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一、前言
21.1课程目的
21.2课程设计的要求2
二、SOD概述
22.1SOD简介
22.2国内SOD研究进展2分离纯化及性质研究2的生物学意义及应用研究
22.3SOD的应用3在医学上的应用4在农业及食品工业中的应用4在化妆品中的应用4的其他应用
52.4SOD的发展前景5
三、大蒜SOD最佳提取条件确定及其生长过程中SOD活力变化研究
53.1大蒜SOD概述
53.2材料和方法5实验材料6提取大蒜SOD方法的确定6纯化方法
63.3大蒜生长过程中SOD酶活力的测定6大蒜SOD的提取6SOD活力测定
73.4结果与讨论7大蒜SOD最佳提取路线的选择7纯化方法的选择7丙酮沉淀法参数最优化选择7不同生长阶段大蒜SOD粗酶液活力测定8结论和讨论8____10
一、前言
1.1课程目的课程设计的目提高学生__思考的能力,学会设计课程,提高学生发展学生的科学探究能力、提高学生的科学素养
1.2课程设计的要求设计内容必须包括查找该酶的基本性质、发展情况、应用情况;检测方法的确定;粗酶制品的获得;酶粗品的精制;酶的鉴定、数据分析
二、SOD概述
2.1SOD简介超氧化物歧化酶别名肝蛋白、奥谷蛋白,简称SODSOD是一种源于生命体的活性物质,能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果超氧化物歧化酶是1938年__rn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起,人们对SOD的研究己有七十多年的历史1969年McCord等重新发现这种蛋白,并且发现了它们的生物活性,弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质,所以正式将其命名为超氧化物歧化酶
2.2国内SOD研究进展分离纯化及性质研究我国目前分离纯化了20多种不同来源的SOD并对其性质作了研究结果表明:不同来源的SOD在性质和氨基酸组成上具有高度相似性此外国内还报导了人胎肝亦含Cu·Zn·SOD袁海平91与__肝及其它组织的SOD理化性质基本一致说明SOD在胚胎期就已开始执行清除O了的功能其它如人、牛、鸡、马等血猪肝、冬菇、芥菜叶、刺梨、酵母、大肠杆菌和大豆等早几年已分离纯化SOD的生物学意义及应用研究SOD作为一种清除O孑的酶具有广泛的生物学意义凡起因于O了的细胞不良反应及其导致的疾病SOD都能防止于前治疗于后我国的研究主要测重在生物分子的保护作用、它与各种疾病的关系和对SOD的化学修饰与应用方面现分述于后
一、SOD对生物分子的保护作用研究结果表明SOD具有保护脂质不发生过氧化的作用蚕豆叶片随着衰老进程SOD活性逐渐下降而丙二醛脂质过氧化的主要产物含量急剧上升王根轩__高心病、冠心病及肝炎患者血浆丙二醛含量都显著高于常人且可以通过补充外源SOD予以治疗陈缓87;范学士55人老化红细胞的SOD为42一24士
27.17拌g/g·在植物体内SOD具有保护叶绿素分子免遭逆境因子破坏的作用许多逆境如大气污染强光、辐射及盐渍等能诱发植物体内产生O孑过量的O了使叶绿素解体而外源SOD能抑制逆境因子引起的叶绿素分解受逆境锻炼的植物体内soD含量提高叶绿紊降解速度下降如小麦经HSO矛NO矛抗性锻炼后体内SOD活性提高在高盐浓度下叶绿素分子被水解程度显著减轻李梨__
二、SOD与各种疾病的关系SOD与疾病之间的关系相当密切由于soD活力或数量下降使机体内O孑浓度增加引发膜脂过氧化作用膜结构破坏功能失调必然导致病变现已搞清与soD有关的疾病有自身免疫性疾病心血管疾病心肌缺血与缺血再灌注综合症、氧中毒、急性炎症和水肿、肺气肿、辐射病、老年性白内障、乙醇中毒、衰老等我国近几年在SOD与肿瘤、SOD的抗炎作用等方面作了一些研究SOD具有较强的抗炎作用以150一200mg/kg体重的剂量腹腔注射小白鼠然后用角叉菜胶诱发其足肠肿胀;用巴豆油诱发其耳片肿胀结果表明诱发剂对注射了SOD的小白鼠无效另外SOD对大白鼠佐剂性关节炎也有明显的抑制作用林秀坤86;袁伟86这一结果对SOD用于炎症防治提供了一个有力的佐证另外马蔚91的工作说明胶原病与SOD含量亦有关治疗胶原病应予以SOD补充人为提高SOD活性
