基于等离子体诱变提高木糖利用重组酿酒酵母的抑制物耐受性

基于等离子体诱变提高木糖利用重组酿酒酵母的抑制物耐受性3四川省环境保护有机废弃物资源化利用重点实验室成都610065摘要木质纤维素原料预处理过程中产生的各种抑制物是燃料乙醇生产的-大障碍，因此要求酿酒酵母菌株具有优良的抑制物耐受能力相比葡萄糖发酵，酿酒酵母利用木糖的发酵过程对抑制物更敏感针对一株具有良好木糖发酵能力的絮凝性工业重组酿酒酵母菌株s6进行常压室温等离子体（AtmosphericandRoomTemperaturePlasmaARTP）诱变，通过平板初筛和发酵复筛，获得一株抑制物耐受性得到显著提升的突变菌株335与出发菌株s6相匕在含单一抑制物（

4.8g/L乙酸，

1.9g/L5-羟甲基糠醛，

0.46g/L香草醛）的发酵条件下，突变菌株335利用木糖发酵时的乙醇浓度分别提高了

55.0%

13.7%和

35.0%在含混合抑制物（

2.4g/L乙酸+

1.3g/L5-羟甲基糠醛+

0.23g/L香草醛）的发酵条件下的乙醇浓度提高了

101.5%突变菌株335能够利用含高浓度抑制物的秸秆水解液进行发酵，表现出优良的抑制物耐受能力本研究结果表明ARTP诱变是获得优度抑制物耐受突变菌株的一种有效手段突变菌株335对单一抑制物以及混合抑制物均具有较好的耐受能力，具有工业应用潜力（图7表3参27）关键词纤维素燃料乙醇；工业酿酒酵母；抑制物耐受性；木糖发酵；常压室温等离子体诱变Improvementofinhibitortoleranceofxylose-fennentingrecombinantSaccharomycescerevisiaeviaatmosphericandroomtemperatureplasmamutagenesisCHENDong1WUYajing2-3**MIAOBu1TANGYueqin2*3SinopecShanghaiEngineeringCo.Ltd..Shanghai200120ChinaEnvironmentalBiotechnologyResearchCenterCollegeofArchitectureandEnvironment.SichuanUniversityChengdu610065ChinaSichuanEnvironmentalProtectionKeyLaboratoryofOrganicWasteResourceUtilizationChengdu610065ChinaAbstractInhibitorsproducedduringthepretreatmentprocessisagreatchallengeinethanolfermentationduringlignocellulosicethanolproductionwhichrequiresexcellentstresstoleranceofSaccharomycescerevisiaestrains.ComparedwithglucosefermentationxylosefermentationofS.cerevisiaeismuchmoresensitivetothoseinhibitors.InthisstudyatmosphericandroomtemperatureplasmaARTPmutagenesiswasperformedonaxylose-fermentingflocculatingindustrialrecombinantS.cerevisiaestrains6andamutantstrain335whichshowedsignificantlyimprovedstresstolerancewasscreenedoutbyplatescreeningandfermentationassessment.Whenxylosewasfermentedcomparedwiththeoriginalstrains6theethanolconcentrationofmutantstrain335increasedby

55.0%

13.7%and

35.0%respectivelyundertheconditionswithsingleinhibitorof

4.8g/Laceticacid

1.9g/L5-hydroxymethylfurfuraland046g/Lvanillinandincreasedby

101.5%undertheconditionwithmixedinhibitors

2.4g/Laceticacid

1.3g/L5-hydroxymethylfurfuraland

0.23g/Lvanillin.Themutantstrain335presentedsatisfiedfermentationperformancewhenusingstrawhydrolysatecontaininghighconcentrationsofinhibitorssuggestingitsstrongresistancetomixedinhibitors.TheresultsindicatedthatARTPmutagenesisiseffectiveforachievingstresstolerantmutantsandthemutantstrain335obtainedinthepresentstudyhaspotentialforindustrialapplicationduetoitsstrongtolerancetomixedinhibitors.Keywordslignocellulosicethanol;Saccharomycescerevisiae;stresstolerance;xylosefermentation;atmosphericandroomtemperatureplasmaARTPmutagenesis作为一种清洁可再生的生物液体燃料，燃料乙醇可以替代化石液体燃料，在世界范围内受到广泛重视以秸秆为代表的木质纤维素类生物质具有可再生、产生量大、分布广、廉价等特点，己成为燃料乙醇产业规模化发展的重要原料来源，是我国燃料乙醇的发展方向秸秆等木质纤维素类生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，需经过预处理和糖化过程将原料中多糖水解为单糖（主要是葡萄糖和木糖），微生物再发酵单糖产生乙醇n-幻对原料进行预处理时，会伴随产生一定量的对微生物有抑制作用的副产物，主要包括甲酸、乙酸、乙酰丙酸等弱有机酸类，糠醛、5-羟甲基糠醛（5-HMF）等吠喃类，香草醛、丁香醛、苯酚等酚醛类这些抑制物会严重影响微生物的生长和发酵性能，从而降低乙醇的产量，而对预处理原料进行脱毒处理势必增加燃料乙醇生产成本因此，高效的乙醇发酵菌株是纤维素燃料乙醇生产的关键发酵菌株必须在具备第一代燃料乙醇（淀粉和糖质原料）生产需求（高生长速率、高发酵速率、耐温、耐污染）的基础上，还要具备利用五碳糖（主要是木糖）及耐受多种抑制物的能力SI与细菌相比，酿酒酵母具有高的葡萄糖发酵速率和产乙醇能力，同时具有相对更好的抗逆性，适合工业粗放生产过程，是目前普遍用于燃料乙醇工业生产的微生物16］目前己有较多酿酒酵母的木糖利用相关研究，获得了优秀的能同步利用葡萄糖和木糖的酿酒酵母菌株591但是针对酿酒酵母抑制物耐受性研究还比较有限，研究较多集中于葡萄糖发酵过程且研究多针对单一抑制物，针对混合抑制物的较少对于木糖发酵过程抑制物耐受研究非常有限，但是相比葡萄糖发酵过程，木糖发酵过程对抑制物更敏感眼儿⑷木糖是木质纤维素中含量仅次于葡萄糖的五碳糖，但是重组酿酒酵母涉及的转运蛋白对葡萄糖的亲和性更高因此与葡萄糖相比，酵母的木糖代谢能力受其木糖摄取能力低下的影响木糖摄取速率的降低将导致木糖消耗期间ATP再生能力下降与此同时，木糖发酵状态下，糖异生途径、三梭酸和乙醛酸循环、呼吸作用的相关基因上调，说明利用木糖时细胞缺乏碳源代谢物抑制的能力，维持细胞基本代谢所需的ATP较多而酿酒酵母对多种抑制物的响应也需耍ATP的投入，因此与葡萄糖相比，木糖代谢期间酵母更易受抑制物的影响19』5-也因此选育能同时对葡萄糖和木糖进行高效利用，且耐受高浓度抑制物的重组酿酒酵母是实现纤维素乙醇生产的重要基础由于酿酒酵母对抑制物特别是对混合抑制物耐受的分子机制复杂，常需要进行多基因改造，而且目前发现的有效的目标基因或代谢路径还比较有限，只通过基因改造提升菌株的多种抑制物耐受能力，难度比较大尽管进化工程以及物理/化学诱变手段存在工作量大，费时费力等缺点，但其不依赖于分子机理，因此是获得抑制物耐受菌株的重耍途径常压室温等离子体诱变技术（AtmosphericandRoomTemperaturePlasmaARTP）是一种新型非定向的微生物育种技术，该技术采用高纯氮气作为出发气体，在一定作用下产生大量含多种化学活性粒子的非平衡性等离子体流，可以直接作用于细胞DNA对生物的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制SOS修复过程为一种高容错率修复，因此修复过程中会产生种类丰富的错配位点，并最终稳定遗传进而形成突变株与常规诱变技术相比，该技术具有气体温度低、快速突变、突变多样性高、突变菌株的遗传稳定性好、操作灵活性高、安全性高等特点ARTP对生物的遗传物质损伤效果明显、损伤机制丰富、尤其是对于染色体等真核生物的遗传物质均有很强的损伤效果；因而ARTP较其他诱变方法显示出更高效的突变性能、更广谱的适用范围经ARTP诱变处理获得的突变株，具有更丰富的基因突变位点目前已成功应用于多种生物的诱变m-201ARTP诱变在酿酒酵母中的应用尽管还非常有限，但已有研究表明通过该技术获得了遗传稳定性良好的突变菌株⑵a】本文对具有优良木糖利用能力的絮凝性工业重组酿酒酵母菌株s6⑼进行了ARTP诱变，通过多轮筛选获得了一株抑制物耐受能力得到明显提升的突变菌株，该菌株对各典型抑制物以及混和抑制物具有优良的耐受性，具有较好的工业化应用潜力1材料与方法

