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质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤【原理】转化是将外源DNA分子导入到受体细胞,使之获得新的遗传特性的一种方法转化所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷变异株,即不含限制性内切酶和甲基化酶(R-,M-)将对数生__的细菌(受体细胞)经理化方法处理后,细胞膜、的通透性发生暂时性改变,成为能允许外源DNA分子进入的__态细胞进入受体细胞的DNA分子通过__和表达实现信息的转移,使受体细胞具有了新的遗传性状将经过转化的细胞在筛选培养基上培养,即可筛选出转化子(带有异源DNA分子的细胞)本实验采用CaCl2法制备__态细胞其原理是细胞处于0~4℃,CaCl2低渗溶液中,大肠杆菌细胞膨胀成球状转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃90秒热激处理,促进细胞吸收DNA得合物将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间,促使在转化过程中获得的新的表型,如氨苄青霉素耐药(Ampr)得到表达,然后将此细菌培养物涂在含Amp的选择性培养基上,倒置培养过夜,即可获得细菌菌落本实验是将人Bcl-2重组质粒转化DH5α扩增菌,转化后在含Amp的培养基上进行筛选,生长的菌落即为含重组质粒的工程菌含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌用于质粒DNA的扩增,获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA【试剂与器材】1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L,高压灭菌消毒2.LB固体培养基LB液体培养基中加
1.5%琼脂粉,高压灭菌消毒,待泠却至不烫手背时铺培养皿3.
0.1mol/LCaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液,置-20℃保存5.人Bcl-2重组质粒它是EcoRⅠ单酶切的pBluescriptⅡKS-载体与EcoRⅠ单酶切的人Bcl-2cDNA重组而成的,大小为4861bp,前者是一种由pUC19质粒衍生而来的具有2961bp的质粒载体因此用EcoRⅠ酶切则应到空载pBluescriptⅡKS-载体
2.96kb和人Bcl-2cDNA片段
1.9kb配制成2g/1μl6.大肠杆菌DH5α此为DNA扩增菌7.恒温水浴箱8.超净工作台9.高速冷冻离心机10.恒温摇床11.恒温箱12.消毒离心管13.消毒tips14.玻璃培养皿直径90mm15.玻璃涂布器16.95%乙醇17.标记笔【操作步骤】1.细菌__态细胞的制备将DH5α菌种划线于LB琼脂板上,37℃培养过夜挑取单菌落接种于5mlLB培养基中,37℃振荡培养培养过夜次日取菌液1ml接种至含有100mlLB培养基的烧瓶中,37℃剧烈振荡培养至约2~3h,待A600值达到
0.3~
0.4时将烧瓶置于冰浴10~15min将细菌转移到一个灭菌处理过的冰预冷的50ml离心管中4000×g,4℃离心10min,弃培养基,将管倒置于滤纸使最后的残留液体流尽加预冷的已过滤除菌的
0.1mol/LCaCl2重悬菌体,置冰浴30min4000×g,4℃离心10min,弃培养基再加4ml预冷的
0.1mol/LCaCl2,轻轻重悬菌体,置4℃冰箱12~16h2.DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α本实验中的DNA重组子为人Bcl-2重组质粒在无菌条件下按每管取200μl新鲜__态DH5α细菌置于无菌的5ml塑料离心管中,共2管,分别加入人Bcl-2重组质粒10ng和消毒水作阴性对照各5μl,轻轻旋转以混合内容物,在冰上放置30min42℃,热休克90s,中途不要摇动离心管,每管加800μl无抗生素的LB培养基,于37℃空气摇床中以150r/min速度振摇45min,使细菌复苏每管取200μl加至含氨苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板上,用玻璃涂布器涂布均匀,室温放置20min,使液体吸收,然后37℃倒置培养12~16h至单菌落形成【注意事项】1.含人Bcl-2重组质粒的DH5α菌落平板倒置置于4℃保存,于下周进行质粒DNA的制备。