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RNA提取一般步骤总结RNA提取原理|通过变性剂破碎细胞或者组织,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA,再经过沉淀,洗涤,晾干,最后溶解但是由于RNA酶无处不在,随时可能将RNA降解,所以实验中有很多地方需要注意,稍有疏忽就会前功尽弃RNA提取的一般步骤所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即样品细胞或组织的有效破碎;有效地使__白复合体变性;对内源RNA酶的有效抑制;有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去但其中最关键的是抑制RNA酶活性RNA的提取目前阶段主要可采用两种途径:提取总核酸,再用氯化锂将RNA沉淀出来;直接在酸性条件下抽提,酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA留在水相第一种提取方法将导致小分子量RNA的丢失,目前该方法的使用频率已很低实验步骤破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA
1、破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,可以用盐酸胍、硫氰酸胍、NP-
40、SDS、蛋白酶K等破碎组织,加入β-ME可以抑制RNA酶活性
2、分离RNA一般用酚、氯仿等有机溶剂,加入少量异戊醇,经过此步,离心,RNA一般分布于上层,与蛋白层分开
3、沉淀RNA一般用乙醇、3MNaAc(pH-
5.2)或异丙醇
4、洗涤RNA使用70%乙醇洗涤,有时,为避免RNA被洗掉,此步可以省掉,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,但是不能过于干燥,否则不易溶解
5、融解RNA一般使用TE
6、保存RNA应该尽量低温为了防止痕量RNase的污染,从富含RNase的样品(如胰脏、肝脏)中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于__贮存更是如此从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了,而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定另外,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感为了增加贮存RNA样品的稳定性,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,存于-70℃用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年当准备使用RNA时,可以使用下列方法沉淀RNA加入NaAc至
0.3M,12000×g离心5分钟I氯化锂法提取总RNA本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高小RN__断丢失的缺陷试验试剂
1、氯化锂/尿素溶液【氯化锂126g3M尿素、360g6M加水至1L,过滤灭菌】
2、悬浮液【10mMTris-HCLpH
7.61mMEDTApH
800.5%SDS】试验步骤
1、对于大量组织或细胞,则每克组织或细胞加入5-10ml氯化锂-尿素溶液,匀桨器高速匀桨2分钟;对于少量细胞(107个细胞/ml),则每克组织或细胞加入
0.5ml氯化锂-尿素溶液手工匀桨,并转移至Eppendof管中
2、匀桨液在0-4℃放置4小时后,12000g离心30分钟
3、取沉淀,加入原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液,重复步骤
24、沉淀用原匀桨液1/2体积的氯化锂-尿素溶液复溶后,加入等体积酚/氯仿/异戊醇在室温放置15-30分钟并不时摇动混匀,4000g离心5分钟
5、取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH
5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心
6、70%乙醇洗沉淀一次真空干燥
7、RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存蛋白酶-热酚法本方法适合于病毒RNA的提取试验试剂
1、蛋白酶K(终浓度50ug/ml)J5pl6V/t7[/I
2、2×缓冲液1%SDS20mMTris-HCLpH
7.
