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文本内容:
金华职业技术学院实验教学大纲
一、课程名称天然药物提取分离技术课程性质必修课,面向专业生物制药,课程总学时16学时
二、实验的地位、作用和目的天然药物提取分离技术实验教学是天然药物提取分离技术课程的重要组成部分,是使学生进一步理论__实际,掌握天然药物有效成分提取、分离和鉴定的基本操作技能,提高学生分析和解决问题能力,养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节
三、基本原理及课程简介天然药物提取分离技术实验中选择天然药物中几个具有代表性的成分类型作为研究对象,实验内容包括单体成分的提取、分离、鉴定等过程通过这些实验使学生继续巩固基本操作技能,灵活应用于其他天然药物成分的分离学生自己查阅有关文献,对具体的实验内容、条件提出合理建议,培养学生分析问题、解决问题和__工作的能力
四、实验方式及基本要求带习老师讲述实验原理、流程和注意事项等,由学生每人单独操作完成实验,要求学生以科学的态度和科学的作风进行实验,掌握天然药物生物活性成分的提取、分离纯化及鉴定能力,学习衍生物制备的手段及应用
五、实验报告实验报告要求学生以原始记录为基础,书面形式详实叙述每次实验的目的、原理、操作过程、现象和结果等,并以讨论的形式如实叙述实验过程中发现的问题、个人的体会、以及实验应注意的问题等每次实验报告应包含以下内容实验题目、实验目的、实验原理、实验内容、实验结果、以及讨论
六、考核及考试 本实验以学生的预习报告、原始记录、实验操作、科学作风及实验报告做为考核标准
七、基本设备与器材配置烘箱,磁力搅拌,电热套,电炉,紫外分析仪,旋转蒸发仪,真空泵,红外干燥箱,电子秤,冰柜
八、实验项目及内容提要1.槐花米中芦丁的提取分离与鉴定a.预试;b.苷的碱提取、酸沉淀;c.产品的精制;d苷的水解;e.苷、苷元的定性鉴定;f.糖的纸层析鉴定准备;g.苷的乙酰化物的制备及熔点测定;h.苷、苷元的TLC鉴定;i.糖的纸层析鉴定
2.大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定a.预试;b.氯仿浸提;c.产品的精制;d蒽醌类化合物的定性鉴定;e.蒽醌化合物的TLC鉴定;h.蒽醌纸层析鉴定3.汉防己生物碱的提取分离与鉴定a.预试;b.酸提取、碱沉淀;c.洗、烘砂80克;d.抽滤提取物,拌砂后烘干;e.铺板;f.萃取亲酯性叔胺总碱,重结晶;g.生物碱的TLC鉴定实验一槐米中芦丁的提取及鉴定
一、概述芦丁(Rutin)广泛存在于植物界中,现已发现含芦丁的植物至少在70种以上,如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有尤以槐花米(为植物Sophorajaponica的未开放的花蕾)和荞麦中含量最高,可作为大量提取芦丁的原料芦丁是由斛皮素(Quer__tin)3位上的羟基与芸香糖(Rutinose)〔为葡萄糖(Glucose)与鼠李糖(Rhamnose)组成的双糖〕脱水合成的苷芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶,含有三分子的结晶水,熔点为174~178℃,无水物188~190℃溶解度冷水中为1:_____;热水中1:200;冷乙醇1:650;热乙醇1:60;冷吡啶1:12微溶于丙酮、乙酸乙酯,不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚,溶于碱而呈黄色芦丁具有维生素P样作用有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性,主要用作防治高血压病的辅助治疗剂,亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症
二、实验目的和要求
1、实验目的
①通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作
②通过芦丁结构的检识,了解苷类结构研究的一般程序和方法
③了解UV及__R在黄酮类化合物结构鉴定中的应用
2、要求要拿到芦丁化合物
三、实验方法
(1)芦丁的提取与分离(见下图)芦丁的提取与分离流程图
(2)芦丁的鉴定
①芦丁的定性反应取芦丁3~4mg,加乙醇5~6ml使其溶解,分成三份作下述试验A.取上述溶液1~2ml,加2滴浓盐酸,在酌加少许镁粉,注意观察颜色变化情况B.取上述溶液1~2ml,然后滴加2%柠檬酸的甲醇溶液,注意观察颜色变化情况,在继续向试管中加入2%ZrOCl2的甲醇溶液,并详细记录颜色变化情况C.取上述溶液1~2ml,然后再加入10%α-等体积的萘酚乙醇溶液,摇匀,沿管壁滴加浓硫酸,注意观察两液面产生的颜色变化
②芦丁水解后糖与苷元的鉴定A.水解方法精密称取芦丁1g(±
0.01g),加1%硫酸100ml,加热40min,放冷静置,过滤所得沉淀用少许水洗除酸,干燥称重,计算苷元与糖的重量比然后用乙醇(95%大约10ml)进行重结晶,即得苷元B.苷元的鉴定用纸色谱法与对照品对照
四、实验指导1.本实验讲解要点及注意事项
①芦丁提取方法,重点介绍碱-酸法的原理及注意事项
②定性实验的目的、意义及注意事项2.实验报告要求
①碱-酸法提取芦丁的原理
②定性反应的反应机理
③详细记录定性反应结果
④绘制色谱结果模拟图,并计算Rf值3.思考题
①苷类结构的检识大体程序如何?
②苷类水解有几种催化方法?
③怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3-O-上?
④怎样证明芦丁分子中只含有一个葡萄糖基一个鼠李糖?
⑤苷元的结构是怎样确定的?
⑥怎样确定苷键的构型?
⑦芦丁的全乙酰化物的制备与苷元乙酰化物(槲皮素)的制备有何不同?___?试验二大黄中蒽醌类成分的提取分离和鉴定
一、概述大黄记载于《神农本草经》等许多文献中,用于泄下、健胃、清热、解毒等自古以来,大黄在植物性泻下药中占有重要位置,是一位很早就被各国药典所收载的世界性生药大黄的种类繁多,__大黄是蓼科植物掌叶大黄(Rheumpal__tclmL),大黄(R.officinaleBaill)及唐古特大黄(R.tangutium__xim.etRegll)的根茎及根,大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种R1R2名称晶形熔点-H-COOH大黄酸Rhein黄色针晶318~320℃-CH3-OH大黄素Emodin橙色针晶256~257℃-H-CH2OH芦荟大黄素Aloe-emodin橙色细针晶206~208℃-CH3-大黄素甲醚Physcion砖红色针晶207℃-H-CH3大黄酚Chyrsophanol金色片状结晶196℃大黄中蒽醌苷元,其结构不同,因而酸性强弱也不同大黄酸连有-COOH,酸性最强;大黄素连有β-OH,酸性第二;芦荟大黄素连有苄醇-OH,酸性第三;大黄素甲醚和大黄酚均具有18-二酚羟基,前者连有-OCH3和-CH3,后者只连有-CH3,因而后者酸性排在第四位
二、实验目的和要求1.学习缓冲纸色谱的基本操作技术,并能根据色谱结果,设计液液萃取法分离混合物的实验方案2.掌握PH梯度法的原理及操作技术3.通过磷酸氢钙柱色谱分离大黄酚及大黄素甲醚的试验,进一步熟悉柱色谱操作技术4.学习蒽醌类化合物鉴定方法
三、实验方法1.大黄总蒽醌苷元的提取注意
①大黄中的蒽醌类成分大部分与糖结合,以蒽醌的形式存在于植物__中所以要用酸水解使其生成苷元蒽醌苷元可溶于氯仿、苯及乙醚等有机溶剂,用苯时应注意苯蒸气的挥发,严防中毒;
②所得的氯仿液中如带有酸水液,应该用分液漏斗分出弃去,并用蒸馏水回洗一次除去酸性以免影响梯度萃取氯仿提取液放置中如有沉淀析出,可滤取之,该沉淀多为大黄素,余液进行下一步分离试验用2.总蒽醌苷元分离方案的设计
①大黄总蒽醌苷元的纸色谱
②蒽醌类成分的缓冲纸色谱试验
③最佳萃取剂及其用量的确定各种萃取剂用量的确定新分离方法的设计蒽醌类成分的分离与精制大黄酸的分离与精制将含有总游离蒽醌的氯仿液450ml移至1000ml的大分液漏斗中,加PH8缓冲液275ml振摇萃取,静置至__分层,放出氯仿液后,到出碱水液至置250ml烧杯中,加HCl酸化至PH=3,待黄色沉淀析出完全后,过滤、干燥,干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶,趁热过滤,滤液静置,析出黄色针晶为大黄酸,过滤即得纯品大黄素的分离与精制将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中,用PH
9.9缓冲液275ml振摇萃取,__分层后,分出碱水层,并用HCl酸化至PH=3,析出棕黄色沉淀,过滤,沉淀经干燥后,用10ml冰醋酸加热使溶,趁热过滤,析出橙色大针晶,过滤后,即得大黄素纯品芦荟大黄素的分离和精制余下氯仿液移至分液漏斗后,加5%NaCO3:5%NaOH9:1碱水液540ml或用
0.5%KOH540ml振摇萃取,碱水液加HCl酸化,析出的沉淀过滤干燥,用10ml乙酸乙酯重结晶,得黄色针晶的芦荟大黄素纯品
④大黄酚和大黄素甲醚的分离——磷酸氢钙柱色谱蒽醌类成分的鉴定
①纸色谱鉴定
②IR光谱解析
四、实验指导1.本实验讲解要点及注意事项
①PH梯度萃取的原理及注意事项
②如何设计萃取分离方案的程序与方法
③蒽醌化合物红外光谱的特点
④分离萃取时一定注意乳化层的分出,不要混入,并且每步最好用新鲜CHCl3,回洗碱水液
⑤缓冲液的配制和碱液的配制要准确,严格注意检查每步萃取时,利用纸色谱检查跟踪萃取效果,如未达到预想效果应及时纠正2.实验报告要求
①记录大黄总蒽醌的提取方法
②总蒽醌的纸色谱检查结果(附色谱图)
③总蒽醌的缓冲纸色谱结果,并说明它对总蒽醌分离方案设计有何启示
④记录总蒽醌的分离程序(包括溶剂用量),及各分离物粗品的纸色谱检查结果,与原设计有何出入,原因何在?
⑤记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及纸色谱实验三汉防己生物碱的提取分离与鉴定
一、概述汉防己为防己科__藤属物StephaniatetrandraS.Mcore的根,是祛风解热镇痛药物,其有效成分为生物碱主要是汉防己甲素和汉防已乙素临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外,还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用,此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用
二、实验目的与要求通过汉防己中几种生物碱的提取分离和鉴定,要求掌握下列知识和技能1. 生物碱的一般提取方法2. 用低压柱层析分离,纯化单体的方法及薄层层析鉴定
三、已知生物碱的结构和性质汉防已根中总生物碱含量为
1.5~
2.3%,主要为汉防已甲素,含量约1%,汉防已乙素,含量约
0.5%;轮环藤酚碱,含量为
0.2%;以及其它数种微量生物碱1.汉防已甲素(Tetrandrine,汉防已碱,粉防已碱)无色针晶,不溶于水和石油醚,易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中,可溶于苯,mp216℃,有双熔点现象,自丙酮中结晶者,150℃左右熔后加热又固化,至213℃复熔2.汉防已乙素(Fan__hinoline又称防已诺林碱,去甲粉防已碱)溶解行为与汉防已甲素相似,因有一个酚羟基,故极性较汉防已甲素稍高,在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素籍此可以相互分离,用不同溶剂重结昌时,其晶形和溶点不同乙醇细棒状结晶mp245~40℃甲醇细棒状结晶mp177~9℃丙酮六面粒状晶mp134℃吡啶-甲醇mp121~2℃环已烷-EtocAcmp156℃3.轮环藤酚碱(Cylanoline)为水溶性季铵生物碱,不溶于极性溶剂,氯化物为无色,八面体状结昌,mp214~6℃,碘化物为无色绢丝状结晶,mp185℃;苦味酸盐为黄色结晶,mp154~6℃
