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精品文章《westernblot失败经验总结》第一篇westernblot失败经验总结westernblot失败经验总结1我做了很久的wb,最大的一个难点感觉在于样品制备上蛋白的降解有些时候是你想象不到的,可能出奇的糟糕,也可能完全没事~~如果单独做wb的话,感觉以“快速彻底裂解,先变性后保存”的原则比较有效,尽量选择足够强的裂解液,甚至直接给loadingbuffer裂解,然后取出部分蛋白定量,其余加入loadingbuffer100度充分变性,再分装保存有些时候比蛋白酶抑制剂更有效另一个感觉就是样品中目的蛋白的量,限于wb的检测下限问题,一般目的蛋白量最好别低于1ng(虽然ecl法下限是
0.1ng,即100pg),最好在10ng以上为好这就要求在做wb之前必须充分考虑目的蛋白的可能丰度,最好充分的准备工作然后再设计细胞量或者组织量,千万别把样品搞稀了,否则就不好办了最后,还是多看文献,在做某个蛋白之前最好看看别人是如何做的,有什么特殊要求,内参如何选等等westernblot失败经验总结2我就跑胶和转膜谈一点儿自己的体会
1、跑胶电泳buffer重复利用的时候要注意,不能混浊,有时候能用个3-4次,有时候第二次都不行了,事先前预电泳一下,看看气泡的均匀度;buffer一定要淹过梳子孔,否则就会发现今天的蛋白不会跑;跑的时候先用低电压跑过浓缩胶,再换高电压跑分离胶,不要追求速度,慢慢跑条带会分离的更好,特别是对于高分子量的目的蛋白;
2、转膜我用的是湿转,buffer一定要预冷,最好提前一天配好放4度;滤纸不要大过pvdf膜,防止短路;胶在负极,膜靠近正极,放入tank前检查一遍会使你免以体会放反的痛心疾首;膜要标记好正反面;转膜过程中,经常过去看看,防止意外,如电泳仪接触不好WESTERNBLOTTING心得1.总蛋白提取(胞膜,胞浆,胞核)组织匀浆后,15000g,4度,20分钟后,取.buffer np40750ul,脱氧胆酸钠
0.5克,sds
0.1克,加1xpbs至100ml.再加入pmsf(
7.4mg/ml)
0.1ml.(现用现加)
7.4mg/mlpmsp异丙醇溶液取amgpmsf加a/
7.4ml异丙醇.工厂-20度储存2.组织膜蛋白提取所在操作冰上进行
(1)取组织,用pbs冲洗干净组织上的...。