60.2MnaCL试验步骤
1、提纯病毒液中加入等体积缓冲液、蛋白酶K37℃40-50分钟
2、加入等体积65℃预热的酚溶液,轻徭在65℃保温5分钟后再轻徭离心,取上清,氯仿抽提一次
4、取上层水相,加1/10倍体积的3M乙酸钠(pH
5.2)及2倍体积的乙醇,-20℃放置1小时,5000g离心10000g10min70%乙醇洗沉淀一次真空干燥
6、RNA溶解液溶解沉淀,得RNA,分装,于-70℃保存植物RNA提取过程中难点的相应对策植物RNA提取过程中难点的相应对策酚类化合物的干扰及对策许多植物组织特别是植物的果实(如苹果、樱桃、李子、葡萄等)和树木类植物中富含酚类化合物酚类物质的含量会随着植物的生长而增加因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA此外,针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多在植物材料匀浆时,酚类物质会释放出来,氧化后使匀浆液变为褐色,并随氧化程度的增加而加深,这一现象被称为褐化效应(browningeffect)被氧化的酚类化合物(如醌类)能与RNA稳定地结合,从而影响RNA的分离纯化但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性,因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质(如原花色素类物质)是影响RNA提取的一类化合物目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化,然后再将其与RNA分开防止酚类化合物被氧化的方法还原剂法一般在提取缓冲液中加入β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化,有时提取液中β-巯基乙醇的浓度可高达2%-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活Su等认为在过夜沉淀RNA时加入-巯基乙醇(终浓度1%)可以防止在此过程中酚类化合物的氧化硼氢化钠(NaBH4)是一种可还原醌的还原剂,用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减,醌类化合物可被还原成多酚化合物
2、螯合剂法螯合剂聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)中的CO-N=基有很强的结合多酚化合物的能力,其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基,因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物,使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化,并可以在以后的抽提步骤中被除去用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素,在pH
8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低当原花色素类物质量较大时,单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物,因而需要与其它方法结合使用
3、Tris-硼酸法如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸(pH
7.5),其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物,从而抑制酚类物质的氧化及其与RNA的结合这一方法十分有效,所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂但如果Tris-硼酸浓度过高(>
0.2M)则会影响RNA的回收率
4、牛血清白蛋白(BSA)法原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原-抗体间的相互作用,形成可溶性的或不溶性的复合物,减小了原花色素类物质与RNA结合的机会,因此提高了RNA的产量BSA与PVPP结合使用提取效果会更好由于BSA中往往含有RNase,因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性
5、丙酮法Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料,可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA酚类化合物的去除通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚,可以直接通过离心去除掉,或在苯酚、氯仿抽提时除去__nning利用高浓度的2-丁氧乙醇(50%)来沉淀RNA,而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去然后用含50%2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚他认为即使多酚被氧化,其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除,无需再用NaBH4来处理多糖的干扰及对策多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题植物组织中往往富含多糖,而多糖的许多理化性质与RNA很相似,因此很难将它们分开在去除多糖的同时RNA也被裹携走了,造成RNA产量的减少;而在沉淀RNA时,也产生多糖的凝胶状沉淀,这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水,或溶解后产生粘稠状的溶液由于多糖可以抑制许多酶的活性,因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究在常规的方法中,通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖;在高浓度Na+或K+离子存在条件下,通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖;通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起,所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10%~30%,可以使多糖沉淀下来,而RNA仍保留于溶液中一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇,如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时,在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10%以沉淀多糖但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时,是在用CsCl超离心,乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30%乙醇来沉淀多糖的,进一步纯化了RNA样品另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾(pH
4.8)溶液以沉淀多糖;Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾(pH
4.8)溶液Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的
8.5M5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质Su等在去除褐藻的多糖时,单独使用乙醇或醋酸钾都无效,只有两者结合使用效果最佳6Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖Chang等在提取松树RNA时,缓冲液中NaCl的浓度为
2.0M和
1.0M,通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离__nning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释,调节Na+离子浓度至80mM,然后加入
0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖蛋白杂质的影响及对策蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质,因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性;提取缓冲液中含有蛋白质变性剂,如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)等,这样在匀浆时可以使蛋白质变性,凝聚;有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离在70%高氯酸钠溶液中,RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度,因而将大部分蛋白质沉淀下来接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇,这时RNA能沉淀下来而能溶于70%高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中这样可以除去绝大部分的蛋白质次级代谢产物的影响及对策从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物,这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离因不能确定这些次级产物具体是什么物质,所以,目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性,使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多实践中经常会发现,即使同一种植物的不同组织其RNA提取方__有很大的不同;含有某种干扰因素的不同植物材料,其适用的RNA提取方法可能不同;即使是同一种植物同一种组织材料,但来源于不同基因型植株,其RNA提取方法也可能不一样所以,对于某一植物或其组织来说,其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立随着植物分子生物学研究领域的拓宽,可以肯定地说,在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点,但随着不断地探索和经验的积累,科学工__们一定会迅速地解决这些难点,为植物分子生物学的发展铺平道路植物RNA提取中的一些特殊方法。