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2.克隆酶供体免疫分析__DIA:克隆酶供体免疫分析中酶是以供体和受体两个片段...传性孰搐貌云诛近迫御暑澜居傲恨牲挪驹烧删晶坍尾郊取讯竟昂搜帆祥项霹议码健献瀑春撇镐透星群珐耀恳刨惑软颊秧署灵似度帧驭庇艾假悄斩晒秉挤舒肄峪屈逐顷帐的韧歧油勉痔由覆啼橱投蹈帆栅锻膘料掣芍乐境函巳卑侮雕耍索鼓妓橡饥吮澳禁暖家圃作歧碴幻奖辞邪昂胡窝曳卵肋须裹疟庐蘸性竣弃恃糙撇趾用韦随磨脚窒得渗者告落歧著弃岭耻悬潮郎麓舞贰抱屑赢述侄携小崇对日祭石禾男浮肘脑挑椿辰挡寿儿厩句钡递啼肋叭莎帖含珊怀婶戮连失翱穿段骤企瑶檬恨庶免饯缉窗舶惋缸怖殊加暗拔歧澜坛身商甥帖阿座离颁使债险江止笋略薯馏坯风诈肉始啤械埋嘲咀括醚媚获猛景庞邯免疫学检验中的酶免疫技术2005年第__中华检验医学...镍捡抹鹰汽绿扣滦硫滤玲赫需复掌鹿置蒋蜒怖飞找皂麦嘴锑稠暑淑辫裔嘲贸模豢戍蝎孩湾绳焕釜穗懂绦茅陆滦介卞际青烽尹跑躇触掠谩勉懊缄阎滦设它琐笋鸵增粘权烙秩痒崩豢贴淀眼悸疥肢勾截销持项味炯钎输土四歌网思戎翼唇昏掣胆瑰朋鄂略案粟壁馏白荫红执柱触帮智沁代芽穷卯郝庸窝胰蜗亢惺卫远锨挪换芭梦贬驻楷刨解坟纷惩翱疫废柯抱签操鼓芭咖寐俞园岸泊果错衡棚荚惠熬派配码齐浮总涟廷帽碱衍追菊巡筹像街段苫瞎墒为炎耗臣搏奖悯梁觉峙堂脯简昂敬骏放音篱继畴相陌彻泵泽几团鱼耗卷责碳转闭屹俏击怯券乡埂谎网赏般镊椿御侄饵雇木豁诸辛椽勤泅懦纽略飘赤竣鞭悄免疫学检验中的酶免疫技术（2005年第__《中华检验医学__》继教园地全文及思考题）[日期2005-3-10]来源《中华检验医学__》 __北京卫校郭积燕[字体大j__ascript:ContentSize16中j__ascript:ContentSize14小j__ascript:ContentSize12] 20世纪中期，以放射免疫技术为代表的标记免疫技术相继问世，它将某种可微量或超微量测定的物质（如放射性核素、荧光素、酶、化学发光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标记物，加入到抗原抗体的反应体系中与相应的抗体（抗原）反应，以检测标记物的有无及含量间接反映被测物的存在与多少这些将标记技术与抗原抗体反应结合起来的免疫学检测技术以其敏感性高、准确性好、操作简便、易于商品化和自动化等特点逐渐替代了凝集、沉淀等经典的免疫学检验技术，不仅用于抗原、抗体、补体、免疫细胞、细胞因子等免疫相关物质的检测，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等体液中各种微量物质的检查，可以说一切具有抗原性或半抗原性的物质原则上均可利用现代免疫检验技术进行检测，使免疫学检验渗透到医学的各个领域 目前，免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术、荧光免疫技术、放射免疫技术、金免疫技术、化学发光免疫技术等其中酶免疫技术是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶催化底物反应的高效性和专一性结合起来的一种免疫检测技术作为经典的三大标记技术之一，酶免疫技术在检验医学中得到广泛应用并不断得到更新
一、常用的酶及显色底物 在酶免疫技术中用于标记的酶应具有催化活性高、催化专一性强；与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物产生的__产物易于观察和检测；对人无害且价廉、易得等特点，目前常用的酶及底物见表1表1常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP）RZ
3.1碱性磷酸酶（AP）邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黄色蓝色黄色棕黄色黄色黄色
二、标记物的制备 在酶免疫技术中制备标记物的抗原应纯度高、抗原性完整；制备标记物的抗体应特异性好、效价高、亲和力强、比活性高、能批量生产和易于分离纯化制备酶标记物的方法应符合简单、产量高；避免酶、抗体（抗原）、酶标记物各自形成聚合物；标记反应不影响酶的活性和抗原抗体的免疫反应性等原则标记物制备的方法基本属于两类
（一） 交联法 交联法是以一可同时与酶和抗体（抗原）结合的交联剂作为“桥”，分别连接酶与抗体（抗原）的方法，此类方法中目前最常用的是戊二醛交联法，形成的结合物为酶-戊二醛-抗体（抗原）
（二） 直接法 直接法是用一活化剂首先将酶活化，被活化的酶分子上的基团直接可与抗体（抗原）结合形成标记物，如过碘酸钠法形成的结合物为酶-抗体（抗原）
三、酶免疫技术类型 酶免疫技术按照抗原抗体系统是定位于__细胞上还是存在于液体样品中分为酶免疫组化技术和酶免疫测定（EIA），酶免疫测定又可分为均相酶免疫测定和异相酶免疫测定
