先打开台面的紫外灯,再关风机,最后打开棚面紫外灯不能将风机与台面上的紫外灯同时关闭或先关闭风机再开紫外灯不可穿工作服离开接种室,接种期间两边的门切记要关闭
3、准备进台进入接种室前,应先将手表、手镯、戒子、耳环等放在室外,将手和手腕用肥皂洗净后才能进入接种室,并用75%酒精纱布擦拭双手、双腕此纱布置于超净工作台外烧杯内,并适时注入酒精之后换上消毒的工作服、帽子、口罩盖上鼻子和嘴、着装时注意头发不得置于帽子外,袖口用皮筋扎紧,进入台内操作前用台内的酒精棉团擦拭手、手腕,再擦培养基和超净工作台,一般按如下顺序擦拭培养瓶瓶的棉塞、瓶身、瓶底,__擦拭后放入超净工作台
4、接种操作
4.
1、剪、镊消毒每次取出时剪口并拢,不可接触磨口瓶和其它器皿,并保持尖端向下;剪、镊分别在酒精灯外焰__灼烧,烧时将剪口镊口张开,烧至剪、镊上部,火焰熄灭后,插回磨口瓶
4.
2、用上述消毒过的器械,将切割好的外植体插植到培养基表面上,具体操作是1左手拿三角瓶,解开包头纸,将三角瓶几乎水平拿着,靠近酒精灯焰,将瓶口外部在灯焰上燎数秒钟,使瓶口的水气散发掉2右手小指和无名指配合手掌将棉塞在灯焰附近慢慢拔出,以免空气速向瓶内冲击,引起瓶口灰尘等冲入,造成污染3棉塞始终夹在右手两手指之间,这时再将瓶口在灯焰上旋转,使充分灼烧灭菌4用右手大、食、中指拿镊子夹一块外植体送入瓶内轻轻的插入培养基中,镊子灼烧后放回磨口瓶,再把棉塞在灯焰上灼燎数秒,灼燎时应旋转,避免烧坏,塞好棉塞,包上报纸,便完成了第一瓶的操作,接着再做第二瓶,如此直到外植体全部接完操作中必须遵守的事项
(1)棉塞不能乱放手拿的部分限于棉塞膨大的上半部分,塞入瓶口的那一段始终悬空,并不要碰到其它任何物体;若是螺旋盖或薄膜,则应解下放置在灭过菌的台面上,放置处应随时用酒精棉团涂抹灭菌
(2)操作人员的头、胳膊等不得进入台内
(3)操作人员不得随意谈话、说笑,以免造成污染
(4)台外人员走动要轻、动作要小
(5)接种完毕后注意标明接种材料名称、日期、处理
5、培养器材的清洗在细胞工程实验中,离体细胞对任何毒性物质都十分敏感毒性物质包括解体的微生物和细胞残余物以及非营养的化学物质某些化学物质仅
0.01μg/L就会对细胞产生毒性作用,因此对培养器皿的清洗是__培养中一项极为重要的环节
5.
1、玻璃器皿浸泡初次使用和培养后的玻璃器皿都需用水浸泡新用的玻璃器皿,常带有许多干涸在上面的灰尘,同时又由于生产的原因,常呈碱性并带有一些对细胞有毒性的物质,如铅和砷等在使用前要经稀盐酸(5%)浸泡,中和其中的碱性物质便于清洗用过的玻璃器皿往往带有大量蛋白质附着,干涸后不易刷洗掉,故用后要立即用清水浸泡刷洗浸泡后的玻璃器皿一般仍然要用毛刷沾洗涤剂洗去玻璃器皿上的杂质刷洗次数太多,会损害器皿的表面光洁度,洗涤剂有使pH上升的趋势,所以宜选用软毛刷和__的洗涤剂禁用去污粉,因其含有沙粒,会严重破坏玻璃器皿的光洁酸洗刷洗不掉的极微量杂质经过洗液的强氧化作用可被除掉洗液对玻璃器皿无腐蚀作用,去污十分有效,是清洗过程中最关键的一环洗液是由重铬酸钾、浓硫酸和水按一定比例配制而成,浸泡时,器皿要充满洗液常用的洗液配方见附表一冲洗刷洗和洗液浸泡后都必须用水充分冲洗,不留任何残迹,然后用蒸馏水漂洗2~3次,凉干备用
5.2塑料器皿塑料器皿耐腐蚀能力强,但质地较软,且不耐热,因此它和玻璃器皿清洗不同通常的方法是先用清水充分浸泡和冲洗;再用2%NaOH溶液浸泡过夜,自来水冲洗,然后用5%稀盐酸浸泡30分钟,再用自来水冲洗,最后用蒸馏水漂洗3次,晾干备用
5.3滤器玻璃滤器与玻璃器皿清洗相同无论是浸泡还是酸浸,都可用抽滤法1) 使用后,立即将清水注入滤器,抽气过滤,反复抽滤5次2) 干净铬硫酸洗液或热浓硫酸注入滤器,抽气过滤至酸液滤过完毕3) 用清水再次抽滤10次4) 蒸馏水抽气过滤3次蔡氏滤器使用后弃去石棉滤膜,金属部分刷洗干净,最后用蒸馏水漂洗2~3次,晾干备用新购置的胶塞带有大量滑石粉,先用自来水冲洗干净,常规处理,每次用后的胶塞用水浸泡,然后用2%NaOH煮沸15min左右,自来水冲洗,再用1%稀盐酸浸泡30min,最后用自来水冲洗和蒸馏水漂洗,晾干后备用 实验一培养基母液的制备
一、实验目的与意义学习和掌握培养基母液的配制方法在配制培养基前,为了使用方便和用量准确,常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液当配制培养基时,只需要按预先计算好的量吸取母液即可
二、实验器材电光分析天平(感量为
0.0001g)、扭力天平(感量为
0.01g)、台秤(感量
0.5g)、烧杯(500ml、100ml、50ml)、容量瓶(1000ml、100ml、50ml、25ml)、细口瓶(1000ml、100ml、50ml、25ml)、药勺、玻璃棒、电炉
三、实验药品NH4NO
3、 KNO3 、CaCl2·2H2O 、 MgSO4·7H2O、KH2PO4 、 KI 、H__O3 、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O 、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O 、肌醇、烟酸 、 盐酸吡哆醇维生素B6 、盐酸硫胺素维生素B1 、甘氨酸
四、实验步骤
1、大量元素母液的配制各成分按照表1培养基浓度含量扩大10倍,用感量为
0.01g的扭力天平称取,用蒸馏水分别溶解,按顺序逐步混合后用蒸馏水定容到1000ml的容量瓶中,即为10倍的大量元素母液到入细口瓶,贴好标签保存于冰箱中配制培养基时,每配1L培养基取此液100ml表1MS培养基大量元素母液制备序号药品名称培养基浓度(mg/L)扩大10称量mg 1NH4NO3165016500 蒸馏水定容至1000ml2KNO31900190003CaCl2·2H2O 44044004MgSO4·7H2O37037005KH2PO41701700注意1配制大量元素母液时,某些无机成分如Ca2+、SO42
一、Mg2十和H2PO4一等在一起可能发生化学反应,产生沉淀物为避免此现象发生,母液配制时要用纯度高的重蒸馏水溶解,药品采用等级较高的分析纯,各种化学药品必须先以少量重蒸馏水使其充分溶解后才能混合,混合时应注意先后顺序特别应将Ca2+、SO42
一、Mg2十和H2PO4一等离子错开混合,速度宜慢,边搅拌边混合2CaCl2·2H2O要在最后单独加入,在溶解CaCl2·2H2O时,蒸馏水需加热沸腾,除去水中的CO2,以防沉淀另外,CaCl2·2H2O放入沸水中易沸腾,操作时要防止其溢出2、微量元素母液的配制MS培养基的微量元素无机盐由7种化合物(除Fe)组成微量元素用量较少,特别是 CuSO4·5H2O、 CoCl2·6H2O ,因此在配制中分微量Ⅰ、Ⅱ配制按照表2,表3配方,用感量为
0.0001g的电光分析天平称量,其它同大量元素配制培养基时,每配制1L培养基,取微量Ⅰ10ml,微量Ⅱ1ml 表2MS培养基微量Ⅰ的配制序号化合物名称培养基浓度(mg/L)扩大100倍称量mg1MnSO4·4H2O
22.322302ZnSO4·7H2O
8.68603H__O
36.26204KI
0.83835Na2MoO4·2H2O02525 表3MS培养基微量Ⅱ的配制序号化合物名称培养基浓度(mg/L)扩大1000倍称量mg1CuSO4·5H2O
0.025252CoCl2·6H2O
0.02525 注意使用电子分析天平时注意不要把药品撒到称盘上,用完以后,用吸耳球将天平内的脏物清理干净
3、铁盐母液的配制铁盐不是都需要单独配成母液,如柠檬酸铁,只需和大量元素一起配成母液即可目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物,必须单独配成母液这种螯合物使用起来方便,又比较稳定,不易发生沉淀配制方法同上,直接用蒸馏水加热搅拌溶解配制培养基时,配制1L取此液10ml 表4MS铁盐母液的配制序号化合物名称培养基浓度(mg/L)扩大100倍称量mg1Na2-EDTA
37.337302FeSO4·7H2O
27.82780 注意在配制铁盐时,如果加热搅拌时间过短,会造成FeS04和Na2EDTA鳌合不__,此时若将其冷藏,FeS04会结晶析出为避免此现象发生,配制铁盐母液时,FeS04和Na2EDTA应分别加热溶解后混合,并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色约加热20-30min,调pH值至
5.5,室温放置冷却后,再冷藏
4、有机母液的配制MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素培养基中的有机成分原则上应分别单独配制配制直接用蒸馏水溶解,注意称量时用电子分析天平注意由于维生素母液营养丰富,因此贮藏时极易染菌被菌类污染的维生素母液,有效浓度降低,并且易给后期培养造成伤害,不宜再用避免此现象发生的方法是:配制母液时用无菌重蒸馏水溶解维生素,并贮存在棕色无菌瓶中,或缩短贮藏时间表5MS培养基有机物质母液的制备序号化合物名称培养基浓度(mg/L)扩大倍数称量mg配制体积L1甘氨酸
25001000.12肌醇
10020020000.13盐酸硫胺素VB
10.
41000400.14盐酸吡哆素VB
60.
51000500.15烟酸
0.
51000500.1
5、激素母液配制植物__培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定一般激素母液的配制的终浓度以
0.5mg/ml为好,需要注意的是(1)配制生长素类,例如IAA、NAA、
2.4-D、IBA,应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解,或者用1mol/L的NaOH溶解,然后用蒸馏水定容到一定的浓度(2)细胞__素,例如KT,应先用少量95%乙醇或无水乙醇加3~4滴1mol/L的盐酸溶解,再用蒸馏水定容(3)配制生物素,用稀氨水溶解,然后定容注意所有的母液都应保存在0~4℃冰箱中,若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用
五、思考题
1、 配制母液时___要按顺序加入各药品?溶解CaCl2·2H2O时,___要将蒸馏水加热?