三、对SOD的化学修饰研究SOD用于临床有一个致命的弱点—在体内的半衰期极短一般仅4—10分钟这一间题的解决办法目前主要运用SOD表面修饰和脂质体包裹对后者我国已成功地研究制出了能延长SOD在体内存在时间的脂质体制剂对前者我国主要研究了用右旋糖昔吴云8688和聚乙二醇飞耀华__作修饰剂结果表明修饰酶仍能保持75—80%的活性大大延长了SOD的半衰期右旋搪昔修饰的SOD在小鼠体内的半衰期由天然SOD的406分延长到
41.46分提高10倍多其所以能延长一般认为是糖分子增加了soD表面亲水性使其表面形成水化层—犹如保护膜使SOD受到保护这一研究不仅提高SOD临床应用价值也为SOD的口服开辟了有效途径特别值得注意的是庄华云90的研究它发现了Cu的二肤络合物:L一His一X一Cux为L一Ala或L一Tyr或L一Phe具有类似SOD的活性显然短肤络合物较SOD更具临床优势:易于人工合成更易于进入细胞
四、应用研究SOD在美德等国已有产品用于临床主要用于治疗类风湿关节炎及放射治疗后引起的炎症也用于自身性免疫病、肺气肿、氧中毒等治疗我国除研制出soD脂质体用于临床外贵州研制了SOD强化的刺梨汁糖浆__也已上市开辟了植物SOD应用的先例而且证明了SOD的口服有效性它的意义还在于减少了SOD制备环节成本大大降低另外SOD做为添加剂加入化妆品使化妆品具有防辐射、防衰老的作用目前我国正在制定食用型和化妆型SOD检测与质量标准它将为SOD更广泛深入的应用起推动作用综上所述SOD的研究在我国是较为广泛深入的分离纯化了20多种动植物的SOD并进行了性质研究占世界总数的三分之二独特地鉴定了人胎肝SOD与__的一致;研究了SOD与癌症、炎症、脑损伤等疾病的关系为临床应用提供了可靠的理论根据尤其是SOD的修饰研究使SD的国产化成为可能SOD强化的刺梨汁糖浆的临床应用更是独具特色值得一提的是中国医学院基础医学研究所和海军总院分子生物学研究所成功地将人血SOD基因克隆到大肠杆菌表达率达50%超国外15%但在SOD的结构、性质及催化机制方面的研究尚显不足此方面除得出Cu为催化基团袁勤生
91、Cl一对SOD活性有明显抑制作用邓碧玉‘91外极少报导
2.3SOD的应用在医学上的应用人类机体所处的环境复杂体内经常不断__生自由基特别在病理过程中产生大量的O-2这些O-2反过来促进病情加重因而SOD在清除O-2中则显得异常重要肺气肿是由于肺组织的中性白细胞含弹性蛋白酶及弹性蛋白酶抑制剂不平衡所致弹性蛋白酶抑制剂有α-蛋白酶抑制剂及支气管粘膜蛋白抑制剂两种均可受O-2攻击而失活导致肺气肿环境污染物如:O
3、氮、硫等能提高肺的巨噬细胞的活力而不断释放O-2吸烟也会使自由基大量进入肺内在肺中O-2产生破坏性极强的·OH等O-2和·OH攻击弹性蛋白酶抑制剂使其失活而造成肺气肿类风湿关节炎、全身性红斑狼疮等自身免疫性疾病是由于机体丧失阻止自身组分的抗体形成而产生自体抗体这些抗体与正常的机体级组分结合引起吞噬细胞吞噬而表现出病理状态吞噬细胞在吞噬过程中产生大量的O-2O-2攻击机体而加剧病变机体受原子弹、氢弹的辐射冲击从事放射辐射工作而防护不良的工作人员受电离辐射后成各种不同产物且产物又发生连锁反应生成许多自由基而攻击人体导致辐射病人体内H2O x-射线γ-射线 x-射线γ-射线O-2+·OH+·HSOD的增加能抑制因辐射而引起的肿瘤的形成并增加成纤维细胞的分化能力有效地防止肿瘤的恶性发展另外某些药物中毒、氧中毒、大气污染综合症和老年性白内障等疾病的发生均与O2-相关联机体内的O-2可以引起各种疾病SOD作为O-2的天然清除剂在正常情况下O-2与SOD保持动态平衡但在病理状态下产生过量的O-2机体本身产生的SOD能完全清除这些过多的O-2这些过多的O-2则对机体产生危害SOD可以催化O-2进行歧化反应减轻O-2对上述疾病的作用机体内含有SOD并且机体组织中的SOD还会随着年龄的增加而增加如J.Hollander研究
[5]发现随着人年龄的增加腓肠肌中SOD的活性也在增加但是机体自身产生的SOD是有限的因此在疾病治疗中可以通过注射或口服SOD药物增加机体中的SOD达到治疗疾病的作用SOD在农业及食品工业中的应用SOD在转基因植物中的过量表达能不同程度地提高植物对逆境的抵抗能力MnSOD基因的过量表达在一定程度上可以提高植物转基因植物对氧胁迫的耐受性通过基因工程手段增加植物内的SOD的表达可以大大增强植物的抗逆性如