1.1菌株出发菌株为絮凝性工业重组酿酒酵母（SaccharomycescerevisiaeY^株s6⑼该菌株具有外源导入的木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）代谢途径，可以利用木糖生产乙醇

1.2培养基2%YPD含20g/L荀萄糖的YP培养基（10g/L酵母浸出粉、20g/L蛋白月东、20g/L葡萄糖），用于酵母的活化与预培养5%YPD含50g/L葡萄糖的YP培养基（IOg/L酵母浸出粉、20g/L蛋白豚、50g/L葡萄糖），用于酵母的预培养2%YPX:含20g/L木糖的YP培养基（10g/L酵母浸出粉、20g/L蛋白腺、20g/L木糖），用于突变菌株的生长评价添加的抑制物浓度分别为

4.8g/L乙酸、

1.9g/L5-HMF和

0.46g/L香草醛5%YPX含50g/L木糖的YP培养基（10g/L酵母浸出粉、20g/L蛋白腺、50g/L木糖），用于突变菌株的发酵评价添加的抑制物浓度分别为

4.8g/L乙酸、

1.9g/L5-HMF、

0.46g/L香草醛和

2.4g/L乙酸+

1.3g/L5-HMF+

0.23g/L香草醛香草醛在培养基灭菌（121°C15min）前添加，其它抑制物经

0.22pm滤膜过滤除菌后再添加到灭菌后的培养基中所有培养基的pH调节至5在配制固体培养基时加入20g/L琼脂粉秸秆经预处理和酶解后的糖化液用于突变菌株的发酵性能评价糖化液主要组分浓度（g/L）为葡萄糖

84.0木糖

23.3甲酸

4.5乙酸

4.6总酚

5.

91.3常压室温等离子体（ARTP）诱变处理出发菌株在2%YPD培养基活化培养后再转接至相同培养基培养（160r/min.3（）°C、16h）每隔2h取样培养液经10000r/min离心3min收集菌体，加入50mmol/LEDTA分散菌体细胞，测定600nm波长下吸光度（OD6oo）＜.根据所测得的OD600绘制菌株的生长曲线根据生长曲线选择处于对数生长期的细胞进行等离子体诱变（ARTP-M无锡源清天木）取培养液1mL经4000r/min离心3min去上清液，加入1mL50mmol/LEDTA和5%廿油混合溶液分散细胞取

0.01mL菌悬液涂匀至照射玻片上，照射时间分别为30s60s90s120s和150s照射三组平行样，将照射后的玻片放入1mL的生理盐水中洗脱细胞取

0.1mL菌悬液涂布于2%YPX固体培养基，30°C培养48h对每个照射时间条件下的菌落数进行计数，以无照射样品的菌落数为对照，计算等离子体诱变照射后酵母细胞的存活率

1.4突变菌株的平板初步筛选选取照射后细胞存活率为10%的诱变菌悬液进行梯度稀释（10%10-

3、10-4）各取o.1mL涂布于2%YPX固体培养基，于30°C培养48h挑选出450个比出发菌株生长更好或生长情况相似的单菌落，于2%YPX固体培养基中划线培养24h后，挑出单菌落至ImL50mmol/LEDTA分散细胞，将菌悬液稀释10倍测定OD6oo将每株酵母菌的菌悬液调成统一的OD值并进行梯度稀释（IO%10%IO-，），按稀释梯度点板于含有不同抑制物（乙酸、香草醛、5-HMF）的2%YPX固体培养基中培养48h以未经诱变处理的出发菌株为对照，评估突变菌株的生长情况，挑选出生长情况优于出发菌株的突变菌株

1.5突变菌株的人工培养基发酵评价将

1.4初筛出的突变菌株进行预培养离心收集菌体，接入（接种量5g干菌体/L）含不同类型抑制物的100mL5%YPX培养基中（30（）mL锥形瓶）于恒温水浴中发酵（200r/min35°C）定时取样分析木糖、乙醇和木糖陶浓度

1.6突变菌株的秸秆糖化液发酵评价使用1L机械搅拌发酵罐进行发酵评价将突变菌株进行预培养，离心收集菌体，接入（接种量1g干菌体/L）600mL秸秆水解液中，在200r/min、30°C、

0.025L/（L-min）（通气量）的条件下进行发酵，定时取样分析葡萄糖、木糖、乙醇以及抑制物的浓度

1.7分析方法

1.

7.1还原糖、木糖醇和乙醇浓度取发酵液1mL离心收集上清液，用

0.22pm的滤膜过滤，稀释后测定木糖、木糖醇和乙醇的浓度木糖浓度使用LC-10ADVP高效液相色谱仪（岛津，日本）测定，检测器为RF-10AXL柱温为65°C炉温为150C；木糖醇浓度使用SCL-10AVP高效液相色谱仪（岛津）测定，检测器为RID-10A柱温为65°C；乙醇浓度使用GC353B气相色谱仪（GLsciences日本）测定，使用异丙醇作为内标，氮气作为载气，氢气作为燃气，炉温为50°C注射器和检测器温度为180C

1.

7.2抑制物浓度5-HMF使用SCL-10AVP高效液相色谱仪（岛津）测定检测器为UV检测器（波长238nm）分离柱为Bio-radAminexHPX-87H（300x

7.8Bio-RadLaboratories美国），柱温为65°C移动相为

0.5mMH2SO4移动相流量为

0.8mL/min进样体积为50pL乙酸使用SCR-10IH高效液相色谱仪测定样品经有机酸分离柱（ShimpackSCR-101H岛津）分离后，与指示剂BTB反应，在450nm（SPD-10AVUV-VIS检测器，岛津）条件下测定吸光度柱温60°C移动相为3mmol/LHC1O4流速

0.5mL/min指示剂流速

1.0mL/min香草醛和总酚利用Folin-Ciocailcu比色法测定，用没食了酸制作标准曲线精密吸取上清液

0.4mL分别加蒸馄水

2.0mL加10%Na2CO3溶液

1.2mL混匀，加福氏试剂

0.6mL（

0.75mol/L）蒸馅水稀释至10mL30°C水浴加热30min后，取出，摇匀，于765nm波长进行扫描，测定其吸光度值，根据标准曲线计算香草醛和总酚的质量浓度

1.

7.3吸光度值的测定取发酵液1mL于2mL离心管，12000r/min、4°C离心3min收集菌体加入2mL50mmol/LEDTA溶液分散细胞，稀释后用UV-VIS分光光度计（JASCO日本）在600nm波长下测定吸光度值（ODeo）

1.

7.4存活率的计算将经常压室温等离子体诱变后的菌悬液稀释100倍后，吸取

0.1mL涂布于筛选平板（2%YPX固体培养基）上，每个照射时间设3个平行，30C培养48h后，记录每个平板的菌落数，以未经等离子体诱变的细胞为对照，计算出诱变后的细胞存活率

1.

7.3乙醇收率计算以木糖为唯一碳源的人工培养基发酵的乙醇收率（基于消耗糖）（g/g木糖）=发酵液中乙醇浓度/（发酵开始时木糖浓度一发酵结束时木糖浓度）实际水解液发酵时乙醇收率（基于消耗糖）（g/g葡萄糖+木糖）二发酵液中乙醇浓度/（发酵开始时葡萄糖和木糖浓度一发酵结束时葡萄糖和木糖浓度）2结果与讨论