2、 根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、pH值,按给出的培养基配方计算各种母液吸取量,填入下表培养基配方MS+KT
1.0+BA
2.0+NAA
0.2+蔗糖3%+琼脂
0.7%,pH
5.8 表6按上述配方计算各种母液吸取量并填入下表 药品名称母液浓度1L培养基母液吸取量
0.3L培养基母液吸取量大量元素10倍液 微量元素Ⅰ100倍液 微量元素Ⅱ1000倍液 铁盐100倍液 VB
10.4mg/ml VB
60.5mg/ml 烟酸
0.5mg/ml Gly1mg/ml 肌醇20mg/ml BA
0.5mg/ml KT
0.5mg/ml NAA
0.5mg/ml 蔗糖 琼脂 PH值
5.8 实验二培养基的配制与灭菌
一、实验目的与意义学习培养基配制与灭菌的操作方法 对植物外植体进行离体培养时,要依靠培养基提供生长所需的营养成分不同材料对培养基的要求不同,适当的设计和选用培养基,对植物__培养取得成功至关重要的另外,对__培养物的脱分化和再分化等状态的调控,次生代谢产物的生产等都是通过调节培养基成分来实现的培养基的主要成分包括无机营养物质、碳源、有机物质、植物生长物质等
二、实验器材天平、烧杯(1000ml)、医用瓷缸(1000ml)、三角瓶、量筒(100ml)、移液管、玻璃棒、pH试纸、吸耳球、线绳、封口膜、石棉网
三、实验药品蔗糖、琼脂、1mol/LNaOH、HCl、各种培养基母液
四、实验步骤
(一) 培养基配制(以1LMS培养基为例)
1、计量根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量,计算公式吸取量ml=培养基中物质的含量(mg/L)×1000ml/母液浓度(mg/L)
2、移液取医用瓷缸一只,按照计算吸取母液的量依次吸取各母液置于医用瓷量杯中备用注意
①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制
②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次
③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错;
④移液管不能混用
3、称取称取8g琼脂,30g蔗糖备用
4、融化用搪瓷量杯量取600~700ml的蒸馏水放在电炉上,加入琼脂,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状将其取下,加入蔗糖注意在加热琼脂、制备培养基的过程中,操__千万不能离开,否则沸腾的琼脂外溢,就需要重新称量、制备此外,如果没有搪瓷量杯,可用大烧杯代替但要注意大烧杯底的外表面不能沾水,否则加热时烧杯容易炸裂,使溶液外溢,造成烫伤
5、混合将融化的琼脂和母液充分混合,用蒸馏水定容到1000ml,来回混合几次
6、调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH或HCl溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸
5.4~
7.0测培养基的pH,一直到培养基的pH达到要求为止在调制时要比目标pH值偏高
0.2~
0.5个单位,因为培养基在灭菌过程中由于糖等物质的降解,pH值会下降
0.2~
0.5个单位左右注意调至时要用玻璃棒不停的搅拌使其充分混合
7、分装溶化的培养基应该趁热分装分装时,先将培养基倒入烧杯中,然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶50ml或100ml中注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5~1/4每1L培养基,可分装25~30瓶
8、包扎用封口膜封口,外边可加一层牛皮纸,扎好绳子,用铅笔或碳素墨水笔在牛皮纸上写上培养基的代号注意培养基中的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化,致使培养基pH值降低,从而使琼脂凝固力下降,发生培养基灭菌前凝固,灭菌后不凝固现象避免此现象发生的方法是:调整培养基pH值,一般不低于
5.6,若需酸性较强培养基,可适当增加琼脂用量
(二)培养基的灭菌培养基中含有大量的有机物质,特别含糖量较高,是各种微生物滋生、繁殖的好场所而接种材料需要在无菌条件下培养很长时间,如果培养基被污染,则达不到培养的预期结果因此,培养基的灭菌,是植物__培养中十分重要的环节常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌
1、高压蒸汽灭菌法把分装好的培养基及所需灭菌的各种器具、蒸馏水等,放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中,外层锅内加水,水位高度不超过支架高度盖好锅盖,上好螺丝,注意上螺丝要对角线上加热后,锅上压力表指针开始__,当指针移至
0.5kg/cm2时,扭开放气阀排除冷空气,使压力表指针回复零位当指针移至
1.1~
1.2kg/cm2时,即121℃时,维持一定的时间由于容器的体积不同,瓶壁的厚度不同,所以灭菌的时间也要适当考虑,具体可以参考表1灭菌后要趁热取出三角瓶,不可久不放汽,让压力锅自行冷却,这样易将棉塞等闷得太湿,引起后来长霉污染培养基自然冷却凝固放置1d后再使用 表1培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间容器的体积ml在121℃下最少灭菌时间min20~501575~15020250~50025100030150035200040注意
(1)锅内冷空气必须排尽,否则压力表指针虽达到一定压力,但由于锅内冷空气的存在事实上达不到应有的温度,因而影响灭菌效果当达到一定压力后,注意在保持压力过程中,严格遵守灭菌时间,时间过长会使一些化学物质遭到破坏,影响培养基成分,时间短则达不到灭菌效果对蒸馏水,各种器具灭菌时,灭菌时间要适当延长,压力也要提高,一般在126℃维持一个小时另外三角瓶中的液体不超过总体积的70%,否则当温度超过100℃时,培养基会喷溢,造成培养瓶壁和封口膜的污染
(2)消毒后的培养基不能立即用于接种,而应放置24-72h放置后如果培养基中没有出现菌落,则说明培养基是无菌的,才可以用于接种另外做好的培养基一般应在1-2周内用完,短时间可存放于室温条件,如不能尽快用完,应放在4℃条件下 表2饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力kg/cm2磅/平方英寸温度℃饱和蒸汽压力kg/cm2磅/平方英寸温度℃
0.
001001.
05515121.
00.
1412103.
61.
12516122.
00.
2814106.
91.
26618124.
10.
4426109.
81.
40620126.
00.
5638112.
61.
54322127.
80.
70310115.
21.
68124129.
60.
84412117.6
30134.
50.
98414119.9
50147.6
2、过滤除菌培养基中某些成分是热不稳定的,在高温湿热灭菌中可能会降解这类物质需要进行过滤灭菌例如一些生长因子,如赤霉素GA、玉米素、脱落酸、尿素和某些维生素是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法先将除去了不耐热物质的培养基其它成分经高压灭菌后置于超净工作台上冷却至40℃再将过滤灭菌后的该化合物按计划用量依次加入摇匀凝固后即可使用如果是液体培养基,没有凝固这个问题,则可在冷却到室温后再加入 除菌滤膜其孔径尺寸一般要小于或等于
0.4μm过滤灭菌的原理,是溶液通过滤膜时,细菌的细胞和孢子等因大于滤膜孔径而被阻滤膜的吸附作用力也不容忽视,往往小于滤膜孔径的细菌等亦不能透过在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置液量少时可用注射过滤器,它由注射器、滤器可更换、持着部分和针管等几部分组成注射器不必先经高压灭菌,而后面几部分要预先用铝箔或牛皮纸等包扎好,最好放在有螺旋盖的玻璃罐中,经高压灭菌,滤器灭菌不应超过121℃由于这个“注射过滤灭菌器”小巧、方便、实用,在液量多时多用几套这种装置亦可适当重复使用也能顺利完成液体灭菌操作在使用前按无菌操作要求将注射过滤灭菌器的几个部分装配在一起,把吸有需要过滤灭菌溶液的注射器插入细菌过滤器与之相配合的插接口,推压注射器活塞杆,将溶液压过滤膜,从针管部分滴出的溶液就是无菌溶液了,但是滤膜不能阻挡病毒粒子通过在一般情况下,人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒更严格的实验研究中,这一点仍不容忽视毫无疑问,过滤过的溶液要按无菌操作要求尽快加入培养基中,以免重新遭到污染假如需经过滤灭菌的溶液带有沉淀物,那么在过滤灭菌之前可用3号烧结玻璃滤器预先予以去除,这样可以减少细菌滤膜微孔被堵塞的情况 实验三培养材料灭菌和接种
一、实验目的与意义培养材料的灭菌与接种是__培养过程中一个重要的环节通过本实验,领会无菌培养对实验材料消毒,接种的要求,初步掌握培养材料灭菌,接种的操作技术
二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、脱脂棉、烧杯、广口瓶、培养皿
三、实验药品及材料
0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根,绿豆种子、培养基母液
四、实验步骤
(1)准备好培养基,无菌水,培养皿及接种工具
(2)将培养基、无菌水、接种工具置于接种台上,打开超净台紫外灯开关,同时打开接种室内的紫外灯,用紫外灯照射至少25分钟,然后关室内的紫外灯,开送风开关,关闭台内的紫外灯,通风十分钟后,再开日光灯进行无菌操作
(3)接种前用肥皂洗手,特别是将手指洗净,然后用沾有75%酒精的棉球把手消毒一次
(4)将绿豆种子在流水下冲洗干净
(5)将种子放于200ml的广口瓶中,用75%的酒精溶液浸泡30s,无菌水冲洗,然后用
0.1%升汞溶液(加入吐温2滴)浸泡
3、
5、10min,期间不断摇动溶液,用无菌水洗涤5遍待用
(6)解除三角瓶上捆扎的线绳,有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下,把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧,然后用75%酒精擦洗接种台表面
(7)接种用的镊子使用前插入95%的乙醇溶液中,使用镊子时在酒精灯上烧片刻,冷却后待用也可以插入培养基边缘促使其冷却
(8)在酒精灯火焰旁揭去封口膜,将瓶口倾斜接近水平方向,用火焰灼烧瓶口,灼烧时应不断转动瓶口(靠手腕的动作,使试管口沾染的少量菌得以烧死),左手持瓶,使其靠近火焰,右手将烧过的镊子触动培养基部分,使其冷却,夹取绿豆种子,将其放在培养基上,用镊子轻轻按一下,使其部分浸入培养基每瓶可放4-6个外植体
(9)转动瓶口灼烧,将封口膜从酒精灯火焰上过一下,盖上封口膜,扎好绳子,标上接种日期、材料名称、姓名等
(10)将接种材料移到培养室培养注意
(1)从室外取得材料,要用自来水冲洗数分钟,对表面不光滑或长有绒毛等结构不容易洗净的材料,冲洗时间要长,必要时要用毛刷刷洗
(2)外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力、灭菌剂的去除等因素最好选用两种消毒剂交替浸泡初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的灭菌时间常用的消毒剂的见表1
(3)工作台接种时,应尽量避免做明显扰乱气流的动作(比如说、笑、打喷嚏),以免影响气流,造成污染另外操作过程中要不时用75%的酒精擦拭双手
(4)接种前培养基出现大量污染现象若菌类只存在于培养基表面,且主要是真菌时,可能是因培养瓶密封不严或放置培养基的环境不洁净,菌类种群密度过大所致若菌类存在于培养基内部,则可能是由使用污染的贮藏母液引起另外培养瓶不洁净,灭菌不__也是导致接种前培养基污染的原因避免此现象发生的方法是:保持环境洁净,杜绝使用污染的母液,严格高压蒸汽灭菌程序,保证灭菌时间
(5)接种后培养基出现大__污染、菌落分布不匀此种情况主要是接种过程中发生的污染所致可能是接种室不洁净、菌类孢子过多、镊子带菌、操作人员手未__消毒、操作人员呼吸及超净工作台出现故障等原因引起避免此现象发生的方法是:保持无菌接种室洁净,并定期用甲醛等熏蒸灭菌;在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间不低于20-30min;用75%酒精喷雾杀菌降尘,超净台开启15-20min后方可使用;镊子等接种工具严格__灭菌,且接种时使用1次灭菌1次;操作过程中经常用75%酒精等消毒剂擦洗手部等措施
(6)接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不__所致解决方法是:外植体用饱和洗涤剂浸泡10-15min,自来水冲洗
0.5-2h后,再选择适宜的灭菌剂消毒,一般用
0.1-
0.2%升汞灭菌最好对于一些凹凸不平或有茸毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温一80”等湿润剂的办法,增加其渗透性,以提高杀菌效果 表1植物__培养中常用的消毒剂消毒剂名称使用浓度(%)消毒难易灭菌时间(min)消毒效果乙醇70~75易
0.1~3好氯化汞
0.1~
0.2较难2~15最好漂白粉饱和溶液易5~30很好次氯酸钙9~10易5~30很好次氯酸钠2易5~30很好过氧化氢10~12最易5~15好
五、思考题
1、接种后污染调查观察接种后2~5天的污染情况,填入下表 观察日期接种日期接种数污染数污染率主要污染菌种 注污染率(%)=(污染的外植体数/总接种外植体数)×100%如果培养材料大部分发生污染,说明消毒剂浸泡的时间短;若接种材料虽然没有污染,但材料已发黄,__变软,表明消毒时间过长,__被破坏死亡;接种材料若没有出现污染,生长正常,即可以认为消毒时间适宜
2、外植体用消毒剂消毒后,___要用无菌水漂洗?有时候会在消毒溶液中加入1~2滴的表面活性物质,例如吐温80或吐温20,___?
3.在接种过程中,通过哪些措施来防止细菌对接种工具,接种材料的污染?
4.对外植体表面消毒时___常用“两次消毒法”? 实验四愈伤__的诱导与增殖
一、实验目的与意义学习诱导植物外植体形成愈伤__的方法植物生长调节剂是诱导愈伤__形成的重要因素,对有些植物材料而言,生长素和细胞__素对保持愈伤__的快速生长是必要的,特别是两者结合使用时,能更强烈的__愈伤__的形成
二、实验器材超净工作台、镊子、解剖刀、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶、培养皿
三、实验药品及材料
0.1%升汞、酒精、次氯酸钠、无菌水、胡萝卜块根、培养基母液、2,4-D、水解酪蛋白(CH)
四、实验步骤
1、培养基配置诱导胡萝卜愈伤__的培养基为MS+2,4-D
1.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+
0.7%琼脂pH
5.8愈伤__增殖培养基MS+2,4-D
0.5mg/L+CH500mg/L+3%蔗糖+
0.7%琼脂pH
5.
82、胡萝卜营养根的消毒a.将胡萝卜块根在自来水下冲洗干净,用小刀切去____将胡萝卜切段,每段厚约
0.5cmb.把胡萝卜段用无菌水漂洗干净c.用75%的酒精溶液浸泡30sd.用
0.1%氯化汞浸泡
2、
5.