[3]将存在于线粒体中的Mn-SOD导入烟草、苜蓿的叶绿体后其转基因植株可以增加对臭氧及干旱胁迫的抗性拟兰芥
[4]的Fe-SOD基因转化烟草叶绿体Fe-SOD的过量表达能够增强叶绿体质膜和光合系统Ⅱ对MV甲基紫精和高盐过氧化胁迫的抗性SOD在食品工业中的应用也比较广泛在食品中加入SOD可以增强抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健作用SOD还可以在罐头食品、果汁、啤酒等食品中作为抗氧化剂防止过氧化化物酶引起的食品变质和__现象;还可以作为水果和蔬菜的保鲜剂SOD在化妆品中的应用研究证明,SOD添加于化妆品中可起到4方面的作用:一是有明显的防晒效果光照使皮肤变黑的主要原因是氧自由基损害SOD可有效防止皮肤受电离辐射特别是紫外线的损伤从而起到防晒效果;二是SOD为抗氧酶能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱;三是有明显的抗炎效果对防治皮肤病有一定效果;四是SOD具有一定的防治斑痕形成的作用SOD在化妆品中妆品应用广泛SOD也被用于化妆品中如我国的大宝SOD蜜用于防止皮肤衰老另一些含SOD量高的药物如人参、
三七、黄芪等也受到重视SOD的其他应用目前生物无机化学家们合成和表征了一系列含铜、锰、铁等金属离子的小分子配合物来模拟SOD期待将来能用小分子模拟化合物代替SOD应用于临床其中研究最多的含铜络合物是35-二异丙基水杨酸铜[Cu35-DIPS]这是一种低分子量的亲脂性络合物具有天然Cu/Zn-SOD样活性可以起到抗炎及减轻由链脲菌素诱导产生的糖尿病合成的铁II-酪氨酸模拟SOD金属酶分子量比天然酶小得多与天然SOD活性差距较小且毒性小从而大大推进了人工合成具有分子质量较小、稳定性高、毒性较底、活性较高等优点的SOD模拟物的研究工作
2.4SOD的发展前景虽然对SOD的研究广泛但是SOD的临床应用仍有一定的困难如静脉注射SOD在体内半衰期仅为6分钟口服是否会在胃肠道中被破坏而失去疗效口服后能否被吸收等问题还有待解决但可以设想随着对SOD研究的日益深入SOD作为一种新型酶制剂在医药、农业、保健品、食品等方面必将得到广泛的应用SOD研究领域不断扩展研究内容不断深化然而仍有许多问题有待于进一步研究理论研究方面如对SOD进行化学修饰后修饰酶的代谢过程及其毒副作用等方面都需要深入研究;应用研究方面也有一些问题急待解决:a临床应用方面需进一步阐明SOD在体内的抗氧化过程延长SOD在体内的半衰期减少其对机体的毒副作用等,食品工业方面要确保口服SOD有效性使之不被胃蛋白酶分解等化妆品应用方面要准确地测定SOD的活性大小同时要明确化妆品基质对SOD活性和稳定性的影响等随着研究的不断深入SOD的应用前景将更为广阔
三、大蒜SOD最佳提取条件确定及其生长过程中SOD活力变化研究
3.1大蒜SOD概述大蒜是人们喜爱的一种香辛蔬菜和调味料,历来被认为具有保健和治疗作用,现代研究发现,其活性物质主要是蒜氨酸和超氧化物歧化酶(SOD)SOD是生物体内产生的超氧阴离子自由基的清除剂,具有抗衰老,提高机体对多种疾病的抵抗力;增强机体对外界环境的适应力;减轻肿瘤患者在放疗、化疗过程中的严重毒副作用等生理功能所以在医药、食品、化妆品、农业等方而具有广泛的应用大蒜中SOD含量较高,其活性是一般果蔬的数倍,被认为是人类重要的SOD来源__大蒜中的SOD产品成为人们__的热点若以传统的以牲畜血液为原料提取SOD产品,不但生产成本高,而且可能会危及生态的平衡若以大蒜为原料,不仅节省生产成本,还拉动经济的发展本论文在前人研究的基础上,以河南大蒜为原料,选取最佳的大蒜SOD提取工艺,分离提取大蒜不同生长阶段的SOD粗酶液,测定大蒜不同生长阶段的SOD酶活力,确定大蒜在哪个生长阶段的SOD的酶活力最高,为今后提取不同生长阶段的大蒜的SOD粗酶或者__SOD产品提供一个较优的选择依据