2.1等离子体诱变处理酿酒酵母s6的生长曲线如图1A所示，培养8h时处于对数生长期后期，此阶段细胞生长繁殖旺盛，对此阶段细胞进行等离子体照射图1B为等离子体辐照不同时间条件下细胞的存活率，可以看出，照射时间为60s时细胞的存活率约为10%使用诱变60s的细胞进行后续突变菌株的筛选图1酿酒酵母菌株s6的生长曲线（A）及等离子体辐射时间对其存活率的影响（B）Fig.1GrowthcurveofSaccharomycescerevisiaestrains6（A）andeffectofplasmairradiationtimeonitssurvivalrate（B）

2.2突变菌株的平板初筛结果本研究的目标是获得在木糖利用过程可以耐受抑制物的突变菌株，因此生长和发酵筛选都利用只含木糖的培养基首先将稀释后菌液点板于含不同浓度抑制物的2%YPX平板，对比突变菌株与出发菌株在含不同抑制物平板上的细胞生长情况（菌落大小和细胞量）本论文抑制剂浓度的选择同时参考了已有文献报道的抑制物浓度范围12】423］和本研究菌株可耐受的抑制剂浓度范围当乙酸、5-HMF或香草醛的浓度分别为

2.

4、

1.3和

0.3g/L时，各菌株的生长几乎没有受到抑制物的影响（结果未展示）将乙酸、5-HMF或香草醛的浓度分别提高到

4.

8、

1.9和

0.46g/L时，菌株生长受到明显的抑制根据450株突变菌株在含乙酸，5-HMF或香草醛分别为

4.

8、

1.9和

0.46g/L的平板上的生长情况，舜选出至少在两种抑制物条件下生长优于出发菌株的突变菌株共24株（表1）可以看出，其中20株只对两种抑制物具有比出发菌株更好的耐受力，其余4株对三种抑制物都有更好耐受能力该结果表明，通过ARTP诱变，可以获得在利用木糖条件下对两种或三种抑制物同时具有更好耐受能力的突变菌株对四株（

335、

338、

341、428）对三种抑制物都有更好耐受能力的突变菌株进行了后续发酵评价表1突变菌株在含抑制物平板2%YPX上的生长情况Table1Growthofmutantstrainon2%YPXplatecontaininginhibitor++生长显著优于s6+生长优于s6=生长等同于s6x生长劣于s6°++Growthratewassignificantlybetterthans6;+:Growthratewasbetterthans6;=Growthratewasroughlyequivalentlos6;x Growthratewaslowerthans

6.

2.3突变菌株的人工培养基发酵评价在以木糖为唯一糖源的情况下，比较了抑制物耐受能力较优的突变菌株

335、

338、

341、428及出发菌株s6分别在无抑制物、三种单一抑制物及混合抑制物存在条件下的发酵性能

2.

3.1无抑制物条件下的发酵结果图2为无抑制物条件下各菌株的发酵结果各诱变菌株的木糖消耗速率相近，略高于出发菌株，诱变菌株发酵24h后，木糖几乎被完全消耗发酵24h时各菌株的乙醇浓度达到最大值，与出发菌株相比，菌株

335、

338、341和428的乙醇浓度分别增加

32.58%、

24.69%、

22.18%和

18.53%其中335菌株的乙醇浓度最高，表现最优在发酵48h时各菌株的木糖醇累积量达到最大值，诱变菌株的木糖醇累积量均小于出发菌株，其中335菌株的木糖隔累积量最少该结果表明，在无抑制物条件下，诱变菌株的木糖利用能力以及乙醇收率都得到了提升ARTP诱变可导致酶活性和细胞代谢显著改变12】但本研究未评价出发菌株与突变菌株木糖代谢相关的XR和XDH活性的变化无抑制条件下乙醇发酵性能的提高，也有可能是诱变导致木糖代谢路径以外的代谢发生变化如胞内氧化还原状态发生变化，从而提高产乙醇能力因此，诱变即使没有影响XR和XDH的活性，也有可能提高菌株的产乙醇的能力图2出发菌株和突变菌株在无抑制物条件下的发酵结果Fig.2Fermentationresultsoforiginalstrainandmutantstrainswithoutinhibitor

2.