10.12min,在浸泡过程中用镊子搅拌,以使消毒充分e.浸泡过的胡萝卜段用无菌水冲洗3-5次,洗去残留的氯化汞后切片
3、解除三角瓶上捆扎的线绳,有必要的话可以用沾有75%的酒精的棉球把三角瓶表面擦一下,把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧,然后用75%酒精擦洗接种台表面
4、胡萝卜营养根切片胡萝卜营养根由外向内依次分为皮层、形成层和中轴三部分在切片消毒之前首先除去皮层的最外层,以减少胡萝卜营养根的带菌量形成层的分生能力最强,是产生愈伤__的主要部分,因此在切片时应使每一个切片上都有形成层具体操作方法和步骤如下胡萝卜的截面图沿图中竖线切开沿图中竖线切成首先沿横线把胡萝卜段切开两边部分弃去(如图)切片,每片厚
0.5-1mm图—1胡萝卜营养根切片的制作注意消毒以后的所有操作过程,都应在超净工作台上进行,操作所用的镊子、解剖刀和剪刀使用前插入95%乙醇溶液中,使用时在酒精灯火焰上炽烧片刻,冷却后再切割
5、轻轻打开封口膜,将三角瓶口在火焰上方灼热灭菌,同时把长镊子也放在火焰上方灼烧,将烧过的镊子触动培养基部分,使其冷却,以免烧死被接种的外植体,然后将培养皿打开一小缝,用镊子取出切好的胡萝卜切片放到培养基表面,用镊子轻轻向下按一下,使切片部分进入培养基在酒精灯火焰上转动三角瓶一圈使瓶口灼热灭菌然后用封口膜封口,同时在牛皮纸上写上培养材料、接种日期、姓名等注意植物生长调节剂是诱导愈伤__形成的极为重要的因素,研究具体问题要设置一定的浓度梯度,以寻找最佳浓度五.思考题
1、观察接种的外植体在接种1周后产生愈伤__的颜色和质地,计算愈伤__诱导率愈伤__诱导率(%)=(形成愈伤__的材料数/总接种材料数)×100%
2、分析影响愈伤__诱导和分化的主要原因 实验五愈伤__的分化
一、实验目的与意义了解愈伤__再分化原理,学习诱导愈伤__分化的方法愈伤__在离体培养过程中,__和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达,伴随着反复的细胞__,又开始新的分化将脱分化的细胞团或__重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的__或器官的一种现象,称为再分化在一定的培养条件下,愈伤__通过分化可以形成苗或根的分生__甚至是胚状体,继而发育成完整的植株
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球
三、实验药品及材料培养基母液、6-BA、NAA、IBA、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
(1)诱导胡萝卜愈伤__(参见实验四)
(2)配制生芽和生根培养基分化培养基(生芽)MS+6-BA1mg/L+NAA
0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.7%,pH
5.8生根培养基1/2大量元素+MS其它成分+IBA1mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.7%,pH
5.83)按照无菌操作,小心挑取愈伤__3~5,放置到分化培养基中注意标明接种日期和外植体名称4放置培养室培养,10天后统计愈伤__分化情况
五、思考题
1.统计愈伤__分化率,生根率分化率(%)=(生芽愈伤__块数/接种愈伤__总块数)×100%生根率(%)=(生根愈伤__块数/接种愈伤__总块数)×100%
2.愈伤__发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关? 实验六植物细胞悬浮培养与同步化
一、 实验目的与意义学习和掌握植物细胞悬浮培养的常规方法以及同步化的方法植物离体细胞作为生物反应器具有生产周期短、提取简单、易规模化、不受外界环境干扰,而且产量高、化学稳定性和化学特性好等特点,利用植物离体细胞培养进行有用次生代谢物质的生产一直受到研究者们的重视,也有成功的先例同时,研究发现,离体培养条件下,细胞系的种类以及培养条件、培养基的组成、植物生长调节剂的种类和浓度对目的产物的产量有很大的影响
二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、手动吸管泵、尼龙网、移液管、吸耳球、漏斗、离心管、离心机
三、实验药品培养基母液、2,4-D、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
1、 诱导愈伤__形成(参见实验四)
2、 制备液体培养基MS+2,4-D1mg/L+蔗糖3%
3、 在超净工作台上,从形成愈伤__的培养瓶中,挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤__、放入盛有30ml液体培养基的三角瓶中,用镊子轻轻捏碎愈伤__每瓶接入约2g重的愈伤__,置于震荡摇床固定,在黑暗条件下或弱散射光下100r/min震荡培养
4、 将胡萝卜悬浮细胞培养物摇匀后倒在或滴入孔径较大的尼龙网或不锈钢网漏斗中(孔径47μm,81μm或更大)
5、 如果网眼被细胞团堵塞,可用吸管反复吸、吹
6、 再用无菌培养基冲洗残留在网上的细胞团
7、 重复步骤4~
68、 将通过较大孔径的细胞悬浮液,再通过较细孔径的尼龙网过滤(如31μm,26μm),用吸管反复吸、吹
9、 经过分级过滤的“同步化”细胞离心(50g,5分钟),收集后加入液体培养基进行培养或进一步同步化
五、思考题
1、 研究细胞悬浮培养的意义何在?挑选愈伤__进行悬浮培养需注意什么问题?
2、 建立细胞悬浮系的步骤包括哪些?一个良好的悬浮细胞培养体系应该具有什么样的特征? 实验七细胞微室培养
一、实验目的与意义了解和掌握细胞微室培养的方法微室培养是为了进行单细胞活体连续观察而建立的一种微量细胞培养技术运用这种技术可以对单细胞的生长与分化、细胞__的全过程、胞质环流的规律,以及线粒体的生长与__进行活体连续观察;也可以对原生质体融合、壁的再生,以及融合后的__进行活体连续观察,因此它是进行细胞工程研究的有用技术
二、实验器材超净工作台、载玻片、盖玻片、酒精灯、移液管、吸耳球、毛细管、常规接种工具
三、实验药品培养基母液、2,4-D、水解酪蛋白(CH)、蔗糖、琼脂、HCl、NaOH、四环素眼膏
四、实验步骤
1、愈伤__的诱导(参照实验四)
2、单细胞悬浮液的置备(参见实验六)
3、 将洗净的盖玻片与载玻片在酒精灯火焰上灭菌
4、 冷却后按盖玻片的大小在载玻片上涂一圈四环素眼膏
5、 将制得的细胞悬浮液一小滴滴在载玻片上,在四环素眼膏上放一小段毛细管,盖上盖玻片
6、 轻压到密封并使细胞悬浮液的小滴与盖玻片接触
7、 将载玻片放入培养室中,在温度为26-28℃条件下进行培养
8、 利用相差显微镜进行观察
五、思考题微室培养中应注意哪些问题?(从对微室的要求、培养基的要求、所观察的细胞的要求三方面考虑) 实验八原生质体培养
一、实验目的与意义学习原生质体制备和培养的方法原生质体分离纯化后,在适当的培养基上应用合适的培养方法,能够再生细胞壁,并启动细胞持续__,直至形成细胞团、长成愈伤__或胚状体、分化和发育成苗,最终再生成完整植株以黄化绿豆下胚轴弯沟分离原生质体,该部位细胞具有较强的__能力,分化的程度不高,分离的原生质体经培养后很容易__
二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器
三、实验药品MS培养基各种母液、NAA、6-BA、2,4-D、2-N-吗啉乙磺酸(MES)、纤维素酶(OnozukaR-10,Japan)、崩溃酶(Driselase)、果胶酶(Pectinase、Serva)、半纤维素酶(Hemi__llulase,Sig__)、离析酶(____rozymeR-10)、CaCl
2.2H2O、KH2PO
4.H2O、KN
03、MgS
04.7H20KI、CUS
04.5H2O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
1、培养基及试剂的配制绿豆原生质体培养基MS+2,4-D
0.2+NAA1+BA
0.5+蔗糖250mg/L+葡萄糖_____mg/L+(琼脂
1.2%)CPW溶液KH2P
0427.2mg/LKN03101mg/LCaCl
2.2H201480mg/LMgS
04.7H20240mg/LKI
0.16mg/LCuS
04.5H
200.025mg/L,pH
5.6绿豆质壁分离液CPW-13M的配制含有13%甘露醇的CPW溶液绿豆细胞壁酶解液2%W/V纤维素酶__llulaseOnzukaR-
10、1%W/V半纤维素酶hemi__llulaseH-
21250.026unit/mg、
0.5%W/V果胶酶pectinase
0.15unit/mg、
0.5%离析酶(____rozymeR-10)的CPW-9M含有9%甘露醇,5mmol/LMES的CPW溶液,pH
5.2液洗涤液含或不含250μmol/LCaCl2,含5mmol/LMES的9%甘露醇溶液,pH
6.
02、无菌黄化下胚轴的获得经挑选的绿豆种子用70%乙醇表面消毒1min
0.1%升汞消毒8min,无菌水冲洗3遍播于培养瓶中,培养瓶中放入无菌滤纸,加入适量无菌水,以保持合适水分,27士1℃黑暗培养64h
3、酶解选取下胚轴长
3.5-4cm的黄化绿豆幼苗,从弯钩下3mm处,向下切取
0.5mm的切片10个置于CPW-13M溶液中,静置1h,使之质壁分离,而后移入酶解液中,在往__摇床35-40r/min25士1℃上暗中酶解5-6h材料和酶解液的体积大约
1104、纯化用双层尼龙滤网孔径64um过滤酶解液,滤液100×g离心10min,弃去上清液用少量CPW-9M溶解沉淀,小心加入盛有CPW-21S含有21%蔗糖的CPW溶液,pH5-6溶液的离心管中,100×g离心5min,溶液分为3层,仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出,经洗涤液洗涤2次,离心,获得纯净的、具有生理活性的原生质体
5、密度测定与调整将原生质体溶解在培养液中,用血细胞计数板记数
6、培养用融化的培养基将原生质体密度调整为5×105/mL,将其植板于培养皿中,使成一薄层,凝固后,切成4个扇形快,加入液体培养基,使扇形块漂浮其中,置于27士1℃黑暗培养,培养
7、
14、21d,除去旧液,加入新培养基(蔗糖含量为20mg/L,葡萄糖10g/L,其他成分与MS相同培养一周后能见到几个细胞以上的细胞团继续培养细胞团形成愈伤__
五、思考题原生质体制备与培养过程中要注意哪些问题?常用的原生质体培养方法有哪些? 实验九烟草原生质体融合
一、实验目的与意义学习和掌握利用化学诱导剂诱发原生质体融合的方法种间有性杂交不亲和大大限制了野生种有用基因向栽培作物的转移通过原生质体或亚原生质体间的融合进行细胞杂交或细胞重建,是克服这种生殖隔离的一种重要途径现有的融合技术中,以聚乙二醇PEG诱导融合和电融合二者占主要地位,其中PEG融合技术具有设备简单、操作方便等优点,至今仍然广泛采用但现行PEG融合技术是在原生质体群体的条件下进行的,因而在融合产物中除了所欲获得的__细胞外,还不可避免地含有未融合的原生质体、一方亲本原生质体之间的融合体以及多个原生质体的融合体,从而增加了融合后筛选的困难此外,在有些情况下,可供融合的亲本原生质体数量很少,因此在方法选用上要充分考虑这些因素
二、实验器材超净工作台、震荡摇床、各种接种工具、微孔滤膜过滤器、Parafilm封口膜
三、实验药品MS培养基各种母液、KT、NAA、2,4-D、MES(2-N-吗啉乙磺酸)、纤维素酶(OnozukaR-10,Japan)、崩溃酶(Driselase)、果胶酶(Pectinase、Serva)、半纤维素酶(Hemi__llulase,Sig__)、离析酶(____rozymeR-10)、CaCl
2.2H2O、KH2PO
4.H2O、KN
03、MgS
04.7H20KI、CuS
04.5H2O、甘露醇、葡萄糖、蔗糖、琼脂、聚乙二醇、二甲基亚砜
四、实验步骤
1、实验材料实验材料为普通烟草品种“自来红”和波缘烟草种子在70%酒精中浸泡30s,无菌水冲洗一次后,用
0.1%升汞消毒8min,无菌水冲洗六遍,培养于MS基本培养基上于25℃下诱发无菌苗将丛生芽在相同培养基上每4-5周转接一次取普通烟草完全伸展叶片约3×5cm作为分离原生质体的材料对于波缘烟草,以叶片外植体在MS培养基附加24-Dlmg/LNAA2mg/LKT
0.5mg/L诱导的愈伤__为分离原生质体的材料
2、原生质体的分离撕去下表皮,在无菌培养皿中将普通烟草叶片切成约
0.5×
0.5cm小块,和波缘烟草愈伤__各约1g鲜重分别置于l0ml酶液(2%纤维素酶__llulaseOnzukaR-
10、1%半纤维素酶hemi__llulaseH-
2125、
0.5%果胶酶pectinase、
0.5%离析酶____rozymeR-10的CPW-9M液)中在28℃下处理3-4h叶片材料不时轻轻摇动,愈伤__则在摇床上振摇30rpm酶解产物经400目尼龙网过滤后,100g离心3min收集原生质体然后用洗液CPW盐+9%甘露醇洗3次100g,离心1min小心加入盛有CPW-21S含有21%蔗糖的CPW溶液,pH5-6溶液的离心管中,100g离心5min,溶液分为3层,仔细将漂浮在溶液中部的原生质体取出,经洗涤液洗涤2次,离心,获得纯净的、具有生理活性的原生质体用洗涤液将原生质体密度调整到1~5×105个细胞/ml,待用
3、原生质体融合原生质体融合采用PEG和高Ca2+、高pH法将双亲原生质体等量混合后,室温将2滴原生质体悬液滴在置于直径5cm培养皿中的25×25mm盖玻片上静置20min后从液滴边缘加人1滴溶液A含分子量6000的PEG40%葡萄糖
0.3mo1/LCaCl266mmo1/L,二甲基亚砜10%再静置20min后,将溶液尽可能吸出并加入尽可能多但不使溶液流下盖玻片的KM培养基10min后换以适量新鲜培养基培养皿用Parafilm封口后置于25℃散射光条件下培养10天后将原培养基吸掉一半,换以等量的渗透压减半的新鲜培养基
4、芽分化待形成肉眼可见愈伤__时将其逐一挑出建立源自单个细胞的克隆系芽分化培养基为MS培养基附加BA2mg/LIAA
0.5mg/LCH200mg/L,甘露醇20g/L,蔗糖30g/L,琼脂8g/LpH
5.
