还剩9页未读,继续阅读
本资源只提供10页预览,全部文档请下载后查看!喜欢就下载吧,查找使用更方便
文本内容:
流式细胞仪(Flow Cytometry) 1流式细胞仪的概念及其发展历史1.1流式细胞仪的基本概念 流式细胞仪(flowcytonletry,FCM)是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器,主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术,计算机对数据的采集和分析技术等流式细胞仪以流式细胞术为理论基础,是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术其特点是测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量,即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量,且在统计学上有效1.2流式细胞仪的发展简史 最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年,Mold__an提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管,在亮视野下用显微镜进行计数,并用光电记录装置测量的设想1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室其后又经过Coulter、ParkerHorst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进,设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、__流式细胞仪在临床上的应用近20年来,随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善,人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件__等方面的工作,以扩大FCM的应用领域和使用效果__根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等,例举了其在医学和生物工程中的应用,非常适合从事此方面专业研究的人由于这本书是13年前出版的,所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说,这本书太复杂太深奥谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理,简单提及了流式细胞仪的应用本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后,用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理,并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括2流式细胞仪的工作原理和技术指标2.1流式细胞仪工作原理 除电源外,流式细胞仪主要由四部分组成流动室和液流系统激光源和光学系统;光电管和检测系统;计算机和分析系统,其中流动室是仪器的核心部件这四大部件共同完成了__的产生、转换和传输的任务流动室和液流系统 流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作设计和制作均很精细,是液流系统的心脏样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出为了保证液流是稳液,一般限制液流速度υ10m/s由于鞘液的作用,被检测细胞被限制在液流的轴线上流动室上装有压电晶体,受到振荡__可发生振动激光源和光学系统 经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有配和氪离子激光器或染料激光器光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定汞灯是最常用的弧光灯,其发射光谱大部分集中于300~400__,很适合需要用紫外光激发的场合氩离子激光器的发射光谱中,绿光514__和__488__的谱线最强,约占总光强的80%;氪离子激光器光谱多集中在可见光部分,以647__较强免疫学上使用的一些荧光染料激发光波长在550__以上,可使用染料激光器将有机染料做为激光器泵浦的一种成份,可使原激光器的光谱发生改变以适应需要即构成染料激光器例如用氩离子激光器的绿光泵浦含有Rhodamine6G水溶液的染料激光器则可得到550~650__连续可调的激光,尤在590__处转换效率最高,约可占到一半为使细胞得到均匀照