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影响转染效率的因素转染效率收多种因素影响,主要因素有下面几个
1.细胞培养物健康的细胞培养物是成功转染的基础不同细胞有不同的培养基,血清和添加物低的细胞代数
(50)能确保基因型不变高的转染效率需要一定的细胞密度,一般的转染试剂http://___.ebioe.com/yp/product-list-
43.html\t_blank都会有专门的说明推荐在转染前24小时分细胞,这将提供正常细胞代谢,增加对外源DNA摄入的可能一定要避免细菌,支原体或真菌的污染
2.血清大多数培养基在使用前需要加血清胎牛血清(FCS)经常用到,便宜一点的有马或牛血清通常的,血清是一种包含生长因子及其它辅助因子的不确切成分的添加物,对不同细胞的生长作用有很大的差别血清质量的变化直接影响转染效率因此在转染前建议先测转右试出对细胞生长良好的血清批号,转染时用同一批号的血清,并同时做负对照(不加转染试剂及外源DNA)以测试细胞生长是否正常有些转染技术如脂质体转染在有血清存在情况下效率很低,因此在转染前要除血清但有些对此敏感的细胞如原代细胞会受到损伤,甚至死亡导致转染效率极低
3.载体构建转染载体的构建(病毒载体,质粒DNA,RNA,PCR产物,寡核苷酸等)也影响转染结果病毒载体对特定宿主细胞感染效率较高,但不同病毒载体有其特定的宿主,有的还要求特定的细胞周期,如逆转录病毒需侵染__期的宿主细胞,此外还需考虑一些安全问题(如基因污染)除载体构建外,载体的形态及大小对转染效率也有不同的影响,如前面提到的超螺旋及线性DNA对瞬时和稳定转染的影响如果基因产物对细胞有毒性作用,转染也很难进行,因此选择组成或可调控,强度合适的启动子也很重要,同时做空载体及其它基因的相同载体构建的转染正对照可排除毒性影响的干扰
4.DNA质量DNA质量对转染效率影响非常大一般的转染技术(如脂质体等)基于电荷吸引原理,如果DNA不纯,如带少量的盐离子,蛋白,代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的进行核酸纯化世界第一品牌德国QIAGEN公司提供的超纯质粒抽提试剂http://___.ebioe.com/yp/product-list-
43.html\t_blank盒,能达到两倍2xCsCl梯度离心以上的纯度效果,使您不必为DNA质量操心此外,对一些内毒素敏感的细胞(如原代细胞,悬浮细胞和造血细胞),QIAGEN还提供可去除内毒素污染的质粒抽提试剂盒,在质粒抽提过程中有效去除脂多糖分子,保证理想的转染效果
5.转染技术转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下转染方法原理应用特点DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复但对细胞有一定的毒副作用,转染时需除血清磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染不适用于原代细胞,操作简便但重复性差,有些细胞不适用电穿孔http://___.ebioe.com/yp/product-list-
129.html\t_blank法高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染,瞬时性转染,所有细胞适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大,需根据不同细胞类型优化电穿孔http://___.ebioe.com/yp/product-list-
129.html\t_blank实验条件阳离子性的脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染,瞬时性转染,所有细胞适用性广,转染效率高,重复性好但转染时需除血清http://___.ebioe.com/yp/product-list-
636.html\t_blank转染效果随细胞类型变化大病毒介导法逆转录病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但携带基因不能太大细胞需处__期,需考虑安全因素,腺病毒瞬时转染,特定宿主细胞可用于难转染的细胞,需考虑安全因素Biolistic颗粒传递法将DNAhttp://___.bbioo.com/index.phpm=contentc=taga=liststag=DNA\t_blank用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNAhttp://___.bbioo.com/index.phpm=contentc=taga=liststag=DNA\t_blank在胞内逐步释放,表达瞬时性转染可用于人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染,瞬时性转染转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞。