还剩8页未读,继续阅读
本资源只提供10页预览,全部文档请下载后查看!喜欢就下载吧,查找使用更方便
文本内容:
前言血清蛋白血清蛋白是血液中脂肪酸的携带者当身体需要能量或者需要建造材料时,脂肪细胞就把脂肪酸释放到血液中,脂肪酸被血清蛋白获取,并被运送到需要的部位HYPERLINKhttp://baike.baidu.com/picture/1367873/1367873/0/4a77b2af02ff95f77cd92afafr=lemmact=single\thttp://baike.baidu.com/view/_blankINCLUDEPICTUREhttp://e.hiphotos.baidu.com/baike/s=220/sign=24d86706269759ee4e5067c982fb434e/342ac65c10385343d7d0842a9313b07eca
808899.jpg\*MERGEFORMAT\d牛血清白蛋白的相对分子质量为10的4次方这个级别,它不是一定的,是多聚物,有的地方测的70000,这就是一个数据了在做PCR的时候会用到它牛血清蛋白是血液的主要成分,分子量68kD等电点
4.8含氮量16%,含糖量
0.08%仅含已糖和已糖胺,含脂量只有
0.2%白蛋白由581个氨基酸残基组成,其中35个半胱氨酸组成17个二硫键,在肽链的第34位有一自由巯基白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用在动物细胞无血清培养中,添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用醋酸纤维薄膜电泳醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持物它是纤维素的醋酸酯,由纤维素的羟基经乙酰化而制成它溶于丙酮等有机溶液中,即可涂布成均一细密的微孔薄膜,厚度以
0.1mm—
0.15mm为宜太厚吸水性差,分离效果不好;太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎应用醋酸纤维薄膜电泳操作简单、快速、廉价已经广泛用于血清蛋白,血红蛋白,球蛋白,脂蛋白,糖蛋白,甲胎蛋白,类固醇激素及同工酶等的分离分析中,尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低,但它具有简单,快速等优点特点
1.
(1)醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少,无“拖尾”现象,染色后背景能完全脱色,各种蛋白质染色带分离清晰,因而提高了测定的精确性
(2)快速省时由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小,薄膜中所容纳的缓冲液也较少,电渗作用小,电泳时大部分电流是由样品传导的,所以分离速度快,电泳时间短,一般电泳45—60min即可,加上染色,脱色,整个电泳完成仅需90min左右
(3)灵敏度高,样品用量少血清蛋白仅需2μl血清,甚至加样体积少至
0.1μl,仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带临床医学检验利用这一点,检测在病理情况下微量异常蛋白的改变
(4)应用面广某些蛋白在纸上电泳不易分离,如胎儿甲种球蛋白,溶菌酶,胰岛素,组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离
(5)醋酸纤维薄膜电泳染色后,经冰乙酸,乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板,有利于扫描定量及__保存
2、醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比,操作简单,但分离效果不太好如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中,只能分离出5—6条区带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带
1、实验目的
1.掌握电泳法分离血清蛋白质的原理;
2.掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳的操作方法
2、实验原理
1.电泳是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极__的现象在一定pH条件下,不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷,因而在一定的电场中它们的__方向和__速度也不同,即它们的电泳迁移率不同,因此,可使它们分离
2.影响电泳迁移率的因素内在因素蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状外界因素电场强度、溶液的pH值、溶液的离子强度和电渗现象
4.醋酸纤维素溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后,涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜该膜具有均一的泡沫状的结构,厚度约为120μm,有很强的通透性,对分子__阻力很小该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高,对样品无拖尾和吸附现象等优点现已广泛用于血清蛋白、糖蛋白、脂蛋白、血红蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面
5.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带,从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白,经染色可计算出各蛋白质的百分含量
三、实验材料及试剂
1、实验器材
1.电泳仪为电泳提供直流电源
2.电泳槽为电泳提供场所
3.血清加样器可用盖玻片或微量加样器
4.醋酸纤维素薄膜2cm×8cm
5.其它培养皿(直径9-10cm)、滤纸、镊子等
2、实验材料及试剂材料牛血清
1.巴比妥-巴比妥钠缓冲液pH
8.
63.漂洗液
4.透明液临用前配制甲液取冰乙酸(AR)15ml,无水乙醇(AR)85ml,乙液取冰乙酸(AR)25ml,无水乙醇(AR)75ml
5.保存液液体石蜡
6.定量洗脱液(
0.4mol/LNaOH溶液)
4、实验步骤
1、电泳槽的准备电泳槽有两个互相隔离的槽,各自装有缓冲液,接不同的电极,红色为正极,黑色为负极每个槽上都有一根可__的横杆,滤纸的一头搭在横杆上,另一头浸入缓冲液中,形成了滤纸桥点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上
2、醋酸纤维素薄膜的润湿将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min后,用镊子小心夹住薄膜一端,放在折叠的滤纸中,并用滤纸吸干表面液体
3、点样把膜条铺在玻璃板上(无光泽面朝上),将点样器在血清中沾一下(量薄薄一层为好),再在膜条一端
1.5-2cm处轻轻水平地落下并随即提起,这样即在膜条上点上了细条状的血清样品此步是实验的关键
4、电泳将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上(点样面朝下),另一端平贴在阳极端支架上见下图要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直,中间不能下垂连接好电泳仪在室温下电泳,打开电源开关,调节电流强度
0.3__/cm膜宽度电泳时间约为1h电泳后,关闭电泳仪切断电源
5、染色电泳完毕后将薄膜取下放在含氨基黑10B染色液的培养皿中浸泡5-10min(染色液回收)
6、漂洗将薄膜从染色液中取出自来水下冲洗除去多余的染色液后放入盛有漂洗液的培养皿中漂洗,直至背景蓝色脱尽,条带清晰为止,可得到色带清晰的电泳图谱
7、透明将脱色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min,立即放入透明乙液中浸泡1min,取出后立即紧贴于干净玻璃板上,两者间不能有气泡约2min—3min薄膜完全透明若透明太慢可用滴管取透明乙液少许在薄膜表面淋洗一次垂直放置待其自然干燥,或用吹风机冷风吹干且无酸味再将玻璃板放在流动的自来水下冲洗,当薄膜完全润湿后用单面刀片撬开薄膜的一角,用手轻轻将透明的薄膜取下,用滤纸吸干所有的水分,最后将薄膜置液体石蜡中浸泡3min,再用滤纸吸干液体石蜡,压平此薄膜透明,区带着色清晰,可用于光吸收计扫描__保存不褪色
8、定量
(1)浸泡将膜片上的各蛋白质分离区带分段剪下,分别置于相应的标有编号的试管内,然后各加入
0.4mol/L的氢氧化钠溶液进行浸泡浸泡淡色带所加入的
0.4mol/L氢氧化钠溶液的量为4ml,深色带为8ml(此时的稀释倍数是淡色带的2倍)室温下的浸泡时间为30min~60min若在37℃水浴中浸泡,则为10min~15min浸泡期间振荡数次,使蛋白质区带浸出另外再剪取与色带膜条大小相同的无色带膜条作为空白,以相同的方式浸泡在
0.4mol/L氢氧化钠溶液中
(2)比色浸泡完毕,将浸出的有色溶液在分光光度计上进行比色测定测定波长为620__,光径为1cm若浸出液有混浊或沉淀,则以4000r/min的转速离心10min~20min除去,然后再取上清液进行比色测定
(3)计算比色测定结束后,各组分的含量按下式计算某蛋白质组分百分含量=某蛋白质组分的光吸收值/样品中各蛋白质组分的光吸收值总和×100%上式中深色带蛋白质组分的光吸收值应乘以稀释倍数2,例如血清白蛋白组分的分离区带为深色带,浸泡时所加入的
0.4mol/L氢氧化钠的量是其它淡色带的2倍,所以应乘以
25、数据记录及处理
1、实验数据蛋白质0清αβγ光吸收值
00.
0020.
0080.
0100.
0262、数据处理A总=0+
0.002+
0.008+
0.010+
0.026=
0.046清蛋白%=
0.002/
0.046=
4.3%α蛋白%=
0.008/
0.046=
17.4%β蛋白%=
0.010/
0.046=
21.7%γ蛋白%=
0.026/
0.046=
56.5%6.实验分析
1、醋酸纤维薄膜电泳法分离牛血清蛋白的原理 蛋白质是两性电解质当PHPI时,蛋白质为负离子,在电场中向阳极__;当PHPI时,蛋白质为正离子,在电场中向阴极__血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等,各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状的不同,在电场中的迁移速度不同,故可用电泳法将其分离
2、电泳注意事项 电泳时需要注意电流和电压的控制,以及电泳时间根据图谱分析可以估算血清中蛋白质的相对含量图谱中颜色的深浅和__大小可以反应血清蛋白质的含量,颜色较深者含量高,__较大者含量高由于电离时间等因素的影响,实验存在一定的误差
3、生物化学醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白的试验中,如果区带的分离效果不好,可能存在的影响因素
1.电泳时间不足
2.薄膜在染色或漂洗时重叠紧密且时间很长
3.薄膜在缓冲液中浸泡的时间不足
4.点样时薄膜上是否存在多余的水分
4、用醋酸纤维薄膜法可以将血清蛋白质分为哪几个区带可分5条带,分别为α1—球蛋白、α2—球蛋白、β—球蛋白、γ—球蛋白、白蛋白可能分子量越小,带电量越高,运动速度越快而这五种蛋白的分子量不同,带电量也不同,在电泳时的速度有快有慢
七、思考题
1、影响醋酸纤维薄膜电泳的因素有哪些,其是如何影响的? 血清变质条带数会有偏差 巴比妥溶液PH不合适影响电泳速率 漂洗次数过多或时间过长看不清楚条带 点样没点好浓度不均或者条带模糊
2、实验过程中哪些操作会影响到实验条带的完整性,应该如何改正? 点样没有点好,盖玻片要直直的压在薄膜上,否则血清不均匀,影响电泳条带形状; 血清不宜过多,若过多则条带过宽,分离不完全; 也不易过少,过少则条带分离不完全
8、____
1.陈巍龚伟宏;宁夏滩羊血清蛋白组分含量的研究[J];中国草食动物;2003年S1期
2.王友基王钦利;血清蛋白电泳测定的标准化问题初探[J];江西医学检验;2002年06期
3.周丽亚;高静;吴兆亮;李英杰;;血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的改进[J];生物学__;2008年02期
4.廖飞王咏梅左渝萍何爱彬曾昭淳;点样位置对血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳行为的改变[J];实验室研究与探索;2004年04期。