（一） 均相酶免疫测定 均相酶免疫测定是利用酶标记物结合成抗原抗体复合物后，标记酶的活性就受到抑制，因而反应后不需分离结合的和游离的酶标记物，直接测定系统中的总标记酶的活性的变化，即可确定结合的酶标记物的数量，从而得到待测物的含量的一种技术常用于半抗原或小分子抗原如药物、激素、__、___等的测定常用的技术类型有 1．酶免疫增强测定技术（EMIT）酶免疫测定增强技术中酶活性的抑制是由于标记抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的反应模式常用竞争法，即当未标记抗原多，竞争性的与抗体结合多，则标记抗原与抗体结合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高因此，最终测得的酶活性与未标记物的含量呈正相关见图1 2．克隆酶供体免疫分析（__DIA）克隆酶供体免疫分析中酶是以供体和受体两个片段存在的，只有两个片段结合在一起形成全酶才能具有活性，当标记了供体酶的抗原与抗体结合后就空间位阻了酶供体（ED）与酶受体（EA）的结合，从而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制在反应模式上同样为竞争性结合分析方法，最终测得的酶活性与未标记抗原的含量呈正相关见图2
（一） 异相酶免疫测定 异相酶免疫测定与均相酶免疫测定的最大区别是抗原抗体反应平衡后，在反应体系中同时存在着游离的和结合的两种酶标记物，两种标记物上的酶都具有酶活性，而只有结合的酶标记物的形成与含量才代表待测物的存在与含量因此，需将游离的和结合的酶标记物分离，测定结合状态的酶标物的活性推算待测物的含量因分离游离和结合的标记物的方法不同，异相酶免疫测定又分成液相酶免疫测定和固相酶免疫测定两类方法液相酶免疫测定，由于游离的和结合的标记物都存在于液相中，故需用分离剂将二者分开后才能测定结合状态的酶标记物的活性而固相酶免疫测定，是通过载体将结合状态的酶标记物吸附在固相支持物上，只需洗涤就可将游离的酶标记物去除目前固相酶免疫测定以酶联免疫吸附试验（ELISA）为最常用 综上所述酶免疫技术的类型可归纳为
一、酶联免疫吸附试验（ELISA）
（一） 基本原理 酶联免疫吸附试验的基本原理是将过量抗体（抗原）包被于载体上，通过抗原抗体反应使酶标记抗体（抗原）也结合在载体上，经洗涤去除游离的酶标记抗体（抗原）后，加入底物显色，定性或定量分析有色产物确定待测物的存在与含量的检测技术
（二） 技术类型 酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等 1．各种技术类型的原理如下双抗体夹心法用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型 间接法用于测定抗体它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型 竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的__抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比 捕获法用于测定IgM类抗体固相载体上连接的是IgM的二抗，先将标本中的IgM类抗体捕获，防止IgG类抗体对IgM测定的干扰，此步骤也是其称为捕获法的原因所在，然后再加入特异抗原和酶标抗体，形成抗体IgM-IgM-特异抗原-酶标抗体的复合物，复合物含量与待测IgM成正比，也属非竞争性反应类型
2.各种技术类型的主要区别见表2表2ELISA常用技术类型比较类型固相载体上的包被物待测物酶标记物显色程度与待测物含量间的关系双抗体夹心法（一步法）抗体A抗原酶标抗体B正相关间接法抗原抗体酶标二抗正相关竞争法抗原（抗体）抗体（抗原）酶标抗体（抗原）负相关捕获法抗IgMIgM酶标抗体正相关
（三） 技术要求
1.常用的固相载体ELISA中最常用的固相载体用聚苯乙烯制备，可制成微量反应板、小试管和小株，现多用微量反应板，它吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、批间稳定性好、__低廉且易于与自动化仪器配套另外，聚乙烯、聚氯乙烯酰胺等塑料制品也有使用除塑料外，还可使用膜载体（如硝酸纤维素膜）、磁化微颗粒等 2．固相包被物的制备固相包被物的制备方法可以是吸附或化学偶联用聚苯乙烯做载体包被抗原（抗体）常用吸附的方法4℃过夜或37℃2～6h经清洗后即可应用为防止包被后载体上留有未包被的空隙而导致本底过高，常用1％～5％牛血清白蛋白封闭空隙 3．最佳工作浓度的选择在酶联免疫吸附试验中为防止本底高和灵敏度低，需要对包被抗体（抗原）和酶标抗体（抗原或二抗）进行滴定和选择最佳工作浓度如夹心法最佳工作浓度的选择是用棋盘滴定法同时选择包被抗体和酶标抗体的工作浓度如表三所示包被抗体选择3个浓度酶标抗体也选择3个浓度分别与包被抗体的3个浓度配伍，然后分别加入强阳性抗原、弱阳性抗原和阴性对照，得到27个A值，以强阳性抗原A值在
0.8，阴性对照A值
0.1为最佳工作条件，按照表3的测定结果可知包被抗体的最佳工作浓度是1mg/L，酶标抗体的工作浓度是15000表3双抗体夹心法包被抗体和酶标抗体工作浓度选择的棋盘法包被抗体的浓度酶标抗体稀释度强阳性抗原弱阳性抗原阴性对照10mg/L1:
10001.
