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文本内容:
细胞生物学系列常见问题及解决方法
一、VazymeTUNEL系列、高背景如未凋亡细胞的强绿色荧光背景、标记时间可能过长,可减少孵育时间、适当减少TdT酶及dUTP的用量、在操作过程中保持细胞湿润;标记反应完成,载玻片在用PBS洗一遍之后,可再用含
0.1%Triton®X-100和5mg/mlBSA的PBS洗三次,每次5分钟、荧光__弱或无__、细胞建议用Triton-100通透,切片用蛋白酶K处理,切片厚度小于10-15µm时,通透10~30min即可,如果过厚则延长通透时间、延长标记时间至2h,并适当增加TdT酶及dUTP的含量、阳性对照设立凋亡模型、组织切片从载玻片上脱落a、组织切片粘附之前的包被不充分在展片之前,用3-氨丙基三乙氧基硅烷包被显微镜载玻片比多聚赖氨酸效果更好、荧光显微镜或流式细胞仪分析只剩下很少的细胞、在操作过程中丢失大量细胞提高起始的细胞量、在制备贴到显微镜载玻片的细胞悬液时,离心过程中用含1%BSA的PBS洗细胞
二、Vazyme的AnnexinV系列
1、AnnexinV-FITC染色失败或者阳性率偏低a、要确定实验中的诱导剂是否能产生凋亡可通过设定确切凋亡诱导效果的阳__物对照来排除这一情况b、贴壁细胞消化不当AnnexinV跟PS的结合需要Ca2+离子,但大多数胰酶中含Ca2+的络合剂EDTA,从而影响染色,建议使用无EDTA的胰酶c、细胞用冷PBS洗涤离心后,应尽量去掉残余液体残留PBS中的磷酸根,会与游离的Ca2+形成磷酸钙沉淀d、BindingBuffer是否被污染瓶盖要紧闭,空气中的CO2进入后与游离的Ca2+形成CaCO3沉淀,导致实验的失败e、若为贴壁细胞,药物诱导后漂浮的细胞也要收集,这部分细胞往往是凋亡阳性的细胞,丢弃会造成阳性结果偏低
2、假阳性a、细胞本身活力差建议用台盼蓝染色计算细胞的活力,台盼蓝拒染的细胞应大于95%若活力低,建议重新复苏细胞,通常刚复苏的细胞至少要传代3次以后才能进行实验b、细胞操作不当尤其是贴壁细胞消化过程中反复剧烈吹打导致破坏细胞膜,使得假阳性偏高c、诱导时间过长一般情况下诱导几个小时就可以出现早期凋亡,因此通常不需要处理大于48小时以上;诱导时间过长会使营养物质耗尽,导致细胞状态差,假阳性结果偏高
三、CellCycleAssayKit
1、G0/G1突然发生变化或漂移a、流式细胞仪管路中有气泡或被阻塞建议检查管路是否通畅或是否有气泡b、PI浓度不够建议增加PI的浓度c、与PI孵育的时间不够长建议增加孵育的时间
2、峰宽a、流式细胞仪的流速太快,建议调整流式细胞仪的流速b、样品中有气泡,检查样品中是否有气泡c、样品中有坏死细胞,建议更换样品
3、无样品峰a、可能样品中无细胞核,坏死细胞过多,建议显微镜观察样品或更换样品b、细胞碎片过多
四、ExFect
1、转染效率偏低a、ExFect与DNA的比例不优化通过预实验测试ExFect与DNA的最佳比例在2~5μl/μgDNA范围内尝试在后续的实验中选择转染效率高、细胞毒性低的比例进行转染b、转染前为细胞更换了无血清培养基ExFect/DNA复合物的包装反应需在无血清条件下进行,但使用包装好的复合物进行转染时,细胞培养基中应含有血清多数情况下,在完全培养基中进行转染,并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性c、转染时细胞密度不合适多数情况下,当细胞密度达到60%~80%时转染可以取得较高的转染效率然而细胞类型不同,最适的转染密度也不尽相同可以通过预实验寻找较优化的转染密度,并在后续实验中保持这个密度d、DNA质量偏低降解或包含内毒素为实现高效率、低毒性的转染,应使用高质量的DNA高纯度、无菌、无内毒素e、转染试剂/DNA复合物包装体系中包含血清当复合物包装反应中存在血清时,转染试剂/DNA复合物无__常形成f、存在转染抑制因素当包装反应和转染过程中存在多聚阴离子聚合物时例如硫酸葡聚糖、肝素等转染将无__常进行因此应使用不含这些成分的培养基g、细胞状态偏差传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变因此,为了提高转染效率和稳定性、降低细胞毒性,应尽量使用适度传代的细胞系,并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性
2、细胞毒性偏高a、转染前为细胞更换了无血清培养基ExFect/DNA复合物的包装反应需在无血清条件下进行,但使用包装好的复合物进行转染时,细胞培养基中应含有血清多数情况下,在完全培养基中进行转染,并且转染后不更换培养基有助于获得更高的转染效率和更低的细胞毒性b、转染时细胞密度不合适多数情况下,当细胞密度达到60%~80%时转染可以取得较高的转染效率然而细胞类型不同,最适的转染密度也不尽相同可以通过预实验寻找较优化的转染密度,并在后续试验中保持这个密度c、ExFect/DNA复合物过量转染试剂过量会导致较高的细胞毒性尝试减少DNA或者ExFect的使用量d、ExFect/DNA复合物加入培养基时分布不均匀局部转染试剂/DNA复合物浓度过高是导致细胞毒性偏高最常见的原因之一当复合物添加到培养基之后,应平置培养皿,并前后、左右交替晃动e、细胞状态偏差传代次数太少或者太多都将导致细胞对转染试剂敏感度的改变因此,为了提高转染效率以及转染稳定性、降低细胞毒性,应尽量使用适度传代的细胞系,并在不同次实验时保持细胞传代次数的一致性。