射,并提高分辨率,照射到细胞上的激光光斑直径应和细胞直径相近因此需将激光光束经透镜会聚光斑直径d可由下式确定d=4λf/πDλ为激光波长;f为透镜焦距;D为激光束直径色散棱镜用来选择激光的波长,调整反射镜的角度使调谐到所需要的波长λ为了进一步使检测的发射荧光更强,并提高荧光讯号的信噪比,在光路中还使用了多种滤片带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过例如使用525__带通滤片只允许FITC(Fluores__inisothiocyanate异硫氰荧光素)发射的525__绿光通过长波通过二向色性反射镜只允许某一波长以上的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射在免疫分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光__,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开光电管和检测系统 经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电__而进行测量的光电倍增管(PMT)最为常用PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900__的光谱区,光量子产额都比较高光电倍增管的增益从10到10可连续调节 ,因此对弱光测量十分有利光电管运行时特别要注意稳定性问题,工作电压要十分稳定,工作电流及功率不能太大一般功耗低于
0.5W;最大阳极电流在几个毫安此外要注意对光电管进行暗适应处理,并注意良好的磁屏蔽在使用中还要注意__位置不同的PMT,因为光谱响应特性不同,不宜互换也有用硅光电二极管的,它在强光下稳定性比PMT好 从PMT输出的电__仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器流式细胞计中一般备有两类放大器一类是输出__辐度与输入__成线性关系,称为线性放大器线性放大器适用于在较小范围内变化的__以及代表生物学线性过程的__,例DNA测量等另一类是对数放大器,输出__和输入__之间成常用对数关系在免疫学测量中常使用对数放大器因为在免疫分析时常要同时显示阴性、阳性和强阳性三个亚群,它们的荧光强度相差1~2个数量级;而且在多色免疫荧光测量中,用对数放大器采集数据易于解释此外还有调节 便利、细胞群体分布形状不易受外界工作条件影响等优点计算机和分析系统 经放大后的电__被送往计算机分析器多道的道数是和电__的脉冲高度相对应的,也是和光__的强弱相关的对应道数年纵坐标通常代表发出该__的细胞相对数目多道分析器出来的__再经模-数转换器输往微机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,最后给出结果除上述四个主要部分外,还备有电源及压缩气体等附加装置2.1.1__的产生、转换和传输 在压力作用下,鞘液管中的鞘液被持续不断地压入流动室,形成一股稳定地连续的液流,保证了样本液稳定地处于鞘液液流的轴线上,并以单个细胞形式直线通过激光照射区激光照射区又称测量区,是指液流与激光束垂直相交的点当细胞携带荧光素标记物(每种物质携带的标记物不同吗)通过激光照射区时,产生代表细胞内部不同物质、不同波长的荧光__,这些__以细胞为中心,向空间360°立体角发射,产生散射光和荧光__散射光不依赖任何细胞样品的制备技术,因此被称为细胞的物理参数或固有参数散射光又包括前向角散射和测向角散射前向角散射与被测细胞直径的平方密切相关,测向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息荧光__也有二种;一种是细胞自身在激光照射下发出的微弱荧光__,另一种是经过特异荧光素标记后的细胞受激发照射后得到的荧光__在免疫分析中常要同时探测两种以上波长的荧光__,就采用二向色性反射镜,或二向色性分光器,来有效地将各种荧光分开经荧光染色的细胞受到适合的光激发后产生的荧光是通过光电转换器转变成电__而进行测量的最常用的光电转换器是光电倍增管(PMT)从PMT输出的电__需要经过放大后才能输入分析仪器流式细胞仪中一般备有两类放大器一类是线性放大器,其输出__与输入__成线性关系线性放大器适用于在较小范围内变化的__以及代表生物学线性过程的__,如DNA测量等另一类是对数放大器,其输出__和输入__之间成常用对数关系在免疫学测量中常使用对数放大器放大后的电__被传送到计算机,再经模一数转换器传输到微机处理器形成数据文件,保存在计算机上保存在计算机上的数据可在脱机后再进行数据处理和分析参数(例如细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构)测量原理 