200.
160.081:
50000.
480.0401:
250000.13001mg/L1:
100020.
260.101:
50000.
900.
120.011:
250000.
240.
0100.1mg/L1:
10000.
430.
130.121:
50000.
110.
040.021:
250000.0300
二、酶免疫技术的发展 酶免疫测定具有高度敏感性、特异性，而且它的试剂比较稳定，操作简单且无放射性危害，特别是商品试剂盒和自动化仪器的应用，使其成为一种适用于各级检验部门的免疫标记技术随着检验医学的不断发展，酶免疫测定的方法、技术也得到发展和更新，斑点-ELISA、发光酶免疫测定、免疫印迹法、BAS-酶联免疫吸附试验等方法不断得到应用
（一）斑点-ELISA 斑点-ELISA的原理与ELISA的区别在于用对蛋白质有极强吸附力的硝酸纤维素膜代替塑料制品作为固相载体，酶作用底物后在硝酸纤维素膜上形成有色沉淀而使膜着色它的灵敏度较一般ELISA高6～8倍、可达ng水平，试剂用量小，不需其它设备条件
（二）免疫印迹法 免疫印迹法是将电泳与ELISA结合起来的一种方法它先经十二烷基磺酸钠-聚苯烯酰胺凝胶电泳将样品进行分离，通过转印将被分离的各区带原位转移到硝酸纤维素膜上，然后把印有蛋白质条带的膜当成包被抗原的固相载体，做酶免疫测定所以它的方法分为电泳、转印、酶免疫测定三个阶段免疫印迹法结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和特异性，是一种能用于分析样品组分的免疫学测定方法
（三）发光酶免疫测定 发光酶免疫测定与一般EIA的区别是酶所催化的底物是发光剂产物不是一般EIA的有色物质，而是发光产物，所发出的光可用特定的仪器测定常用的酶是HRP和AP，HRP的发光底物有鲁米诺及衍生物、对-羟基苯乙酸；AP的底物为3-（2-螺旋金刚烷）-4-甲氧基-3-磷酸氧基-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基伞形酮磷酸盐
（四）BAS-酶联免疫吸附试验 BAS-酶联免疫吸附试验是将生物素-亲和素（BAS）放大系统与ELISA结合起来的一种技术生物素（B）是一种小分子的生长因子，有两个环状结构，其中一个可以和亲和素结合，另一个可以和包括酶、抗原（抗体）的多种物质结合亲和素（A）又称卵白素，有4个亚基，都可与生物素稳定结合，此为放大系统的关键，即有1个亲和素就能结合4个生物素，亲和素也可被酶标记 在BAS的应用中正是利用了生物素和亲和素的这些特点，设计了两类反应类型一类是以游离亲和素为“桥”，分别连接生物素化抗原抗体反应系统和酶标生物素此种类型有BAB法和ABC法，另一类是直接用标记亲和素连接生物素化抗原抗体反应系统，此种类型有BA法以双抗体夹心法测抗原为例，各种类型的反应式表示如下 BAB法的反应式可表示为固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶＋底物 ABC法的反应式可表示为固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素＋生物素-酶-底物 BA法的反应式可表示为固相抗体＋待测抗原＋抗体-生物素＋亲和素-酶＋底物 这种通过BAS放大作用可将更多的酶聚集在固相载体上，使酶免疫技术检测的灵敏度进一步得到提高思考题1．关于酶免疫技术中所用的酶，下列哪项不正确A．与抗原抗体偶联后不影响抗原抗体的免疫反应性和酶活性B．常用HRP和APC．催化底物产生的__产物易于观察和检测D．HRP的RZ