85、生根芽长至3-5cm时转至MS基本培养基上诱导生根
五、思考题查阅相关文献,设计一组实验方案来鉴定所得的愈伤或植株是真正的融合体实验十烟草叶片__培养
一、实验目的与意义掌握利用叶片作为外植体进行无性繁殖的方法烟草是重要的经济作物和工业原料作物,其体内所含的烟碱等生物碱是非常宝贵的医药及化工原料,最近证实可利用烟草细胞悬浮培养物获得细胞__素类物质有关烟草的__培养体系的建立报道很多,利用本试验建立的烟草组培快繁体系,可以为利用农杆菌的遗传转化来改良烟草品种和利用烟草细胞培养物进行烟碱等次生物质的生产奠定基础
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀
三、实验药品MS培养基各种母液、2,4-D、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞
四、实验步骤
1、培养基的配制
①愈伤__诱导培养基MS+24-D
1.0mg/L单位下同+NAA
2.0+KT
0.5
②愈伤__分化培养基MS+KT
2.0+IAA
0.5
③幼芽增殖培养基MS+6-BA
1.0+NAA
0.2
④生根培养基MS+NAA
0.2上述培养基均附加3%蔗糖,
0.8%琼脂,pH
5.
82、接种取烟草幼嫩叶片用自来水充分洗净后,经75%酒精消毒30s
0.1%升汞溶液浸泡8min,无菌水冲洗5-6次后,去掉主叶脉和大的侧叶脉,将叶片切成
1.0-
1.5cm2的小方块,接入
①中培养,接种时下表皮与培养基接触培养温度25士2℃,光照14h/d,光照强度2000lx每三角瓶接种3-5个外植体
3、愈伤诱导约2-3d后,叶片外植体卷曲、增厚、膨胀,15d后外植体脱分化形成疏松絮状浅黄绿色的愈伤__
4、愈伤__的分化将愈伤__转接到分化培养基
②上,15d后,从疏松愈伤__上分化出许多浅黄绿色芽点40d后,从愈伤__上分化出越来越多幼芽
5、幼芽的增殖将幼芽切下,转接至不加24-D的幼芽增殖培养基
③上,可不断增殖,发育成绿色健壮的小苗
6、诱导生根及移栽取约3-4cm长的无根小苗接种于生根培养基
④中,约7-8d后,外植体从其基部产生白色幼根,当试管苗长至5-6cm高时,打开瓶口,在散射光下放置2d后取出,洗去根部残留培养基,种植于经过消毒的珍珠岩、泥炭土和菜园土等量混合的基质中,成活率可达95%以上
五、思考题以烟草为材料,查阅相关文献,设计烟草遗传转化实验(利用农杆菌介导法) 实验十一月季__培养
一、实验目的与意义掌握利用茎段作为外植体进行无性繁殖的方法月季属蔷薇科,在观赏植物中占有重要地位根据其栽培技术的要求,以往的传统方法,多采用野蔷薇种子播种,在2-3年生的实生苗上嫁接,此法不仅繁殖系数小,且成本较高,生长缓慢,而__培养技术的应用,使得月季育苗发展迅速
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀
三、实验药品MS培养基各种母液,6-BA、NAA、IAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞
四、实验步骤
1、培养基的配制增殖培养基MS+6-BA
1.5+NAA
0.1+蔗糖3%+琼脂
0.7%生根培养基1/2MS+IBA
0.5+蔗糖3%+琼脂
0.6%
2、外植体的获得选用嫩茎为材料,取带芽的茎段,一般以顶端以下第3-10节上的芽为好,采回枝条剪去叶柄,再剥去附在茎上的皮刺,先用自来水冲洗枝条表面的尘土,然后把枝条段截成2-3cm小段,每段带1-2个侧芽,用70%酒精灭菌20s,再用
0.1%氯化汞溶液浸泡10min,再用无菌水冲洗4-5次
3、接种将灭好菌的材料在无菌培养皿中切成
0.5cm的小段,接种到灭好菌的培养基上
4、培养培养温度24℃-26℃,光照时间8-10h,光照强度12001x
5、分芽继代将丛生芽分割继代
6、生根培养选取苗长2cm以上的壮苗作为生根材料,接种到生根培养基上,一般在接种后一周开始观察,约10d后发现有少量苗生根,20d后即可移栽
7、移栽.将培养有试管苗的三角烧瓶打开,在温室中炼苗2d,然后取出洗去根部琼脂,移至盛有珍珠岩与细沙1:1的花钵中,每天浇营养液,移栽成活率可达80%以上
五、思考题查阅相关文献,设计筛选月季芽增殖体系建立的最佳激素组合 实验十二菊花__培养与快速繁殖
一、实验目的与意义掌握利用茎尖作为外植体进行无性繁殖的方法菊花是多年生宿根花卉,原产我国,是世界上栽培__较大的花卉,其品种多达约25000种,我国的菊花品种也有7000种以上,是人们非常喜欢的一种常见花卉在栽培过程中,菊花的繁殖多采用扦插法,但该__造成优良品种的品质退化,究其原因,在于繁殖及栽种过程中感染了病毒,且病情随种植时间的延长而恶化,解决此问题的最好途径是茎尖培养
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、解剖针、解剖镜
三、实验药品MS培养基各种母液,6-BA、NAA、蔗糖、琼脂、酒精、升汞
四、实验步骤
1、培养基的配制培养基是以MS为基本培养基,附加不同激素构成的.其中,
①诱导侧芽生长培养基为MS+NAA
0.1mg/L+6-BA
5.0mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.7%
②增殖培养基为MS+NAA
0.1mg/L+6-BA
3.0mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.7%
③生根培养基1/2MS+NAA
0.1mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.7%
2、外植体的获得取菊花带顶芽茎段,长约2cm,于流水中冲洗去掉表面泥土,在超净工作台内将材料浸入75%酒精30-45s,然后用
0.1%H__l2消毒7-10min,无菌水浸洗4~5次,材料放入无菌的铺有滤纸的培养皿内
3、诱导侧芽生长在解剖镜下,用接种针将菊花顶芽外面的幼叶小心依次剥掉,直至在解剖镜下能看清表面光滑、呈圆锥形的茎尖为止,再用已灭菌的解剖刀割取茎尖__,长约
0.5-
0.6mm,接种于培养基
①上
4、培养置于暗处1-2d,然后转移至培养架上,经过l0d菊花茎尖颜色逐渐变绿,基部逐渐增大,茎尖也逐渐伸长,一般25d后,长出丛生芽
5、继代培养将丛生芽切割下,分开接种于培养基
②之上,一般15d后可长出丛生芽,取丛生芽转接于新的培养基
②上,则可在更短的时间内约10d长出丛生芽,继代培养的次数越多,从接种到长出丛生芽所需的时间越短,但不短于7d,若不及时转接,芽苗会迅速长高
6、诱导生根取长约2-3cm的芽苗分开接种于培养基
③上,进行诱导生根培养,l0d左右就可出现大量小根,最后有1-6条根可长得较长,芽苗也迅速长高
7、试管苗的移栽在芽苗生根后,先将瓶塞打开,让其由无菌环境转至有菌且湿度较低的环境之中约3d,将苗取出,小心用流水洗去根表面的培养基残留物,移栽到沙土中,适当遮荫,一星期后即可成活,成活率达95%以上,一个月后即可上盆
五、思考题查阅相关文献,以马铃薯为材料设计马铃薯脱毒苗实验方案,包括脱毒苗的检测 实验十三马铃薯茎尖脱毒
一、实验目的与意义掌握利用茎尖进行脱毒培养的方法马铃薯是人们日常生活中的一种主要食物由于__无性繁殖,马铃薯病毒病较重,所以造成品种退化,产量和品质的大幅度下降通过热处理,在无菌条件下剥取小于
0.3mm的茎尖生长点进行__培养成苗后,基本可以达到脱去病毒的作用,从而恢复产量及品种特性
二、实验器材光照培养箱、超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、解剖针、解剖镜
三、实验药品MS各种母液、6-BA、NAA、GA
3、酒精、升汞、蔗糖
四、实验步骤
1、 将表面光滑的马铃薯切块,埋在湿润的沙土中在室温下催芽
2、 待芽长至2cm时,将发芽块茎放入37℃的光照培养箱,光照时间12h/d,处理时间28d左右
3、 剪取经过热处理的发芽块茎的茎尖1~2cm,自来水冲洗
0.5h,剥去外面的叶片在超净工作台上进行严格的消毒
4、 用75%的酒精浸15s,无菌水冲洗2次,再用
0.1%的升汞浸泡8~10min,无菌水冲洗3~5次,每次冲5min,放在灭过菌的培养皿中待用
5、 在超净台上,把装有已消毒茎尖的培养皿放在解剖镜下,仔细剥离,直到出现圆滑生长点时,用灭过菌的解剖针切取
0.1~
0.5mm带1~2个叶原基的茎尖,接种于培养基上培养基为MS+GA
30.1+NAA
0.1+6-BA
0.5+蔗糖3%+琼脂
0.6%
6、 将接种好的茎尖移到培养室中,于25℃、3000lx培养,大约5~7d茎尖转绿,40~50d成苗
7、 病毒检测主要用ELISA或指示植物方法鉴定
8、 在无菌条件下,将试管苗切割成带一腋芽的茎段,接种在试管苗培养基MS+6-BA
1.0+蔗糖3%+琼脂
0.6%
9、 当试管苗长高到3~4cm,具有5~7个浓绿色的小叶时进行移栽在移栽前4~5d开盖炼苗,然后取出苗,洗净根部培养基,将其移入珍珠岩基质移栽时用镊子将基质压割成1~2cm深的槽沟,覆上基质,用水浇湿,以便根部与土壤密接,易于成活保持较高空气湿度,土壤不要过湿,光照应当充足,气温不宜超过30℃
10、当植株高度达到10~15cm,具有5片左右完全展开浓绿的复叶时移入田间
五、思考常用的病毒植株的鉴定方法有哪些? 实验十四马铃薯试管微薯的诱导
一、实验目的与意义掌握利用马铃薯无菌苗进行微薯诱导的方法茎尖脱毒与无性快繁技术应用于马铃薯种薯生产,能有效的克服病毒病对马铃薯的危害,并已产生了很大增产效果离体条件下直接诱导试管微薯,实现工厂化生产脱毒原原种薯,可以加快脱毒马铃薯的繁殖,缩短种薯生产周期,从而大幅度提高马铃薯的产量
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、滤纸、牛皮纸、脱脂棉
三、实验药品MS各种母液、6-BA、水杨酸(SA)、酒精、升汞、蔗糖
四、实验步骤
1、 把经过检测不带病毒的小苗,切成带1~2个芽的茎段,转接于30ml快繁培养基上,每瓶接15~20株,待小苗长至10cm左右时,可以进行下次扩繁快繁的液体培养基为MS+6-BA
1.0+蔗糖3%固体支撑物为脱脂棉
2、 在2000~3000lx光下24h光照,25±1℃培养40d左右
3、 于试管苗10~15叶片,株高10~15cm时,在无菌条件下加入30ml的诱导微薯的培养基诱导微薯的培养基为MS+6-BA5mg/L+SA
0.5mmol/L+12%蔗糖
4、 在黑暗条件下,15±3℃下,诱导试管微薯
5、 20d后,培养温度升高到25℃,每天光照2~3h,50d后采收微薯
五、思考SA和蔗糖在马铃薯试管微薯的诱导过程中起什么作用?影响微薯诱导的因素有哪些? 实验十五小麦幼胚培养
一、实验目的与意义学习和掌握幼胚培养的一般方法在远缘杂交中,__胚往往是败育的,这时候只有进行幼胚培养才能获得下一代的种苗,因此幼胚培养在远缘杂交中具有极大的利用价值另外,幼胚在诱导基因转化受体、筛选突变体方面也具有重要的应用价值因此幼胚培养越来越受到科学家们的__幼胚在胚珠中是异养的,需要从母体和胚乳中吸收各类营养物质与生物活性物质,因此进行幼胚培养时,必须通过培养基向它提供足够的营养,并提供适宜的培养条件
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀
三、实验药品MS培养基各种母液、NAA、6-BA、2,4-D、KT、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
1、培养基的配制诱导培养基MS+2,4-D
2.0mg/L+KT
0.5mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.6%继代培养基MS+2,4-D
1.0mg/L+KT
0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂
0.6%分化培养基MS+IAA
0.5mg/L+KT
1.5mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.6%生根培养基1/2MS+NAA
0.2+IAA
0.5+蔗糖3%+琼脂
0.6%
2、取材小麦出现第一朵小花起分别挂牌记录开花时间,15d后从田间取回穗子,置于4℃冰箱内处理24h
3、接种剥出子粒,用75%的酒精消毒30s,用
0.1%升汞消毒8min,用无菌水洗三次,于无菌条件下将幼胚剥出接在诱导培养基上,盾片向上
4、培养接种后的培养瓶于2000~3000lx光照,(25±1)℃条件下培养,25d统计出愈率,胚性愈伤诱导率
5、继代将胚性愈伤__转移到继代培养基上继代培养
6、分化将愈伤__接种到分化培养基上统计分化率分化率=产生绿色芽点愈伤数/接种愈伤数×100%
7、生根绿芽长到2~3cm时转到生根培养基
8、炼苗打开瓶口,在培养间炼苗2~3d,转到自然条件下炼苗2~3d
9、移栽洗去小苗表面的培养基,移栽到小盆里,成活后移栽到大田
五、思考题植物胚胎培养分为哪些类型各有何特点和要求胚胎培养有何重要意义 实验十六小麦成熟胚培养
一、实验目的与意义学习掌握成熟胚培养方法小麦的__培养,特别是胚性细胞系的建立,作为小麦遗传转化操作的主要技术基础,一直受到广泛__前人已采用过小麦的多个部分如根、茎、叶、幼穗、幼胚和成熟胚等为外植体,研究了其愈伤__细胞的分化再生情况,发现幼穗和幼胚愈伤__具有较高的再分化能力但幼穗,幼胚的采用受季节限制,而种子保存期长,易获得,可用于较长时间的研究只是成熟胚脱分化能力较弱,愈伤__再分化能力差,但如果能改变种子的生理状态,提高其胚性愈伤__的形成能力,无疑将大大促进小麦胚性细胞系的建立低温处理具有促进种子从体眠状态转向萌发状态的效应低温处理对小麦成熟胚愈伤__的形成也有一定影响,可以提高其愈伤形成和分化能力
二、实验器材超净工作台、镊子、酒精灯、棉球、烧杯、广口瓶
三、实验药品MS培养基母液、24-D、6-BA、KT、吲哚乙酸IAA、腺嘌呤、天冬氨酸、谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
1、培养基的制备诱导培养基MS+24-D2mg/L+KT
0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.8%,pH
5.8继代培养基MS+24-D1mg/L+KT
0.5mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.8%,pH
5.8分化培养基MS+6-BA2mg/l+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖3%+琼脂
0.8%,pH
5.8小苗培养基:MS+NAA
0.2mg/1+腺嘌呤40mg/l+蔗糖3%+琼脂
0.8%,pH
5.8生根壮苗培养基1/2MS+NAA
0.5mg/1+蔗糖3%+琼脂
0.8%,pH
5.