流式细胞仪可同时进行多参数测量,信息主要来自特异性荧光__及非荧光散射__测量是在测量区进行的,所谓测量区就是照射激光束和喷出喷孔的液流束垂直相交点液流__的单个细胞通过测量区时,受到激光照射会向立体角为2π(360°)的整个空间散射光线,散射光的波长和入射光的波长相同散射光的强度及其空间分布与细胞的大小、形态、质膜和细胞内部结构密切相关,因为这些生物学参数又和细胞对光线的反射、折射等光学特性有关未遭受任何损坏的细胞对光线都具有特征性的散射,因此可利用不同的散射光__对不经染色活细胞进行分析和分选经过固定的和染色处理的细胞由于光学性质的改变,其散射光__当然不同于活细胞散射光不仅与作为散射中心的细胞的参数相关,还跟散射角、及收集散射光线的立体角等非生物因素有关 在流式细胞术测量中,常用的是两种散射方向的散射光测量
①前向角(即0角)散射(FSC);
②侧向散射(SSC),又称90角散射这时所说的角度指的是激光束照射方向与收集散射光__的光电倍增管轴向方向之间大致所成的角度一般说来,前向角散射光的强度与细胞的大小有关,对同种细胞群体随着细胞截__的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截__大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大,尤其需要注意侧向散射光的测量主要用来获取有关细胞内部精细结构的颗粒性质的有关信息侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映 在实际使用中,仪器首先要对光散射__进行测量当光散射分析与荧光探针联合使用时,可鉴别出样品中被染色和未被染色细胞光散射测量最有效的用途是从非均一的群体中鉴别出某些亚群 荧光__主要包括两部分
①自发荧光,即不经荧光染色细胞内部的荧光分子经光照射后所发出的荧光;
②特征荧光,即由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光,其荧光强度较弱,波长也与照射激光不同自发荧光__为噪声__,在多数情况下会干扰对特异荧光__的分辨和测量在免疫细胞化学等测量中,对于结合水平不高的荧光抗体来说,如何提高信噪比是个关键一般说来,细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高,自发荧光越强;培养细胞中死细胞/活细胞比例越高,自发荧光越强;细胞样品中所含亮细胞的比例越高,自发荧光越强 减少自发荧光干扰、提高信噪比的主要措施是
①尽量选用较亮的荧光染料;
②选用适宜的激光和滤片光学系统;
③采用电子补偿电路,将自发荧光的本底贡献予以补偿2.1.2流式细胞仪分选原理 并不是所有的流式细胞仪都具有分选功能流式细胞仪的分选功能是由细胞分选器来完成的由喷嘴射出的液流柱在电__作用下发生振动,断裂形成均匀的小液滴根据选定的某个参数由逻辑电路判明是否将被分选,而后由充电电路对选定细胞液滴充电,带电液滴携带细胞通过静电场而发生偏转,落入收集器中使用不同孔径的喷孔及改变液流速度,可能会改变分选效果从参数测定经逻辑选择再到脉冲充电需要一段延迟时间精确测定延迟时间是决定分选质量的关键,可根据具体要求进行适当调整2.1.3数据的显示和分析 数据处理主要包括数据的显示和分析单参数直方图是使用最多的图形显示形式,既可用于定性分析,又可用于定量分析单参数直方图是由X、Y二方向组成的二维平面图横座标X是所测的荧光或散射光的强度,用“道数”(ChannelNo.)来表示选择的放大器类型不同,标度不同纵座标Y通常表示被测细胞的绝对数目正常情况下,数据分析得到的图形为具有一个或若干个峰的曲线图对曲线图的解释应该具体问题具体分析除直方图外,数据显示方式还包括二维点图、二维等高图、假三维图和列表模式等二维点图也是比较常用的数据显示类型它显示两个__参数与细胞相对数之间的关系,也是二维平面图,横纵坐标可以根据自己选定的被测参数自行决定,点的位置表明了细胞和颗粒具有的二个被测参数的数值二维点图所提供的信息量要大于单参数直方图数据分析的方法大体可分为参数法和非参数法两大类当被检测的生物学系统能够用某种数学模型时则多使用参数方法非参数分析法不用对显示的图像做任何假设,也不采用数学模型,分析程序可以很简单,也可能很复杂临床医学较常使用非参数分析法2.2流式细胞仪性能的技术指标 流式细胞仪性能的技术指标主要有荧光分辨率、荧光灵敏度、适用样品浓度、分选纯度等荧光分辨率是指分辨两个相邻峰的最小距离,通常用变异系数(CV值)来表示现在市场上主流型号出厂时的荧光分辨率应该小于