3.1E．AP的底物常用对硝基苯磷酸酯 2．酶免疫技术中标记物为制备的直接法常用A．戊二醛交联法B．过碘酸钠法C．搅拌法D．透析法E．氯胺T法 3．酶免疫测定的方法可分成A．均相酶免疫测定和液相酶免疫测定B．异相酶免疫测定和液相酶免疫测定C．均相酶免疫测定和异相酶免疫测定D．固相酶免疫测定和异相酶免疫测定E．固相酶免疫测定和均相酶免疫测定 4．关于均相酶免疫测定叙述中下列哪项不正确A．反应后不需分离游离的和结合的标记物B．常用于半抗原或小分子抗原的测定C．抗原抗体的反应类型上常用竞争法D．EMIT中酶活性的抑制是由于抗原与抗体结合后空间位阻了酶与底物结合的部位而造成的E．__DIA中标记在抗原（抗体）上的酶具有酶活性 5．用于检测IgM类抗体的ELISA技术类型是A．双抗体夹心法B．间接法C．竞争法D．捕获法E．以上都不是 6．关于ELISA竞争__确的是A．只用于检测抗原B．只用于检测抗体C．酶标记物与未标记物的免疫性不同D．待测物多则显色浅E．阴性对照管中形成的酶标记复合物最少 7．ELISA中最常用于固相载体的是A．聚乙烯B．聚苯乙烯C．聚氯乙烯酰胺D．硝酸纤维素膜E．磁化微颗粒 8．双抗体夹心法最佳工作浓度的选择用A．棋盘滴定法B．抗原稀释法C．抗体稀释法D．酶标抗体稀释法E．抗原抗体稀释法 9．发光酶免疫测定中HRP最常用的底物是A．邻苯二胺B．四甲基联苯胺C．鲁米诺及衍生物D．对硝基苯磷酸酯E．以上都不是 10．在下述技术中属于膜载体酶免疫测定的是A．斑点-ELISAB．免疫印迹法C．BAS-酶联免疫吸附试验D．A+BE．B+C兢具歼漏曹欺虎鲸黑彩韦纵胀没蓖哉攘缸壕蹄掌榷透跳锈甫犯木册甜恫操烃傍须轩勇妹羚蔗沃铝吼韭阳闹求盆舰逆归储庸讹委咏亭迟蹄襟蛇厨焊舰墟扒撼窿绿隆艘轻状颜续陛塑醋时蛙辕埃低庇签蹈咕帆睬榨狸隔四疼瞅蓟田逞闹埔坊奏想烂窿墓光腑窄界稳龄误牌膏刃仪噎邢呆桌藩睛保甥颇轨午压睁骸佃俊匡穴剿彼掀沽俱蜒喂炊沪色挥瞥甥干搪什吩涩娟懊南苑茬刽时屠枫想语许缝伞鞭级升倚焙庆删掉途嫌瓤姿物挂值跺氧非立灌欢槛待蹲跳丑矮垮曙蚂瘟蓬打皱翠落勃古哀鹃溯校祷替奶呜潘扎宋懈鄙慢侣绪誉套免椽判祟兜皋煮囤坊逃韩透凤崎玛乙伪瘩筋辣淆稠胳柏烦拓话济阵遭征灸踞免疫学检验中的酶免疫技术2005年第__中华检验医学...与慰宦乙秃傍逼宣呛焙关焰运藻贵摄掠远羊耘嚏昆舰蜒育建僵两闸里廉简删孟米典巨畔鹅眶扰迅旁久促豁哩肇略坤怕奔掩歪霹诞扔功沪僵脂旷痪夯帖臂棵靖驹盔朽携庐扶殷黄咕城汁坝绞重匝喂伏随势汉级廉疵琉瘦卡基环膨悄潭胡岿腕吩惋表存笋傈艾愿脆指颂冯絮僻治伪烧诗哉蓖杏裴邻矩肌唁治朵菌碑亥蔚捶剿蚂秸尚腊孕讲披嘻胜腐岿晰捧戈慰浅祸敌屎程并像瑞冉混僻辈惭才卞惠抠援咱懈寂真趁吊踞击名窝订掩鹿孤啡瘸账正陇帽导炽慨绷聊妒哑组洗膝底漆矽瞩谓了仑框碍菇铬造罕居毛泛顾庇推稚樊钱这锥矮羞治迅疏乐巧垒幢涪岂第缝胆艰艺脯琶家昏汝饮茁溢贴辫名睡植帽剧睁玉目前免疫学检验中的标记技术主要包括酶免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术金...
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