82、无菌材料的获得将小麦种子在4℃冰箱中充分吸水,用
0.1%H__l2灭菌20min,无菌水冲洗3次在超净工作台上用75%乙醇浸泡1min,
0.1%H__l2浸泡5min,无菌水冲洗2次;再用
0.1%H__l2浸泡8~10min无菌水冲洗3次,放入培养皿备用
3、接种用解剖刀将种胚切下,并将胚用镊子轻轻夹破,盾片朝上,分别接种在不同类型的培养基上培养或直接用手拿种子,用镊子剥取成熟胚接种到培养基,然后用长镊子将盾片朝上每瓶接种十个左右成熟胚
4、培养培养温度25℃±1℃,每天光照12h愈伤__诱导用散射光2周后统计出愈率出愈率=产生愈伤数/接种成熟胚总数×100%
5、继代将胚性愈伤__转移到继代培养基上继代培养
6、分化将愈伤__转移到分化培养基,愈伤__分化光照强度1500~2000lx,统计分化率分化率=产生绿色芽点愈伤数/接种愈伤数×100%
7、小苗培养将有绿芽的愈伤__转接到小苗培养基上进行芽苗诱导和伸长
8、壮苗培养在无菌条件下取出绿苗,转入壮苗培养基中培养
9、炼苗打开瓶口,在培养间炼苗2~3d,转到自然条件下炼苗2~3d
10、移栽洗去小苗表面的培养基,移栽到小盆里成活后移栽到大田
五、思考题根据所学知识,查阅相关文献,利用成熟胚培养筛选耐盐突变体的实验方案 实验十七小麦花药培养
一、实验目的与意义学习和掌握利用花药作为外植体进行离体培养的方法利用离体培养花药的方法,诱导形成单倍体的工作始于1964年单倍体植物的主要特点是其孢子体细胞的染色体数目和配子体细胞的染色体数目一致,因此可以从其表型观察基因型利用这一特点在杂交育种中可以提高选择效率,避免误选和漏选对单倍体植物进行染色体人工加倍之后即可得到同质结合的纯系,使育成的__不再分离,缩短育种年限,加快育种速度
二、实验器材超净工作台、小镊子、三角瓶、棉球、纱布、冰箱、载玻片、盖玻片、显微镜
三、实验药品W14培养基各种母液、2,4-D、KT、蔗糖、琼脂、洋红、醋酸、工业酒精
四、实验步骤
1、 4月初,取大田中不同材料的小麦幼穗中部花药做醋酸洋红镜检,选择花药小孢子处于单核靠边期的幼穗(其外部形态为旗叶叶耳和倒二叶叶耳距离约为8-10cm,视品种而定),置于4℃冰箱低温处理24~48h
2、 低温处理后的小麦幼穗除去叶片,用75%酒精棉球擦拭进行表面消毒
3、 将消过毒的幼穗用含有酒精的纱布包好,放到超净工作台,在无菌条件下除去叶鞘,剥取幼穗中部花药,接种到含有2,4-D2mg/L和KT
0.5mg/L的W14琼脂培养基上,培养基的蔗糖浓度为10%每瓶接种80~100枚花药
4、 接种后将培养瓶置于散光,25~28℃条件下诱导愈伤__
5、 当愈伤__生长到
1.5-
2.0mm时,将其转移到含有NAA
0.5mg/L,KT
0.5mg/L和蔗糖3%的W14琼脂培养基上进行根芽分化转移后的愈伤__每天给以10小时光照,培养温度为25℃
6、 在幼苗长出2-3片真叶时,可将其转入含有多效唑3mg/L,NAA
0.5mg/L、KT
0.5mg/L和蔗糖8%的MS培养基中,在22-25℃下培养诱导生根,然后及时将培养物转入3-8℃的低温、弱光下进行蹲苗越夏
7、 当室外气温降至6℃时,将试管苗移至室外苗床,在自然条件下炼苗5-7d,然后洗净琼脂,栽于苗床移栽后在苗床上搭盖塑料薄膜,严冬时加盖苇帘等,使麦苗处于不低于0℃的条件下越冬
8、 翌年早春气温回升到2-3℃时,揭去塑料薄膜
9、 早春花粉植株处于分蘖盛期时采用根尖细胞染色体计数方法确定花粉植株的倍性
10、将单倍性植株从土中挖出,洗去泥土,将根部浸入含有
1.5%二甲基亚砜的
0.04%秋水仙碱溶液中,于18℃处理8h(注意一定要使药液没过分蘖节),然后洗净药液,栽回土壤
五、思考花药培养有什么意义?培养过程中应该注意哪些问题? 实验十八生物反应器中芹菜体胚发生的大规模培养
一、实验目的与意义学习和掌握利用生物反应器进行人工种子繁育的方法人工种子技术是当前细胞工程研究中的一个重要课题,在农业生产上的应用也有十分巨大的潜力,通过无性繁殖获得大批高质量的成熟体胚是保证人工种子制作及用于农业生产的必要前提应用生物反应器进行体胚发生大规模悬浮培养研究,正是为了适应这种需要而提出的任务之
一二、实验器材2L机械搅拌式生物反应器LHSeries210England公司、超净工作台、摇床、高压灭菌锅、镊子、酒精灯、棉球、三角瓶、培养皿、解剖刀、pH试纸
三、实验药品MS培养基各种母液、2,4-D、KT、CH(水解酪蛋白)、脯氨酸、GA3(赤霉素)、蔗糖、琼脂
四、实验步骤
1、培养基配制
① 发苗培养基MS+
1.0mg/LGA3+
3.0%蔗糖+
0.7%琼脂
②诱导培养基MS+
1.0mg/L24-D+
3.0%蔗糖+
0.7%琼脂
③液体诱导培养基诱导培养基不加琼脂,pH
5.5
④分化培养基MS+CH500mg/L+
0.5mg/LKT+ABA
0.25mg/L+500mg/L脯氨酸+
2.0%蔗糖
2、旱芹无菌苗的获得将旱芹天然种子用水冲洗
0.5h70%酒精消毒3min,然后用升汞溶液浸泡12min,再用无菌水冲洗后,接种于发苗培养基上培养培养条件:室温25士1℃,每日光照12h,光照度1500Lx,以下培养条件相同
3、 愈伤__的诱导1个月后,获得40-60mm高的无菌苗取下胚轴切成5-10mm小段,接种于诱导培养基,以诱导愈伤__
4、 胚性愈伤悬浮体系的建立一个月后,将诱导获得的松散、细粒状愈伤__挑入液体诱导培养基中,在转速100r/min下振荡培养,继代频率8士2天/次,1个月后挑出浅黄色、结构松散、细粒状愈伤__转入固体诱导培养基中,如此反复多次后,用80目筛网过筛,用分化培养基反复冲洗2-3次,这样就建立起胚性愈伤__悬浮体系
5、接种反应器在高压灭菌锅内灭菌121℃35min,分化培养基单独灭菌121℃15min后,在超净工作台内,待反应器冷至室温,将愈伤__悬浮细胞系和培养基由顶部接种口倾倒入反应器内,接种量控制在2~
2.5%设置好通气速率和搅拌转速,温度自动控制在25士1℃反应器pH值由蠕动泵流加
0.1mol/LNaOH和
0.1mol/LH2SO4,控制范围pH
5.3~
6.0培养刚刚开始时,通量为800cm3/min,搅拌为60r/min,以满足培养期细胞__快,对氧气需求量大的要求,第6d后,将搅拌降至40r/min,10d以后,停止搅拌,通气下调至600cm3/min,第20d以后,由于形成胚状体个体及比重的增加,将通气增至800cm3/min.在培养过程中,每隔3±1d更换一次培养基双子叶胚状体出现后(大约培养24d外形上出现绿点),停止培养
6、人工种子的制作取MS基本培养基的各种成分,另加GA
30.5mg/L、6%的麦芽糖、防腐剂WH831-D
0.5%,按4%比例加入海藻酸钠粉末,混合加热使成溶胶状态即包埋剂灭菌后将体胚与包埋剂混合用内径为
3.Omm的滴管吸取单胚滴入2%CaCl2溶液中30min后用无菌水漂洗20min即可得到包埋好的人工种子将其放入4℃保存
五、思考人工种子制备过程中如何获得高质量的体胚? 实验__植物细胞的生长计量技术
一、实验目的与意义愈伤__和单细胞培养中,随时监测细胞的增殖和细胞团的生长状态是非常必要的,通过对培养细胞和细胞团生长的计量技术,来达到如下的目的
(1)筛选最适于培养细胞增殖和生长的培养基化学组成、渗透压和酸碱度
(2)监测培养__和悬浮培养细胞在整个培养世代中,细胞数目的增长情况和一个培养世代所需要的时间,以确定继代培养和注入新鲜培养基的时间
二、实验器材离心机、尼龙网、显微镜、刻度离心管、荧光显微镜、注射器、天平、吸管、血球记数板、酒精灯、恒温水浴、试管、载玻片、盖玻片、刀片、超滤器
三、实验药品三氧化铬、盐酸、果胶酸、荧光素双醋酸酯(FDA)、洋红、甲基蓝、伊文思蓝、乳酰丙酸苔红素、甲酸、乙酸、中性胶、孚尔根染色系列药品
四、实验步骤
1、培养细胞的记数
(1)悬浮培养细胞的记数
①吸取细胞悬浮液一滴至计数板上
②将盖玻片由一边向另一边轻轻盖上,再用两只拇指压紧盖玻片两边,使盖玻片和计数板紧密结合,以防形成气泡
③数分钟后,细胞沉降至载玻片表面,即可在显微镜下计数
④每个样品计数6个重复,最后计算出单位体积中细胞数量
(2)愈伤__细胞的计数愈伤__鲜重和细胞数目有一定的关系,故愈伤__鲜重可以作为测量细胞数目的一种间接方法但由于测量时的来回搬动,很容易造成污染,从而造成材料的损失可以先将愈伤__离析软化成单细胞,然后再进行统计
①愈伤__先用1mol/L盐酸在60℃下水解预处理10min,需注意愈伤__的取样时间,通常是在细胞数目急速增加,每个细胞平均重量或体积急剧下降时取样
②加入5%三氧化铬,两倍于细胞体积的溶液在20℃离析16h,也可以增加铬酸浓度,提高温度来缩短离析时间如用8%三氧化铬在70℃条件下,离析2-15min值得注意的是,由于愈伤__细胞在取样时,处于不同的生长周期,故离析时间有长短之区别,只有靠经验确定三氧化铬浓度过高,处理时间过长,会导致细胞分解,从而减少细胞数目
③将离析软化的细胞,迅速冷却,然后强力振动10min,使其分散,然后用蒸馏水洗3次备用
④用含
0.03mol/L的EDTA、1%结晶紫溶液对上述离析后的细胞进行染色10min然后用蒸馏水仔细洗涤数次
⑤将洗涤后的细胞放入装有2ml蒸馏水的小试管中,用玻璃棒搅动,使细胞分散,形成悬浮液
⑥用血球计数板计数每块愈伤__的细胞数目
2、培养细胞体积的测定细胞体积在一定范围内,反映了悬浮培养细胞数目的增殖状态一般培养细胞增殖速度快,细胞体积越小培养细胞体积的测量,最简便的方法是取15ml悬浮培养细胞,放入刻度离心管中,用2000×g离心5min以每毫升培养液中,细胞体积的毫升数来表示这种方法简便,但太过于粗放显微测微尺直接测量法
(1)放置目镜测微尺旋开目镜,将目镜测微尺放在目镜的光阑上,注意刻度面向下,然后将目镜放回镜筒
(2)放置镜台测微尺将镜台测微尺放在载物台上,调节焦距,使之通过目镜能清楚看清镜台测微尺的刻度
(3)校准目镜测微尺在低倍显微镜下,__镜台测微尺和转动目镜测微尺,使两者刻度平行,并使两者间某段的起止线完全重合,数出两条线重合的格数,就能求出目镜测微尺每格相应的长度用同样的方法分别测出高倍镜和油镜下,目镜测微尺每格的相对长度
(4)细胞体积测量取下目镜测微尺,将待测的样品放在载物台上,通过调焦使物象清晰后,转动目镜测微尺,测量细胞的长与宽各占几格将测得的格数乘以目镜测微尺每格长度,即可求得细胞的体积注意事项
①载物台上镜台测微尺刻度是用___树胶和圆形盖玻片封合的当除去松柏油时,不宜使用过多的二甲苯,以避免盖玻片下的树胶溶解
②取出目镜测微尺,将目镜放回镜筒,要用擦镜纸擦去目镜测微尺上的油腻和手印如用的是油镜应按油镜使用方法处理镜头
3、培养细胞重量测定
(1)鲜重测定采用直接测量法
①来自固体培养基的材料,取出后洗去琼脂并用滤纸吸干水分,然后直接用分析天平称重
②来自液体悬浮培养液培养的细胞,可放入已知重量的尼龙网上过滤过滤后用水冲洗,除去培养基,然后离心除去水分称量后的重量,减去尼龙网的重量即为悬浮细胞鲜重
(2)干重的测定
①将愈伤__从琼脂培养基中取出,放入称量瓶内于60℃烘箱内烘12~24h(因材料大小、厚薄而定)取出,冷却后立即称量
②悬浮培养细胞,经抽滤法去除培养基并收集在预先称好重量的超滤器上,再用水洗数次,用抽滤器抽干细胞表面水分,然后置于60℃烘箱内烘12~24h(因材料大小、厚薄而定)取出,冷却后立即称量
4、细胞活力测定采用荧光法或染色法,两者可择其一
(1)荧光法荧光素双醋酸酯(FDA)本身无荧光、无极性,可自由透过原生质体膜进入细胞内部进入后由于受到活细胞中内脂酶的分解,而产生有荧光的极性物质-荧光素,荧光素则不能自由出入原生质体膜故在荧光显微镜下,可观察到具有荧光的细胞表明该细胞是有活力的细胞相反不具有荧光的细胞是无生命力的细胞操作步骤
①吸出
0.5ml细胞悬浮液放入10mm×100mm小试管中,加入FDA液,使最后浓度达到
0.01%混匀后并在常温下作用5min
②荧光显微镜观察,激发滤光片为QB24,压制滤光片为TB,经观察发出绿色荧光的细胞为有活力的细胞,不产生荧光的细胞为无活力的死细胞
③活力统计,细胞活力是用有活力的细胞数占总观察细胞数的百分数来表示注意叶肉细胞由于受叶绿素的干扰,有活力的细胞可发出黄绿色的荧光而不是绿色荧光无活力的死细胞,则发出红色荧光
(2)染色法有活力的细胞具有选择性吸收外界物质的特性,当用染色剂处理时,活细胞拒绝染色剂的进入,因此染不上色死细胞可吸附大量的染色剂而染上颜色统计未染上颜色的细胞数目,就可计算出它的活力操作步骤
①材料准备制备原生质体和悬浮单细胞材料
② 配制染色剂,如洋红、甲基蓝、伊文思蓝等,浓度
0.005%~
0.01%
③ 将染色剂滴入材料上染色,数分钟后,即可统计观察注意染色时间不能太长,否则有活力的细胞也会染上颜色,从而影响统计的准确性
5、植板率测定用平板法培养单细胞或原生质体时,细胞的增殖状况常以植板率来表示,即能长出细胞团的细胞占接种细胞总数的百分数每个平板上接种的细胞数,可根据铺板时,加入细胞培养液的毫升数和每1ml培养液中含有细胞数来计算,即两者的乘积即为每平板上的细胞总数操作步骤
①制备胡萝卜悬浮培养物,经尼龙网过滤,获得适于平板培养的细胞悬浮液
②利用血球计数板调节悬浮细胞密度到5×105个/ml
③培养基的制备为了提高植板率,一般选用条件培养基首先配制悬浮细胞培养基(参考实验六),接种愈伤__(或接种悬浮细胞)后进行一段时间的培养,然后离心,取其上清液即为最简单的条件培养基制作平板培养用的固体条件培养基时,可取上清液一份,与含相同糖浓度和
1.4%琼脂的灭菌培养基1份,在后者经高压灭菌尚未冷却的情况下趁热充分混合,冷却到30-35℃备用
