文本内容:
质粒小提试剂盒I简明步骤(PD1211)(详细内容请参考英文说明书)实验前准备注意事项RNaseA:使用前将提供的所有RNaseA瞬时离心后加入BufferA1使用后将BufferA1/RNaseA置于4oC保存质粒拷贝数:纯化中低拷贝的质粒时,使用2倍的菌液体积,2倍的BufferA1B1N1相同体积的WashBuffer和ElutionBuffer.转化菌:若为-70oC甘油冻存的菌,请先涂布平板培养后,再重新挑选新的单个菌落进行培养切勿直接取冻存的菌种进行培养DNAWashBuffer*:使用前请将8mLPD1211-00或48mLPD1211-01或216mLPD1211-02or90mLPD1211-0396-100%乙醇加入DNAWashBufferBufferB1:在低于室温时会沉淀,请于50oC左右水浴加热至沉淀完全溶解,溶液澄清,使用后保证BufferB1瓶盖旋紧在室温下(22-25oC)进行所有离心操作操作步骤
1.接种新鲜的单个菌落到1-5mL的LB培养基(含适量抗生素),37oC震荡培养14-16小时室温下10000xg离心1分钟,收集菌体,并尽可能的吸去上清注残留的液体培养基容易导致菌液裂解不充分,第5步离心后沉淀较松,不能有效吸取上清注本说明书中的操作程序适用于标准LB(LuriaBertani)培养基培养12-16小时后,OD600(细菌密度)在
2.0-
3.0之间的菌液若采用的是富集培养基,例如TB或2×YT,请注意保证OD600不超过
3.
02.加入250µLBufferA1(确保已加入RNaseA),用移液枪或涡流震荡充分悬浮细菌细胞注细菌细胞如果没有充分悬浮均匀,将导致菌体裂解不完全,从而降低产量
3.加入250µLBufferB1轻轻地反转5-10次以混合均匀,然后静置2-5分钟至溶液粘稠而澄清注切勿剧烈振荡静置时间不超过5分钟,时间过长会导致基因组DNA污染或质粒受到损伤若溶液未清亮澄清,则表明菌体裂解不充分,应加大BufferB1的用量或减少菌体量
4.加入350µLBufferN1立即反转多次,至溶液充分混匀,此时出现白色絮状沉淀
5.将离心管转至高速离心机,在室温下13000rpm离心10分钟(若上清中有白色沉淀,可再次离心)
6.小心吸取离心后的上清液至带有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀),室温下13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中
7.可选:向DNA柱中加入500µLBufferKB室温下13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中注此步对富含内源核酸酶的宿主菌(endA+)来说是必须的,如HB101JM101TG1等;对endA-来说可省略,如Top10和DH5a等,请参照英文说明书第3页的表
2.
8.向离心柱中加入500µLDNAWashBuffer(确保已加入无水乙醇),室温下,13000rpm离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将离心柱重新放回到收集管中可选步骤重复步骤“8”
9.将离心柱放回高速离心机中,13000rpm室温下开盖离心2分钟,以彻底去除残留的乙醇注此步骤中开盖离心将会更有效的去除残留的乙醇,乙醇是否去除干净将会影响最后的洗脱效率
10.将离心柱转至一个新的
1.5mL离心管中,向DNA柱的正中间加入50~100µL(体积50µL)的ddH2O(pH在
7.0-
8.5之间)或ElutionBuffer,室温放置2分钟,13000rpm离心1分钟,洗脱质粒DNA注提取到的质粒DNA可直接用于基因克隆、测序、酶切、文库筛选、体外转录翻译、转染HEK293细胞若用于转染内毒素敏感性细胞株,原代细胞及用于微注射,建议去除内毒素(PD1212)DNA浓度及纯度DNA浓度µg/mL=OD260x50x稀释倍数,OD260/OD280约为
1.7-
1.9常见问题及解答
1、没有提出质粒或者质粒收获量很低A、菌种老化建议对于甘油保存的菌种,需要先进行活化涂布或者划线菌种,重新挑选单菌落进行液体培养,并对菌种进行初摇活化,按照1500的比例进行菌种培养二次培养细胞最好不要超过16小时B、低拷贝质粒建议如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低,可以采用两倍的菌体量,并相应增加各种Buffer的用量,如果必要,更换具有相同功能的高拷贝质粒载体C、质粒丢失建议某些质粒在多次继代培养的过程中会出现丢失的现象,另外检查筛选抗生素的浓度是否正确D、裂解不充分建议如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备,会导致菌体裂解不充分可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量请根据选取的试剂盒,处理相应量的细菌量E、Buffer中有沉淀未溶解建议BufferB1和BufferN1在温度较低时会出现沉淀,使用前请检查是否有沉淀生成,如有沉淀生成,请置于37oC温育片刻,待溶液澄清后使用F、DNAWashBuffer中未按要求加入乙醇建议按照说明书要求加入要求量的无水乙醇,使用后旋紧瓶盖,防止乙醇挥发G、离心柱中乙醇残留建议漂洗后,可适当延长离心时间,已尽量去除残留的乙醇另外对于质粒中提,大提和超大量提取,建议离心后,将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻,以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作E、洗脱液加入位置不正确,建议洗脱液应加在膜__,已取得最好的洗脱效果F、洗脱液pH值不正确建议将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在
7.0~
8.5之间,如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果,请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH
8.5,10mMTris-HCl)进行洗脱,如果用ddH2O进行洗脱,请确保pH在
7.0~
8.5之间G、洗脱体积及时间的选择建议洗脱体积将会影响最终的收获量,洗脱体积越大,收获量越高,但是浓度将会降低请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱,以保证最好的收获量和浓度如果需要高浓度的质粒,请减少洗脱体积另外,如果想收获高浓度高收获量的质粒,可进行二次洗脱建议加入洗脱Buffer后,室温放置2~5分钟,更有利于洗脱
2、质粒纯度不高A、蛋白质污染OD260/OD
2801.7建议选择推荐量的菌体,离心后小心吸取上清,如果上清液中混有悬浮物,可再次离心,以彻底去除蛋白质B、RNA污染OD260/OD
2801.9建议检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中,加入RNaseA后,BufferA1/RNaseA应该存放在4oC,如果存放时间过长,或者没有正确存放,请重新加入RNaseAC、基因组DNA污染建议加入BufferB1后,轻轻颠倒混匀,避免剧烈震荡涡旋,加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟
3、加样时DNA飘出加样孔外建议柱中残留乙醇未除净洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在膜上可再离心或者抽真空。