2.0%荧光灵敏度反映了仪器探测最小荧光光强的能力一般用荧光微球上可测出的FITC的最少分子数来表示目前仪器均可达到1000左右仪器工作时样品浓度一般在105~107细胞/ml分析速度/分选速度是指流式细胞仪每秒种可分析或分选的颗粒数目一般分析速度为5000~_____,分选速度控制在1000以下流式细胞仪测量的数据是相对值,因此需要在使用前对系统进行校准或标定流式细胞仪的校准有二个目的,即仪器的准直调整和定量标度通常使用标准微球作为非生物学标准样品,鸡血红细胞做为生物学标准样品3主流流式细胞仪型号及其特性介绍目前拥有市场较大份额的公司是美国的BD(Becton-____inson)公司、Beck__n-Coulter公司(原名称Coulter)和德国的Partec公司3.1BD公司流式细胞仪介绍 BD公司生产的流式细胞仪都冠以FACs(fluores__n__activated__llsorter),即荧光激活细胞分选器其型号种类比较齐全,如早期的FACSort、FACSCanto、FACSean现在市场上供应的型号有五种FACSCount(小型流式细胞仪)、FACSCAlibur(流式细胞仪)、FACSAria(流式细胞分选仪)、FACSVantageSETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSRII(数字化分析型流式细胞仪)FACSCount为精确计数淋巴细胞CD3,CD4,CD8绝对数而设计的FACSCalibur是全自动多色流式系统,偏重于临床,其整体设计帮助临床医生快速实现常规免疫表型、CD4T细胞计数、DNA、网织红细胞、血小板等临床分析,兼具分选功能配备有二根激光管,可同时检测4个荧光参数可识别粘联细胞BDFACSAria流式细胞分选仪为台式高速细胞分选仪,获取速度达70,000细胞/s,分析速度达50,000/s使用石英杯流动检测池固定光路校准技术使用三种激光,多色分析,分析参数可达15色两管或四管分选,可以使用多种规格的收集管液流监测系统白动监测液流断点,检查堵塞,实现了细胞分选的无人操作配件BDACDU装置,可以在微孔板或载波片上定量分选细胞FACSVantageSETM是在FACSVantage的细胞分选功能基础上推出的分选增强型流式细胞仪六色荧光分析系统,点对点分选,配置FACSDiva数字化系统,提供全面的配套试剂速度和功能优于FACSVantageBDLSRII是LSR的数字化升级版,其性能介于FACSVantageSE和FACSCalibur之间,是专为生命科学研究设计的台式机配备固定校准的紫外激光,四种激光立体空间激发、十色荧光同时分析、电子系统数字化、比较易学易用3.2Beck__n-Coulter公司流式细胞仪介绍 Beck__n-Coulter公司生产的流式细胞仪以Profile(早期,现已停产)和EPICS系列为代表,近年又推出了CytomicsFC500系列EPICS系列是大型流式细胞仪,目前市场上有XL、XL-MCL和ALTRA三种型号,其中ALTRA具有分选功能,适用于免疫学、细胞生理、分子生物学、遗传学、微生物学、水质分析和植物细胞分析CytomicsFC500系列流式细胞仪体积小,可自动进行5种颜色的分析,适用于免疫学检测,如人类HIV诊断特别是FC500MPL的独特设计可以在同一系统上使用12×75mm的离心管和24或96孔的平板特别适合工作量大的实验室这二个公司主要针对医学研究和临床工作进行设计和生产,其产品可应用于生物医学基础研究以及临床检测的许多领域,如遗传、肿瘤、血液、免疫等诸多研究中红细胞、T细胞、淋巴细胞亚群测定、检测早期细胞凋亡、肿瘤细胞免疫测定等这二个公司的流式细胞仪__昂贵,我国主要__、使用的单位基本上都是一些医疗机构3.3Partec公司流式细胞仪介绍 与BD和Bec__n-Coutler公司的产品相比,德国Partec公司生产的流式细胞仪的共同特点是体积小,造价低,易操作,便于携带,适合植物学研究,适合边远地区和发展中国家德国Partec公司的产品分为三类CCA家族、PAS家族和CyFlow家族(Galaxy为早期产品,已停产)CCA家族包括细胞计数分析仪CCA和倍性分析仪PA-I它是单或双参数的台式小型机,可以进行一些常规分析,如核DNA测定(检测倍性或细胞周期)、细胞计数、细胞凋亡它的特点是体积小,易操作,__低,检测范围广,可以检测多种荧光素(如PI、DAPI、Fluores__in)发出的荧光PAS家族包括粒子分析系统PAS、粒子分析系统III(PAS-III)和倍性分析仪PA-II提供三种激光器的三种组合,可检测十余种荧光染料最多可检测和记录八个__荧光参数倍性分析仪PA能够在2分钟内自动测量植物的倍性水平,检测异倍体可以对叶片、幼苗、种子、果皮、根、花等植物材料进行分析在大多数植物中,异倍体染色体的检测分辨率为±1条染色体PA-I使用HBO-100汞灯,属于弧光灯,可产生紫外激发光和__PA-II中增加了488__氩离子激光器,能够检测几乎所有的荧光染料,如DAPI,Hoeehst,PI,EB,MMC,FITC,FDA等汞灯发光是电流经过气体时,气体电离产生的它能提供最佳的激发波长CyFlow(R)SL配备三种激光管,可应用于诸如人类健康、微生物学、工业应用、过程控制、生态学等