四、生物碱的提取分离1.总生物碱的提取和亲脂性与亲水性生物碱的分离 注一将汉防已粗粉加适量酸水液,以能将生药粉末润湿为度(约150ml),充分拌匀,放置半小时,均匀而致密地装入渗筒内,用锥形瓶底部或其它平底工具压紧,供渗漉用,流速约
1.5ml/分注二净砂必须事前洗净烘干,拌和量最好不要超过120g,以免索氏提取器一次装不下或装得过多提不尽生物碱注三检查生物碱是否提尽的方法,是取最后一次乙醚提取液约数滴,挥去乙醚,残渣加5%HCl
0.5ml溶解后,加改良碘化铋钾试剂一滴,无沉淀折出或明显浑浊时,表明生物碱已提尽,或基本提尽反之,应继续提取注四先将提取器内滤纸筒取出然后将提取玻筒内最后一次乙醚提取液倾出(另器贮存),再将提取玻筒__好,继续加热,回收烧瓶中乙醚于玻筒中,至烧瓶内的乙醚提取液体积较小时,停止回收,将烧瓶中乙醚提取液倾出2.低压柱层析分离汉防已甲素和乙素低压柱层析在低压下(
0.5~3kg/cm2,一般
0.3~
1.2kg/cm2)采用颗粒直径介于经典柱层析(100~200μm)和HPLC(~37μm)之间的薄层层析用硅胶(或氧化铝)H或G(50~75μm)作为填充剂的一种柱层析柱,其基本原理与HPLC相同,分离效果也介于经典柱与HPLC之间,用减压干法装柱,铺层紧密均匀,层析带分布集中整齐,同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析,它是一种分离效果较好,设备简单,操作方便,快速的方法适宜和于天然产物的常量制备性分离
(1)装柱减压干法装法,层析柱规格柱长30cm,内径2cm,共装硅胶约30g(高约22cm)
(2)拌样加样取汉防已碱约150mg,加少量丙酮热溶(刚溶为度)用滴管加到
1.5g硅胶上,仔细拌匀,水浴上蒸干,碾细,通过一个长颈漏斗小心加在柱顶,轻轻垂直顿击,待样品表面平整不拌动时,上面再盖约1~2cm高的空白硅胶,再加盖一园形滤纸片,压紧
(3)洗脱先检查从空压机至层析柱各阀门管道是否正常,关紧各个阀门,开动空压机至额定压力(
5.8kg/cm2)待用用滴管顺层析柱柱壁仔细加入少量洗脱剂(环已烷-惭酸乙酯-二乙胺/
620.8),当液面达到一定高度时,再一次加入其余洗脱剂(共约250ml),迅速在柱顶上装上玻璃标口塞接头,用铁夹压紧(防加压时接头冲开),小心开启空压机阀门,再开针形阀和空气过滤减压器,(注意压力过大玻璃柱会炸,一般2kg是安全的,必要时可戴防护面罩)调动所需压力,
0.6~
1.2kg/cm2,约40分钟后流出,控制流速1ml/分,每10分钟左右一管,收12~15份,洗脱全过程约3小时
(4)检查各流份分别移入小玻璃蒸发器中,于水浴上浓缩,分别通过TLC检查,吸附剂硅胶G,展开剂环已烷-乙酸乙酯-二乙胺/631,改良碘化铋钾试剂喷雾显色,以汉防已甲素、乙素为标准品对照,合并相同组分,分别获得甲、乙素粗品,用丙酮重结晶,测定mp
五、鉴定方法1.衍生物制备取汉防已甲素
0.2g,溶于2ml(丙酮中,滴加苦味酸饱和水溶液至不再折出黄色沉淀为止,抽滤收集沉淀,顺次以少量水乙醚洗涤,乙醇重结晶,得汉防已甲素苦味酸盐,mp235~242℃(dc)2.有机胺碱的TLC吸附剂青岛海洋化工厂薄层层析硅胶G,用
0.3%CMC-Na水液制板,110℃活化1小时样品分出的汉防已甲素
①、乙素
②、总碱
③展开剂环己烷-EtoAc-NHEt2
(621)显色剂改良碘化铋钾试剂(展开后用电吹风吹干再喷显色剂,以免二乙胺干扰)现象甲素显色后呈淡棕色,2小时左右就褪色,而乙素呈棕色,久置不褪色,可帮助其辨认 。