3.2材料和方法实验材料河南新鲜白皮大蒜,005mol/L磷酸缓冲液(pH为7.8使用91.5mL0.05mL/L NaHPO4与8.5mL 0.05mol/L NaH2PO4配置而成);氯仿-乙醇混合液(氯仿∶乙醇为3∶5);丙酮用前冷却到4℃;0.05mol/L碳酸缓冲液(pH为10.2使用70mL0.05mol/L Na2CO3与30mL 0.05mol/L NaHCO3配置而成);0.1mol/L EDTA溶液(准确称取乙二胺四乙酸二钠3.722g溶解于100mL蒸馏水中);2mmol/L肾上腺素(用现成的1mg/mL盐酸肾上腺素注射液配置,在其基础上加入1.33mL蒸馏水FA1004B电子天平 __精密仪器有限公司;KDC-16高速离心机、国华企业SHA-B型水浴振荡锅、T6新世纪紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司提取大蒜SOD方法的确定粗提取方法:磷酸缓冲液法将蒜瓣去外膜,置于研钵中研磨至蒜泥状,加入3倍体积的磷酸缓冲液,浸泡30~45min后用6层纱布抽滤,将滤渣再用2倍体积磷酸缓冲液浸泡30min后,6层纱布抽滤如此反复共3次,收集3次抽滤所得滤液,测酶活力热变性法将大蒜中SOD酶液于60℃热处理20min,5000r/min离心15min,弃沉淀,测定上清液酶活力混合法(磷酸缓冲液法+热变性法)破碎后的大蒜组织中加入三倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH为7.8),继续研磨20min,使SOD充分溶解到缓冲液当中,然后在5000r/min下离心15min,取上清液纯化方法氯仿-乙醇沉淀法将氯仿-乙醇混合液,按酶液体积的0.25将其加入酶液中,搅拌15min,5000r/min离心15min,弃沉淀,将上清液置于试管中静10min后测其SOD酶活力丙酮沉淀法粗酶液中加入0.6倍体积的冷丙酮,搅拌15min,5000r/min离心15min,得到SOD沉淀,将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中,于55~60℃热处理15min,5000r/min离心15min,崎岖得到SOD酶液
3.3大蒜生长过程中SOD酶活力的测定大蒜SOD的提取取未种植的大蒜及不同生长阶段的大蒜蒜瓣各5g,分别置于1~6研钵中研磨进行组织细胞破碎SOD的提取[3]破碎后的组织中加入三倍体积的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH为7.8),继续研磨20min,使SOD充分溶解到缓冲液当中,然后在5000r/min下离心15min,取上清液除杂蛋白上清液中加入0.25体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min,5000r/min离心15min,得到的上清液即为粗酶液SOD的沉淀分离粗酶液中加入0.6倍体积的冷丙酮,搅拌15min,5000r/min离心15min,得到SOD沉淀,将SOD沉淀溶于磷酸缓冲液中,于55~60℃热处理15min,5000r/min离心15min,弃去沉淀,得到SOD酶液SOD活力测定表1肾上腺素法试剂空白管对照管样品管1样品管2样品管3碳酸缓冲液
5.
05.
05.
05.
05.0EDTA溶液
0.
50.
50.
50.
50.5蒸馏水
0.
50.5–––样品––
0.
50.
50.5肾上腺素–
0.
50.
50.
50.5取三个对照管,混合均匀,在30℃水浴中预热5min加入肾上腺素后,继续保温2min,然后立即在325nm处测定光密度对照管和样品管的光密度值分别为A和B在上述的实验条件下,将SOD抑制肾上腺素自氧化50%所需要的酶量定义为一个酶活力单位酶活力(单位)=[2(A-B)N]/A;其中N为样品稀释倍数;2为抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数酶活力单位/mL=酶活力单位×(V1/V);其中,V为反应液体积(6.5mL);V1为样品液体积(0.5mL)
3.4结果与讨论大蒜SOD最佳提取路线的选择粗提取方法的选择表2不同方法粗提取是SOD的吸光度A),其中A1,A2,A3分别为磷酸缓冲液、热变性和以上两种方法的混合粗提SOD的测定值由表2计算可知磷酸缓冲液提取法所得的酶活力为10.473;经热变性处理的大蒜SOD粗酶液的酶活力为16.473;混合法所得的酶活力为18.109由此可见,在进行粗提的方法选择上,应选择混合提取法,即磷酸缓冲液法+热变性法表2不同方法粗提时SOD的吸光度样品管0123平均值A
10.