研究如HIV扫描中免疫标记细胞计数、食品处理过程中的微生物计数、细胞凋亡等它使用l2V直流电,特别适合边远地区和发展中国家国际上20世纪80年代开始将流式细胞仪检测应用到植物的研究中(Galbraith,1983),众多学者都认为流式细胞仪是一种准确、快速的检测DNA含量的方法(Michaelson,1991)应用范围主要是利用流式细胞仪研究属内、属间多种植物的DNA含量(Baird,1994;Jacob,1996;HALL,2000)和倍性水平(Costich,1993;Meng,2002)、检测体细胞__(Pfosser,1995;Keller,1996)和游离小孢子培养再生株(Kim,2003)的DNA含量过去我国应用这一检测技术的植物研究工__寥寥无几,且大多是在国外实验室完成的研究内容包括植物生理、程序性死亡、倍性鉴定等植物研究中使用的流式细胞仪基本上都是Partec公司的产品,也有少量是BD公司生产的流式细胞仪BD公司的产品主要定位于医学研究与应用,与Partec产品相比,不太适合从事植物染色体倍性的鉴定主要体现在不能提供植物样品制备技术/试剂,数据获取软件可同时检测到的倍性数目少鉴于目前我国科研院所中使用较多的是BD公司生产的流式细胞仪,在下一篇中将会对利用BD流式细胞仪进行植物倍性检测的技术和技巧做详细报告如何选择流式细胞仪 自七十年代出现第一代流式细胞仪以来,随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的不断发展,现代流式细胞仪已今非昔比,制造工艺、功能、精确度有了质的飞跃流式细胞仪生产厂商推出各种不同型号的流式细胞仪来满足用户的不同需要现生产流式细胞的厂商全球至少有六家,各厂商产品又有不同的系列,各具特点如何从众多的型号中挑选出最适合自己的机型,我们还需从分析应用出发,评估自己的需求来决定什么样的流式细胞仪最具性价比、最适合自己⑴、DNA倍体分析DNA分析是流式细胞仪最初且是现在应用最广检测项目由于恶性细胞DNA含量通常与正常细胞不同,存在异倍体细胞,所以现有很研究评价异倍体细胞与肿瘤恶性度及其预后的关系DNA含量检测还可提供细胞周期方面的信息,这在细胞生物学中运用很广泛特别地,它可表示出细胞毒__物对细胞作用过程这些DNA检测还可与细胞表面标志物标记同时进行,这样在细胞混合培养中,可通常追踪表达特异标志物的细胞显示其生长周期情况所有方法都是基于染料能与核酸起特异的化学反应并发射出荧光,常用的染料为PI,DAPI流式细胞仪要求488__光源,575__滤光片⑵、细胞生存能力实验使用Heochest33342染料与DNA特异性结合,后因细胞活力不同,染料的结合程度也各异,故可评估细胞的活性度流式细胞仪要求360__光源,455__滤光片⑶、计数外周血中检测网织红细胞使用TO染料能够特异性地与RNA结合,结合系数高达3000,故具有很好的性价比流式细胞仪要求488__光源,525__滤光片,液量绝对计数系统⑷、外周血、骨髓采集物中CD34阳性干细胞计数,临床上用于骨髓移植前干细胞数理的测定使用标准ISHAG方案,需要DNA或其他核染料占用FITC通道,PE标记CD34抗体,PE-CY5标记CD45抗体流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片,液量绝对计数系统⑸、交叉淋巴细胞、粒细胞毒实验检测识别供体血清中免疫球蛋白与受体粒细胞之间是否存在反应有着重要临床意义,因为这种反应会导致移植后发热、移植后肺损伤及免疫性粒细胞缺乏症流式细胞仪可检测全血样本与血清孵育后粒细胞上结合的人免疫球蛋白FITC标记人免疫球蛋白抗体、PE标记粒细胞表面标志物、PE-CY5标记HLA抗体流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片⑹、血小板自身抗体检测血小板自身抗体识别人血小板抗原,会引起各种临床相关症状,如新生儿自免性血小板减少症、输血后紫癜、难治性血小板减少流式细胞可快速准确地检测血小板自身抗体FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别血小板抗体流式细胞仪要求488__光源,525__、575__滤光片⑺、移植交叉配型原细胞毒实验,主要用于避免移植物超急性排拆反应流式细胞仪用于监测T或B细胞是否受到受体血清中免疫球蛋白攻击,作为HLA配型前的预实验流式细胞仪因其高精确性已成为该领域内的金标准FITC标记抗人免疫球蛋白抗体、PE标记识别T细胞CD3或B细胞CD29抗体仪器要求488__光源,525__、575__滤光片⑻、检测细胞经抗原或细胞有丝____后活化效应淋巴细胞早期活化指标CD69可用来检测免疫治疗效果流式细胞使用三色分析可监测淋巴细胞各亚群活化情况FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD8抗体、PE-CY5标记的CD69抗体流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、575__滤光片⑼、检测细胞内因子(TH1/TH2细胞检测)未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少,用流式细胞仪很难检测出来,因此在检测前需__活化活化所用的__素为P__ 