④ 平板培养的制作将一份已调制好细胞密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体条件培养基充分混合均匀,倒入各个无菌培养皿,使培养基的厚度在5mm左右盖上培养皿用熔化的石蜡密封将进行平板培养的培养皿放入一个垫有湿滤纸的大培养皿中
⑤ 当细胞团肉眼可见时计数在暗室的红光下将一张印相纸或放大纸置于培养皿的__,在培养皿的上方置一光源,打开光源使培养皿中细胞团印到印相纸或放大纸上,将照片冲洗出来,细胞团在照相纸上呈白色,周围培养基呈淡黑色
6、有丝__指数的测定有丝__指数是指在一个细胞群体中,处于有丝__的细胞数占总细胞数的百分率__指数越高,说明细胞__速度越快;反之则慢有丝__指数,只反映群体中每个细胞__时所需时间的平均值有丝__指数的测定方法
(1)愈伤__细胞有丝__指数的测定最简单的方法是孚尔根染色法
①先将愈伤__用1NHCl在60℃下水解20min后染色
②在载玻片上,按常规作镜检,随机查500个细胞,统计其中处于__间期以及处于有丝__各时期的细胞数目
③根据调查有丝__各时期细胞数目,计算出有丝__指数
(2)悬浮培养细胞有丝__指数的测定
①取一定体积的悬浮培养细胞,离心后将细胞吸于载玻片上
②加一滴乳酰丙酸苔红素于细胞上
③将细胞片在酒精灯上微热后,再该上盖玻片,轻击盖玻片
⑥ 将盖玻片用力轻轻接下,用乙醇将盖玻片和载玻片上的细胞洗一下,然后将盖玻片安放在一片新的载玻片上而原来的载玻片上,则盖上一片新的盖玻片,片子上均放帕拉尔胶(euparal)或溶于叔丁醇的___树胶封片
⑦ 将上述方法制成的片子,用油镜检查1000个细胞随后计算出__指数
五、思考题培养细胞生长量的测定有什么意义?试从培养细胞重量、体积、数目、植板率、细胞__指数分述之以自己的实验结果为例,说说自己的结果对于细胞培养实验有什么借鉴意义? 实验__烟草遗传转化实验
一、实验目的与意义烟草是遗传转化的模式植物,已经建立了一套完善的转化再生体系本实验以烟草为实验材料,使同学们了解根癌农杆菌介导法的基本原理和一般步骤,掌握遗传转化的基本操作技术
二、实验器材摇床、超净工作台、冰箱、移液抢、镊子、手术刀、打孔器、酒精灯、棉球、培养皿、三角瓶、滤纸、牛皮纸、牙签
三、实验药品MS培养基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、琼脂、蔗糖、卡那霉素、羧卞青霉素、6-BA、IAA
四、实验步骤
1、根癌农杆菌质粒的保存构建好的根癌农杆菌质粒接种在YEP固体培养基上,YEP固体培养基的成分为每100ml含NaCl
0.5g,酵母1g、水解酪蛋白1g、琼脂
1.5g、Ph
7.0在冰箱中冷藏,一个月换一次培养基,保证菌种正常生长
2、配制YEP液体培养基成分同上,只是添加卡那霉素而不添加琼脂,分装于试管中,每试管加入5ml左右的液体培养基,包好后高压灭菌,放置于冰箱中待用
3、摇菌用灭菌的牙签或者火柴棍等挑出单菌落,一起放入上述YEP液体培养基中,然后置于27℃摇床上摇菌16-17h(180r/min),培养至OD600为
0.6~
0.
84、用消毒后的
0.5mm的打孔器从无菌苗叶片上切出叶盘,接种到MS+6-BA
1.0+NAA
1.0+3%蔗糖+
0.7%培养基上预培养2~3d,材料切口刚刚开始膨大时即可进行侵染
5、 取OD600为
0.6~
0.8的菌液,按1%~2%的比例,转入新配制的无抗生素的细菌液体培养基中,可在与上相同的条件下培养6h,OD600为
0.2~
0.5时即可用于转化
6、 侵染于超净工作台上,将菌液到入无菌小培养皿中从培养瓶中取出预培养过的外植体,放入菌液中,浸泡5min,取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液
7、 共培养将侵染过的外植体接种在愈伤__诱导培养基上MS+IAA
0.5+BA
2.0+蔗糖3%+琼脂
0.7%,在28℃暗培养条件下共培养2~4d
8、 将经过共培养的外植体体转移到加有100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素的愈伤诱导培养基上(同上),在光照为2000lx、25℃条件下进行选择培养
9、继代选择培养选择培养2-3周后,外植体将产生抗性愈伤__,将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养
10、将愈伤__转移到附加选择压(同上)诱导培养基MS+KT
2.0+IAA
0.5+蔗糖3%+琼脂
0.7%上诱导生芽
11、生根培养两周后分化出芽,从基部将芽切下,转至含有选择压的生根培养基上MS+IAA
0.1+蔗糖3%+琼脂
0.7%,诱导生根生根后的植株移入温室内栽培
五、思考题卡那霉素、羧苄青霉素在培养过程中各起什么作用?步骤2中如果不加入卡那霉素会影响实验结果吗?___? 实验__一细胞原代培养
一、实验目的与意义学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞原代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础,并进一步学习无菌操作技术将动物机体的各种__从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养
二、实验器材CO2培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、棉球、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)
三、实验药品及材料胎鼠或新生鼠、1640培养基(含20%小牛血清)、
0.25%胰酶、胎牛血清、Hank’s液(见附注)、碘酒、酒精
四、实验步骤
(一)胰酶消化法
1、将妊娠10~14d的母鼠或新生小鼠拉颈椎致死,置75%酒精泡2-3s(时间不能过长、以免酒精从口和__浸入体内)再用碘酒消毒腹部,取胎鼠带入超净台内(或将新生小鼠在超净台内)解剖取肝脏,置平皿中
2、用Hank’s液洗涤三次,并剔除脂肪,结缔__,血液等杂物
3、用手术剪将肝脏剪成小块(1mm2),再用Hank’s液洗三次,转移至小青霉素瓶中
4、视__块量加入5—6倍的
0.25%胰酶液(称取所需胰蛋白酶,加入无菌的D-Hanks溶液中,用1mol/L的NaOH溶液调节pH值至
7.2~
7.4,过滤除菌,分装,-20℃冻存备用),37℃中消化20—40min,每隔5min振荡一次,或用吸管吹打一次,使细胞分离
5、加入3—5ml含5%FBS(胎牛血清)的Hank’s液以终止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制剂)
6、静置5—10min,使未分散的__块下沉,取悬液加入到离心管中
7、1000rpm,离心10min,弃上清液
8、加入Hank’s液5ml,冲散细胞,再离心一次,弃上清液
9、加入培养液l—2ml(视细胞量),血球计数板计数
10、将细胞调整到5×105/ml左右,转移至25ml细胞培养瓶中,37℃下培养 上述消化分离的方法是最基本的方法,在该方法的基础上,可进一步分离不同细胞细胞分离的方法各实验室不同,所采用的消化酶也不相同(如胶原酶,透明质酶等)
(二)__块直接培养法自上方法第3步后,将__块转移到培养瓶,贴附与瓶底面翻转瓶底朝上,将培养液加至瓶中,培养液勿接触__块入37℃静置3—5h,轻轻翻转培养瓶,使__浸入培养液中(勿使__漂起),37℃继续培养注意事项
1、自取材开始,保持所有__细胞处于无菌条件细胞计数可在有菌环境中进行
2、在超净台中,__细胞、培养液等不能暴露过久,以免溶液蒸发
3、凡在超净台外操作的步骤,各器皿需用盖子或橡皮塞,以防止细菌落入
4、根据__类型选择适当的消化液,控制消化时间,尽量减少细胞损伤
五、思考题比较__培养法和消化培养法获得原代培养物的效果和优缺点 附注
(1)D-Hank’s液配方KH2PO
40.06g,Nacl
8.0g,NaHCO
30.35g,KCl
0.4g,葡萄糖
1.0g,Na2HPO4·H2O
0.06g,加H2O至1000ml
(2)Hanks溶液配方CaCl
20.14g、KCl
0.4g、KH2PO
40.06g、M__l
2.6H2O
0.10g、MgSO
4.7H2O
0.10g、NaCl
8.0g,NaHCO
30.35g、葡萄糖
1.0g、Na2HPO4·7H2O
0.09g、加H2O至1000ml注Hank’s液可以高压灭菌,4℃下保存实验__二细胞传代培养
一、实验目的与意义 以原代培养的小鼠胎儿细胞为材料,学习动物细胞培养中最常用的消化法进行细胞传代培养的实验过程,为细胞纯化、冷冻保存、生长曲线的测定和细胞活性检查等实验奠定基础细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也使细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养) 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法,同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程悬浮型细胞传代培养直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶
二、实验器材 超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜,培养箱、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、滤膜
三、实验药品Hanks液、D-Hanks液、胰蛋白酶、NaOH、1640培养基
四、实验步骤
1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去,用2mlHanks液清洗一次
2、加入
0.5—1ml
0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中
3、瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去(约需3min),加入10mlHanks培养液终止消化观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化一般室温消化时间约为1—3min注意加Hanks液冲洗细胞时,动作要轻,以免把已松动的细胞冲掉
4、加入5ml的培养液,用吸管吸取培养液将贴壁的细胞吹打成悬液,吹打勿用力过猛,以免伤害细胞
5、将悬浮液分成等份接种到另外两到三瓶中,加培养液到3ml,塞好橡皮塞,置37℃下继续培养每三天换液一次,观察贴壁生长情况
五、思考题什么是细胞株?什么是细胞系?两者相同吗? 实验__三细胞的冻存和复苏
一、实验目的与意义了解细胞冻存的常用方法和复苏方法,为以后的综合实验奠定基础 在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内环境和外环境中的水都会形成冰晶,从而导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等,甚至引起细胞死亡如向培养液加入保护剂,可使冰点降低在缓慢的冻结条件下,能使细胞内水份在冻结前透出细胞,贮存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成 细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损不大 目前常用的保护剂为二甲基亚砜(DMSO)和甘油,它们对细胞__性,分子量小,溶解度大,易穿透细胞
二、实验器材液氮罐、冻存管(塑料螺口专用冻存管或安瓿瓶)、离心管、吸管、离心机、水浴锅、血球记数板
三、实验药品25%胰酶、1640培养基、甘油、二甲基亚砜(DMSO)
四、操作步骤
(一)冻存
1、消化细胞(同上实验),将细胞悬液收集至离心管中
2、1000rpm离心10min,弃上清液用Hanks液清洗1-2次
3、 淀用配制好的Hanks液+20%胎牛血清+10%甘油或D__O的细胞冻存液稀释,计数,调整至5×106/ml左右
4、将悬液分至冻存管中,每管1ml
5、将冻存管口封严如用安瓿瓶则火焰封口,封口一定要严,否则复苏时易出现爆裂
6、 贴上标签,写明细胞种类,冻存日期冻存管外拴一金属重物和一细绳
7、 按下列顺序降温室温→4℃(20min)→冰箱冷冻室(30min)→低温冰箱(-30℃1h)→气态氮(30min)→液氮注意冷冻操作和添加液氮时要注意戴保护眼镜和手套,以免液氮伤人,切勿用裸手直接接触液氮,以免冻伤液氮定期检查,在液氮挥发1/2时要及时补充,绝对不能挥发干净,一般30L的液氮能用1~
1.5月留在液氮罐外的系线要做好标记并做到沿着罐口顺序摆放
(二)复苏
1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏,内装三分之二37℃的温水
2、从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中并不断搅动使冻存管中的冻存物在1min之内融化
3、用酒精棉球消毒冻存管表面,打开冻存管,将细胞悬液吸到离心管中并立即加入5倍以上的Hanks液
4、1000rpm离心10min,弃去上清液
5、沉淀加10ml培养液,吹打均匀,再离心10min,弃上清液
6、加适当培养基调整细胞浓度5×105后将细胞转移至培养瓶中,37℃、5%二氧化碳、饱和湿度下培养,第二天观察生长情况