0000.
1260.
1090.
1360.124A
20.
0000.
0700.
0660.
0710.069A
30.
0000.
0580.
0540.
0510.054纯化方法的选择表3为不同方法纯化时SOD的吸光度(A),其中A4,A5分别为氯仿-乙醇沉淀法和丙酮沉淀法时所得SOD的吸光度由表3计算可得,通过氯仿-乙醇沉淀法提纯SOD粗酶液的酶活力为11.236;通过丙酮沉淀法提纯大蒜SOD粗酶液的酶活力为15.273由此可见,丙酮沉淀法是纯化效果较好的一种方法表3不同方法纯化时SOD的吸光度样品管0123平均值A
10.
0000.
1200.
1130.
1190.117A
20.
0000.
0800.
0920.
0690.
0803.
4.3丙酮沉淀法参数最优化选择在相同体积的粗酶液中,分别加入0.4倍(V1)0.6倍(V2),0.8倍(V3),1.0倍(V4)的丙酮,然后测其酶活力,其结果见表4,由表4计算得,在粗酶液中加入0.4,0.6,0.8,1.0倍体积的丙酮后其酶活力分别为3.273,11.345,9.927,9.6;由此可见,加入0.6倍体积的丙酮时SOD酶活力最高表4加入不同体积丙酮后SOD的吸光度样品管0123平均值V
10.
0000.
2580.
1920.
2010.217V
20.
0000.
0950.
1270.
1260.116V
30.
0000.
1420.
1380.
1060.129V
40.
0000.
2100.
2450.
2400.231不同生长阶段大蒜SOD粗酶液活力测定表5 不同时期大蒜SOD的吸光度、酶活力和酶活力单位样品管01234567吸光度
0.
2200.
1030.0__
0.
0940.
0780.
0770.
0710.071酶活力(单位)
6.
38212.
73614.
29113.
74514.
49115.
60016.
25416.254酶活力
0.
5020.
9821.
0991.
0571.
1921.
2001.
2101.210由图1可以清晰的看出,大蒜生长天数与SOD酶活力的变化关系未种植的大蒜SOD酶活力为0.502,在大蒜生长7天时,其SOD酶活力有明显的上升,在紧接着的一周的生长过程中,大蒜的SOD酶活力有急剧的下降,初步分析,可能是打算生长时,消耗了有机物,而这些有机物也许会直接或间接的影响到SOD酶活力在大蒜生长的第3周和第4周时,其酶活力又得到了明显的提升而在实验的最后1周中,大蒜的SOD酶活力变活已经没有太大的变化结论和讨论三种粗提取方法和两种纯化方法各自有其的优点,但就本课题来说,最佳的提取工艺路线为用混合法(磷酸缓冲液法+热变性法)进行粗酶液的提取;用丙酮纯化法进行酶液在纯化,丙酮用量为0.6倍体积粗酶液同时搅拌15min一般在泡菜发酵过程中可以根据pH下降的快慢分为发酵初期、发酵旺盛期和发酵末期三个阶段;在发酵过程中,发酵液中的pH均呈下降趋势,而甘蓝中的酸含量(以总酸含量代替)同时较快上升,待发酵成熟期过后,乳酸含量稍有下降,这与真菌的增殖有关,真菌为耐酸性菌,它的增殖能够降低发酵液中的有机酸(如乳酸,醋酸等)使pH有所回升pH的降低和乳酸菌的增加能够抑制发酵体系中其他微生物的生长,如除乳酸菌外的需氧嗜温菌和肠道菌的减少,同样结果也见于其他发酵产品[10,11],有资料报道pH 3.5~4.0能够抑制肠道菌和革兰氏阴性菌[12]除乳酸菌外乳酸也能抑制肠道菌[13]本次实验研究表明在甘蓝发酵过程中,加入食醋能够迅速地促进乳酸菌的繁殖,从而加快发酵的速度,比自然发酵完成提前了1天,加入发酵液中的食醋以白醋为好,加入醋的浓度以0.6%为最适浓度____
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