佛波酯+Ionomycin淋巴细胞在__素的作用下,活化分泌细胞因子到细胞外因流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测,如细胞因子分泌到细胞外则检测不到,因此必须阻止细胞因子的分泌抑制细胞因子分泌的试剂为BrefedlinA或MonensinTh1/Th2细胞首先是CD4+T细胞,因此存在着用CD4来设定细胞群的问题我们知道CD4不但在T细胞上表达,还在所有的单核细胞上表达,因此单独用CD4设门无法将CD4+T细胞区分开来那么我们用CD3和CD4双参数设门是否可以呢?回答是否定的因为在佛波酯的__作用下CD4抗原的表达会迅速下调,甚至完全丧失,所以不适合于设门用CD3和CD8设门,因CD8不受佛波脂的影响且绝大多数CD3+CD8-的细胞都是CD3+CD4+细胞,因此可用CD3+CD8-细胞群来确定CD4+T细胞群FITC标记CD8,PE标记IL-4和,PE-CY5标记IFN-r,APC或PE-CY7标记CD3流式细胞仪要求488__或633__(仅限APC染料)光源,525__、575__、675__,767__滤光片⑽、细胞增殖状态检测核增殖抗PCNA、Ki
67、BrdUrd用于衡量细胞增殖__状况,在评估肿瘤预后有重要意义为些标志物的检测一般同细胞表面标志物同时检测FITC标记PCNA或Ki67或BrdUrd,PE或(并)PE-CY5标记细胞表面标志物流式细胞仪要求488__或633__光源,525__、575__、675__滤光片⑾、染色体分析流式细胞仪染色分析运用两种特异性染料Hoechest33258与核苷酸AT结合;ChromomycinA3与__相结合从而在双参数坐标上根据染色体ATCG含量的不同识别各种染色体平时进行的染色体分析耗时且需要操__极具经验,而用流式细胞仪时可快速地识别出异常染色体,如加配分选系统可将这些异常染色体分选出来作进一步分析流式细胞仪要求360__或488__光源,450__、580__滤光片⑿、BrdUrd标记追踪细胞分化通过细胞分化时涉入溴化尿嘧啶,再使用抗BrdUrd抗体及PI核酸染料可精确识别它们在流式细胞仪上可清楚地识别出处于G
1、S、G
2、M期的细胞,在肿瘤研究中有着重要作用流式细胞仪要求488__光源,525__、575__滤光片⒀、淋巴细胞亚群分析外周血CD
3、CD
4、CD
8、CD
19、NK等各类淋巴细胞亚群定量分析流式细胞仪要求488__光源,525__、575__滤光片,液量绝对计数系统⒁、白血病免疫分型CD45设门三色白血病免疫分型流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏⒂、血小板分析血小板活化实验、血小板功能分析血小板识别抗体及相应活化指标流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片,液量绝对计数系统⒃、白血病、淋巴瘤微小残留病灶检测根据初诊免疫分型结果,多参数联合设门检测是否有残留白血病细胞,监测白血病的复发T系白血病微小残留病灶检测 流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片,液量绝对计数系统B系白血病微小残留病灶检测,液量绝对计数系统 流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏髓系白血病微小残留病灶检测,液量绝对计数系统 流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片最少三色荧光,参数越多检测越为灵敏⒄、细胞凋亡分析DNA凋亡峰检测、ANNEXIN-V/PI双染法凋亡检测流式细胞仪要求488__光源,525__、575__滤光片⒅、肿瘤耐药分析P-gp、LRP、MRP、BCRP各类耐药蛋白表达及功能检测流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片⒆、强直性脊柱炎诊断检测淋巴细胞B27表达强度及百分比,诊断强直性脊柱炎流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片⒇、PNH诊断外周血或骨髓检测淋巴细胞、粒细胞、红细胞或单核细胞CD
55、CD59表达强度或百分比,确诊夜间阵发性血红蛋白尿流式细胞仪要求488__光源,525__、575__、675__滤光片。