五、思考题在冷冻过程中___要用慢速冷冻的方法,而不采用将细胞放入液氮中的超速冷冻方法复苏时则相反,___? 实验__四细胞的__指数
一、实验目的与意义学习和掌握细胞__指数的测定方法体外培养细胞生长、__繁殖的能力,可用__指数来表示它与生长曲线有一定的__,如随着__指数的不断提高,细胞也就进入了指数生__ __指数指细胞群体中__细胞所占的百分比,它是测定细胞周期的一个重要指标,也是不同实验研究选择细胞的重要依据
二、实验器材CO2培养箱、超净工作台、卡氏培养瓶、废液缸、酒精灯、吸管、普通显微镜、细胞培养血、盖玻片
三、实验药品PBS液(见附注)、甲醇、冰醋酸、Hanks液、D-Hanks液、胰蛋白酶、NaOH、1640培养基、Giemsa染液
四、操作步骤
1、消化细胞(参见实验__二),将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中
2、CO2培养箱中培养48h,使细胞长在盖片上
3、取出盖片,按下列顺序操作PBS漂洗3min→甲醇冰醋酸
(31)固定液中固定30min→Giemsa液染色10min→自来水冲洗
4、盖片晾干后反扣在载玻片上,镜检
5、计算__指数=__细胞数/总细胞数×100%注意事项操作时动作要轻,以免使盖片上的细胞脱落
五、思考题影响__指数大小的因数有哪些? 附注
(1)PBS溶液的配制KCl
0.2g、KH2PO
40.2g、NaCl8g,Na2HPO4·7H2O
1.56g、加H2O至1000ml
(2)Giemsa染液配制称Giemsa粉末
0.5克,加几滴甘油研磨,再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)56℃中保温90—120分钟加入33ml甲醇,置棕色瓶中保存,此为Giemsa原液使用时按要求用PBS稀释,一般稀释10倍 实验__五细胞周期的测定
一、实验目的与意义 学习和掌握细胞周期的测定方法细胞周期指细胞一个世代所经历的时间从一次细胞__结束到下一次__结束为一个周期细胞周期反映了细胞增殖速度 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法,但它不能代表细胞群体的周期,故现多采用其它方法测群体周期 测定细胞周期的方法很多,有同位素标记法、细胞计数法等,这里介绍一种利用BrdU渗入测定细胞周期的方法 BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷)加入培养基后,可做为细胞DNA__的原料,经过两个细胞周期后,细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2,反映在染色体上应表现为一条单体浅染如经历了三个周期,则染色体中约一半为两条单体均浅染,另一半为一深一浅细胞如果仅经历了一个周期,则两条单体均深染计__相中各期比例,就可算出细胞周期的值
二、实验器材显微镜、离心机、恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、吸管、离心管、培养瓶、紫外灯
三、实验药品BrdU(
1.0mg/ml),甲醇、冰醋酸,Giemsa染液,秋水仙素,2×SSC液、二甲苯、中性胶
四、操作步骤
1、细胞生长至指数期时,向培养液中加入BrdU,使最终浓度为10μg/ml
2、44h后加秋水仙素,使每ml中含
0.1μg
3、48h后常规消化细胞至离心管中,注意培养上清的漂浮细胞也要收集到离心管中
4、逐滴向离心沉淀中加入预热至37℃的
0.075mol/LKCl溶液5~10ml,用吸管轻轻吹打均匀,在恒温水浴箱中静置20~30min
5、预固定向悬液中加固定液1ml,用吸管吹打均匀
6、固定1000r/min离心10min,弃上清,沿管壁缓慢加入新鲜固定液8~10ml,用吸管轻轻吹打均匀,固定15~20min
7、再固定离心弃上清,缓慢加入新鲜固定液8~10ml,固定30min,再离心,弃上清,视细胞量再加入新鲜固定液
0.5~1ml,吹打均匀
8、制片取冰箱中冷冻的载玻片一张,载玻片表面出现细微水气时,距载玻片约50cm高度,向载玻片滴2~3滴细胞悬液
9、染色体玻片置56℃水浴锅盖上,铺上2×SSC液,距紫外灯管6cm处紫外照射30min
10、弃去2×SSC液,流水冲洗
11、Giemsa液染色10min,流水冲洗,晾干
12、镜检100个__相,计第
一、
二、
三、四细胞期__指数
13、计算细胞周期(Tc)=48/{(M1+2M2+3M3+4M4)/100}(小时)
五、思考题
1. 制备染色体时___使用冰箱中冷冻的载玻片而非室温下放置的栽玻片?
2. 在观察染色体时,固定过程分为预固定、固定、再固定三步,作用有何不同?附注1、BrdU配制:BrdU10mg十双蒸水10ml,4℃下避光保存2、2×SSC配制:NaCl
1.75克,柠檬酸三钠·2H2O
0.88克,加水至100ml,4℃保存 附表一常用洗液的配制与适用范围名称化学成分及配置方法适用范围说明铬酸洗液用5g~10gK2Cr2O7溶于少量热水中,冷后徐徐加入100mL浓硫酸,搅动,得暗红色洗液,冷后注入干燥试剂瓶中盖严备用有很强的氧化性,能浸洗去绝大多数污物可反复使用,呈墨绿色时,说明洗液已失效成本较高有腐蚀性和毒性,使用时不要接触皮肤及衣物用洗刷法或其他简单方法能洗去的不用此法碱性高锰酸钾洗液取4g高锰酸钾溶于少量水后,加入100mL10%的NaOH溶液混匀后装瓶备用洗液呈紫红色有强碱性和氧化性,能浸洗去各种油污洗后若仪器壁上面有褐色二氧化锰,可用盐酸或稀硫酸或亚硫酸钠溶液洗去可反复使用,直至碱性及紫色消失为止磷酸钠洗液取57gNa__O4和
28.5gC17H33COONa溶于470ml水洗涤碳的残留物将待洗物在洗液中泡若干分钟后涮洗硝酸-过氧化氢洗液15%~20%硝酸和5%过氧化氢混合浸洗特别顽固的化学污物贮于棕色瓶中,现用现配,久存易分解强碱洗液5%~10%的NaOH溶液(或Na2CO
3、Na__O4溶液)常用以浸洗普通油污通常需要用热的溶液浓NaOH溶液黑色焦油、硫可用加热的浓碱液洗去 强酸溶液稀硝酸用以浸洗铜镜、银镜等洗银镜后的废液可回收AgNO3稀盐酸浸洗除去铁锈、二氧化锰、碳酸钙等 稀硫酸浸除铁锈、二氧化锰等 有机溶剂 苯、二甲苯、丙酮等用于浸除小件异形仪器,如活栓孔、吸管及滴定管的尖端等 成本高一般不要使用附表二常用的培养基配方(浓度单位mg/L)
一、Tukey
(1934)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO3300MgSO
4.7H2O370CaCl2375KH2PO4414
二、Nitsch
(1951)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度Ca(NO3)
2.4H2O500MnSO
4.4H2O3Na2MoO
4.2H2O
0.025KNO3125ZnSO
4.7H2O
0.05柠檬酸铁10MgSO
4.7H2O125H__O
30.5蔗糖20000KH2PO4125CuSO
4.5H2O
0.025琼脂_____ pH
6.0
三、Rijven
(1952)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度CaNO
32.4H2O168MnSO
4.4H2O
0.4CuSO
4.5H2O
0.1KNO3149H__O
30.4NH42MoO
40.05MgSO
4.7H2O101ZnSO
4.7H2O
0.2柠檬酸铁)50用
0.01mol/L磷酸缓冲液稀释到1L四.Heller
(1953)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度CaCl
2.2H2O75NaH2PO
4.H2O125CoCl
2.6H2O
0.03MgSO
4.7H2O250KCl750NiCl
2.6H2O
0.03ZnSO
4.7H2O
1.0KI
0.01FeCl
3.6H2O
1.0CuSO
4.5H2O
0.03H__O
31.0蔗糖20000NaNO3600MnSO
4.4H2O
0.1
五、Randolph£Cox
(1960)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO385Ca(NO3)
2.4H2O
236.8NaPO5n10KCl65MgSO
4.7H2O36FeSO
4.7H2O2
六、Tulecke
(1960)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO380Na2SO4200ZnSO
4.7H2O
0.5KCl65NaH2PO
4.H2O165CuSO
4.5H2O
0.025Ca(NO3)
2.4H2O280柠檬酸铁2Na2MoO
4.2H2O
0.025MgSO
4.7H2O730MnSO
4.4H2O3H__O
30.1
七、Straus
(1960)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO380NaH2PO
4.H2O165CuSO
4.5H2O
0.025KCl65柠檬酸铁10Na2MoO
4.2H2O
0.025Ca(NO3)
2.4H2O325MnSO
4.4H2O3H__O
30.5MgSO
4.7H2O530ZnSO
4.7H2O
0.5 Na2SO4200NiSO
4.H2O
0.044
八、Rangaswamy
(1961)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO380MnSO
4.4H2O3烟酸
1.25Ca(NO3)
2.4H2O260H__O
30.5甘氨酸
7.5KCl65ZnSO
4.7H2O
0.5盐酸吡哆素
0.25MgSO
4.7H2O360Na2MoO
4.2H2O
0.05盐酸硫胺素
0.25Na2SO4200CuSO
4.5H2O
0.05泛酸钙
0.25NaH2PO
4.H2O165柠檬酸铁10蔗糖20000
九、MS培养基药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO31650MnSO
4.4H2O
22.3甘氨酸2KNO31900ZnSO
4.7H2O
8.6烟酸
0.5KH2PO4170H__O
36.2盐酸吡哆素
0.5MgSO
4.7H2O370KI
0.83盐酸硫胺素
0.4CaCl
2.2H2O440Na2MoO
4.2H2O
0.25肌醇100FeSO
4.7H2O
27.8CuSO
4.5H2O
0.025蔗糖30000Na2EDTA
37.3CoCl
2.6H2O
0.025琼脂8000
十、White1963药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO380NaH2PO
4.H2O
16.5甘氨酸3Ca(NO3)
2.4H2O300Fe2(SO4)
32.5烟酸
0.3MgSO
4.7H2O720MnSO
4.4H2O7肌醇100Na2SO4200ZnSO
4.7H2O3蔗糖20000KCl65H__O
31.5琼脂8000CuSO
4.5H2O
0.001盐酸吡哆素
0.1pH
5.6MoO
30.0001盐酸硫胺素
0.1
十一、N6培养基药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO32830ZnSO
4.7H2O
1.5盐酸硫胺素
1.0NH42SO4460H__O
31.6盐酸吡哆醇
0.5MgSO
4.7H2O185Na
2.EDTA
37.3烟酸
0.5KH2PO4400FeSO
4.7H2O
27.8蔗糖50000CaCl
2.2H2O166KI
0.8琼脂8000MnSO
4.4H2O
4.4甘氨酸
2.0pH
5.8
十二、Knop药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO3250MgSO
4.7H2O250蔗糖20000CaNO
32.4H2O1000KH2PO4250
十三、Miller药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31000ZnSO
4.7H2O
1.5甘氨酸2NH4NO31000Na-Fe-EDTA32盐酸硫胺素
0.1KH2PO4300MnSO
4.4H2O
4.4盐酸吡哆醇
0.1KCl65KI
1.6蔗糖30000CaNO
32.4H2O347H__O
31.6琼脂8000MgSO
4.7H2O35烟酸
0.5pH
5.8
十四、Nitsch1972药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO3950H__O310甘氨酸2NH4NO3720Na2MoO
4.2H2O
0.25盐酸硫胺素
0.5CaCl
2.2H2O166CuSO
4.5H2O
0.025盐酸吡哆醇
0.5MgSO
4.7H2O185Na
2.EDTA
37.75叶酸
0.5KH2PO468FeSO
4.7H2O
27.85生物素
0.05MnSO
4.4H2O25肌醇100蔗糖20000ZnSO
4.7H2O10烟酸5琼脂8000
十五、MT药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31650H__O
36.2烟酸5NH4NO31900KI
0.83甘氨酸2MgSO
4.7H2O370Na
2.EDTA
37.3盐酸硫胺素10KH2PO4170FeSO
4.7H2O
27.8盐酸吡哆醇10CaCl
2.2H2O440CuSO
4.5H2O
0.025蔗糖30000MnSO
4.4H2O
22.3CoCl
2.6H2O
0.025 ZnSO
4.7H2O
8.6肌醇100
十六、Norstog药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO3160H__O
30.5盐酸硫胺素
0.25CaNO
32.4H2O290CuSO4·5H2O
0.25烟酸
1.25Na2MoO4·2H2O
0.25MnSO4·4H2O3泛酸钙
0.25Na2SO4200NaH2PO
4.H2O800蔗糖90000KCl140ZnSO4·7H2O
0.5琼脂9000MgSO
4.7H2O730CoCl2·6H2O
0.25 柠檬酸铁10盐酸吡哆醇
0.25
十七、Tulecke1964药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO380Na2SO4200CoCl2·6H2O
0.01NaNO31800NaH2PO
4.H2O300CuSO4·5H2O
0.02KCl900柠檬酸铁5MoO
30.01CaNO
32.4H2O280MnSO4·4H2O
0.8KI
0.5MgSO
4.7H2O760ZnSO4·7H2O
0.5H__O
30.2
十八、JasparsVeldstra
(1965)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31000MnSO4·4H2O
1.0MgSO
4.7H2O250CaCl2·2H2O120ZnSO4·7H2O
0.05H__O
30.025KI
0.25NiCl
2.6H2O
0.025H2SO4(66%)
0.0005mlKH2PO4700CoCl2·6H2O
0.025 Fe2(SO4)
32.5CuSO4·5H2O
0.025 __、LS培养基(Lin__aier和Skoog,1965)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO31650FeSO
4.7H2O
27.8CuSO
4.5H2O
0.025Na2MoO4·2H2O
0.25MnSO
4.4H2O
22.8CoCl
2.6H2O
0.025KH2PO4170ZnSO
4.7H2O
8.6盐酸硫胺素
0.4MgSO
4.7H2O370H__O
36.2肌醇100CaCl
2.2H2O440KI
0.83蔗糖30000Na
2.EDTA
37.3KNO31900琼脂8000__、ER(Eriksson,1965)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO31200H__O
30.63CoCl
2.6H2O
0.0025KNO31900MnSO
4.4H2O
2.23Fe-Na2EDTA5ml/LCaCl
2.2H2O440Zn(螯合的)15蔗糖40000MgSO
4.7H2O370Na2MoO4·2H2O
0.025pH
5.8KH2PO4340CuSO
4.5H2O
0.0025 __
一、WS
(1966)(Woiter和Skoog,1966)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO350Ca(NO3)
2.4H2O425MnSO
4.4H2O
27.8KCl140NaH2PO
4.H2O35ZnSO4·7H2O9KNO3170Na
2.EDTA
37.75KI
3.2Na2SO4425FeSO
4.7H2O
27.85H__O
31.6__
二、Gamborg
(1966)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31000Na(PO5)n30CuSO
4.5H2O
0.25NH42SO4200FeSO
4.7H2O
13.90CoCl
2.6H2O
0.25KCl300Na
2.EDTA
18.6KI
0.75CaCl
2.2H2O150MnSO
4.4H2O10H__O33MgSO
4.7H2O250ZnSO
4.7H2O3 NaH2PO
4.H2O90Na2MoO4·2H2O
0.25 __
三、H(Bourgig和Nitsch,1967)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO3950H__O310甘氨酸2NH4NO3720Na2MoO4·2H2O
0.25盐酸硫胺素
0.5MgSO
4.7H2O185CuSO
4.5H2O
0.025盐酸吡哆醇
0.5CaCl
2.2H2O166FeSO
4.7H2O
27.8叶酸
0.5KH2PO468Na
2.EDTA
37.3生物素
0.05MnSO
4.4H2O25肌醇100蔗糖20000ZnSO
4.7H2O10烟酸5pH
5.5__
四、T(Bourgin和Nitsch,1967)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31900MnSO
4.4H2O25CuSO
4.5H2O
0.025NH4NO31650FeSO
4.7H2O
27.8蔗糖_____MgSO
4.7H2O370Na
2.EDTA
37.3琼脂8000CaCl
2.2H2O440H__O310pH
6.0KH2PO4170Na2MoO4·2H2O
0.25 __
五、Borchert
(1967)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO31000NaH2PO
4.H2O350CuSO
4.5H2O
0.09NaNO31000FeCl
3.6H2O3AlCl
30.09KCl1000MnSO
4.4H2O
0.3KI
0.03CaCl
2.2H2O200ZnSO
4.7H2O3H__O33MgSO
4.7H2O1500NiCl
2.6H2O
0.09 __
六、B5培养基(Gamborg等,1968)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NaH2PO
4.H2O150MnSO
4.4H2O10盐酸硫胺素10KNO33000H__O33盐酸吡哆素1NH42SO4134ZnSO
4.7H2O2烟酸1MgSO
4.7H2O500Na2MoO
4.2H2O
0.25肌醇100CaCl
2.2H2O150CuSO
4.5H2O
0.025蔗糖20000FeSO
4.7H2O
27.8CoCl
2.6H2O
0.025琼脂_____Na
2.EDTA
37.3KI
0.75pH
5.5__
七、Tripathi
(1969)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NaNO31200FeCl
3.6H2O
0.3CuSO
4.5H2O
0.002CaCl
2.2H2O300MnSO
4.4H2O
0.02AlCl
30.006MgSO
4.7H2O250ZnSO
4.7H2O
0.3KI
0.01NaH2PO
4.H2O250NiCl
2.6H2O
0.06H__O
30.1__
八、SH培养基(Schenk和Hildebrandt,1972)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO32500H__O
35.0CoCl2·6H2O
0.1CaCl
2.2H2O200MnSO
4.4H2O10Na2-EDTA 20MgSO
4.7H2O400ZnSO
4.7H2O10FeSO4·7H2O15NH4H2PO4300Na2MoO4·2H2O
0.1蔗糖30000KI
1.0CuSO
4.5H2O
0.2PH
5.8__
九、C171986药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO3300Na
2.EDTA
37.3烟酸
0.5KNO31400MnSO
4.4H2O
11.2盐酸吡哆醇
0.5KCl150ZnSO4·7H2O
8.6盐酸硫胺素
1.0CaCl
2.2H2O150CoCl
2.6H2O
0.025生物素
1.5MgSO
4.7H2O150CuSO
4.5H2O
0.025甘氨酸
2.0KH2PO4400Na2MoO4·2H2O
0.012蔗糖90000NaH2PO
4.H2O100KI
0.83琼脂7000FeSO
4.7H2O
27.8H__O
36.2pH
5.8
三十、DPD(Durand,J.Et.,1973)药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO3270Na2MoO4·2H2O
0.1盐酸硫胺素
4.0KNO31480H__O
32.0肌醇100MgSO
4.7H2O340ZnSO4·7H2O
1.5叶酸
0.4CaCl
2.2H2O570CuSO
4.5H2O
0.015甘氨酸
1.4KH2PO480CoCl
2.6H2O
0.01生物素
0.04Na
2.EDTA
37.3KI
0.25甘露醇55000FeSO
4.7H2O
27.8烟酸
4.0蔗糖17100MnSO
4.4H2O
7.2盐酸吡哆醇
0.7pH
5.6
三十一、NT培养基药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO3825MnSO
4.4H2O
22.3肌醇100KNO3950ZnSO4·7H2O
8.6盐酸硫胺素1CaCl
2.2H2O220KI
0.83NAA3MgSO
4.7H2O1233H__O
36.2甘露醇
0.7mol/LKH2PO4680Na2MoO4·2H2O
0.25蔗糖_____Na
2.EDTA
37.3CuSO
4.5H2O
0.025pH
5.8FeSO
4.7H2O
27.8CoSO
4.7H2O
0.03
三十二、KMP8药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO31900葡萄糖68400对氨基苯甲酸
0.02NH4NO3600蔗糖250维生素A
0.01CaCl
2.2H2O600果糖250维生素D
30.01MgSO
4.7H2O300核糖250维生素B
120.02KH2PO4170木糖250柠檬酸40KCl300甘露醇250苹果酸40MnSO
4.H2O
10.0鼠李糖250延胡索酸40KI
0.75纤维二糖250丙酮酸钠20CoCl
2.6H2O
0.025山梨醇250椰子乳20mlZnSO4·7H2O
2.0抗坏血酸2酪蛋白氨基酸250CuSO
4.5H2O
0.025氯化胆碱1肌醇100H__O
33.0泛酸钙1烟酸1Na2MoO4·2H2O
0.25叶酸
0.4盐酸吡哆醇1Na
2.EDTA
37.3核黄素
0.2盐酸硫胺素
1.0FeSO
4.7H2O
27.8生物素
0.01pH
5.6
三十三、D2a药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度NH4NO3270KI
0.25盐酸吡哆醇
0.7KNO31480H__O
32.0盐酸硫胺素
4.0CaCl
2.2H2O900Na2MoO4·2H2O
0.1甘氨酸
1.4MgSO
4.7H2O900CuSO
4.5H2O
0.015椰子汁5%KH2PO480CoCl
2.6H2O
0.01葡萄糖72000Na
2.EDTA
37.3肌醇100蔗糖17100FeSO
4.7H2O
27.8烟酸
4.0pH
5.7MnSO
4.4H2O
5.0叶酸
0.4 ZnSO4·7H2O
1.5生物素
0.04
三十四、Street’s药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度Ca(NO3)
2.4H2O288Na
2.EDTA
37.3ZnSO4·7H2O
2.65KNO380FeSO
4.7H2O
27.8KI
0.75KCl65Na2SO
4453.4H2MoO
40.001MgSO
4.7H2O740H__O
31.5MnCl
2.4H2O
6.0NaH2PO
4.H2O
21.5CuSO
4.5H2O
0.02
三十五、Halperin’s药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度MgSO
4.7H2O185ZnSO4·7H2O
4.05CuSO
4.5H2O
0.01CaCl
2.2H2O166H__O
32.4Na2-EDTA
18.6KH2PO468KI
0.375FeSO4·7H2O
13.9MnSO
4.4H2O7NH42MoO4·4H2O
0.0925
三十六、W14药品名称浓度药品名称浓度药品名称浓度KNO32000MnSO
4.4H2O
8.0甘氨酸2NH4H2PO4380ZnSO4·7H2O
3.0盐酸硫胺素2KH2PO4400H__O
33.0盐酸吡哆醇
0.5CaCl
2.2H2O140KI
0.5烟酸
0.5MgSO
4.7H2O200Na2MoO4·2H2O
0.005蔗糖1_____FeSO
4.7H2O
27.8CuSO
4.5H2O
0.025琼脂5000Na2EDTA
37.3CoCl
2.6H2O
0.025pH
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