3.2乙酸

4.8g/L存在条件下的发酵结果图3为

4.8g/L乙酸条件下各菌株的发酵结果，可以看出，

4.8g/L乙酸时对各菌株的木糖利用均呈现明显的抑制作用与出发菌株相比，各诱变菌株对

4.8g/L乙酸的耐受性均显著增强，茜株335对乙酸的耐受能力明显强于其他诱变菌株发酵72h时，各菌株均剩余一定量的木糖，其中菌株335的木糖消耗速率最高，乙醇浓度最高与出发菌株相比，发酵24h时，菌株

335、

338、341和428的乙醇浓度分别提高了

55.03%、

40.34%、

32.09%和

26.31%除菌株428的木糖醇累积量低于出发菌株外，其余菌株的木糖醇累积量均高于出发菌株相比无抑制条件下的乙醇浓度，乙酸存在条件下各菌株的乙醇浓度显著提高，表明乙酸的存在提高了木糖发酵的乙醇收率和己有研究结论一致图3出发菌株和突变菌株在

4.8g/L乙酸存在条件下的发酵结果Fig.3Fermentationresultsoforiginalstrainandmutantstrainsinthepresenceof

4.8g/Laceticacid

2.

3.35-HMF

1.9g/L存在条件下的发酵结果图4为

1.9g/L5-HMF存在条件下各菌株的发酵结果

1.9g/L的5-HMF对各菌株的木糖消耗速率几乎没有产生抑制作用，发酵24h时木糖几乎被完全消耗出发菌株的木糖消耗速率稍慢，诱变菌株的木糖消耗速率相近与出发菌株相比，发酵24h时各菌株的乙醇浓度分别增加了

13.68%、

3.53%、

1.03%、

3.31%菌株335的乙醇浓度最高，木糖醇累积量最低相比无抑制条件下的乙醇浓度，

1.9g/LHMF存在条件下的乙醇浓度均下降，原因之一为5-HMF可被酵母还原为毒性较低的化合物【24】，还原力的消耗，导致了乙脖收率降低发酵48h时后的乙醇浓度下降是由于木糖已被消耗完，细胞会消耗少量乙醇用于维持代谢图4出发菌株和突变菌株在

1.9g/L5-HMF存在条件下的发酵结果Fig.4Fermentationresultsoforiginalstrainandmutantstrainsinthepresenceof

1.9g/L5-HMF

2.

3.4香草醛（

0.46g/L）存在条件下的发酵结果图5为

0.46g/L香草醛条件下各菌株的发酵结果

0.46g/L的香草醛对各菌株前8小时的木糖消耗产生了明显抑制，但各菌株在发酵24h时将木糖基本完全消耗，出发菌株s6的木糖消耗速率稍慢，各诱变菌株木糖消耗速率相近菌株335的乙醇浓度最高，木糖醇累枳量最低发酵24h时，与出发菌株s6相比菌株

335、

338、341和428的乙醇浓度分别增加了

35.03%、

12.13%、

9.77%和

10.20%相比无抑制条件下的乙醇浓度，

0.46g/L香草醛存在条件下的乙醇浓度均下降，原因之一为香草醛可被酵母还原为毒性较低的化合物12习，还原力的消耗，导致了乙醇收率降低图5出发菌株和突变菌株在

0.46g/L香草醛存在条件下的发酵结果Fig.5Fermentationresultsoforiginalstrainandmutantstrainsinthepresenceof

0.46g/LVanillin

2.

3.5混合抑制物存在条件下的发酵结果图6为混合抑制物（

2.4g/L乙酸+

1.3g/L5-HMF+

0.23g/L香草醛）条件下各菌株的发酵结果可以看出，所有菌株的木糖消耗被明显抑制，但各菌株在发酵48h时可将木糖基本完全消耗突变菌株的木糖消耗速率以及乙醇浓度均高于出发菌株，其中335菌株的木糖消耗速率最快，乙醇浓度最高，木糖醇累积量最低与出发菌株相比，发酵24h时突变菌株

335、

338、341和428的乙醇浓度分别增加了

37.20%、

19.81%、

22.67%和

18.83%图6出发菌株和突变菌株在混合抑制物存在条件下的发酵结果Fig.6Fermentationresultsoforiginalstrainandmutantstrainsinthepresenceofmixedinhibitors

2.

3.6以木糖为唯一碳源的发酵结果比较对出发菌株以及突变菌株在利用木糖发酵时对抑制物的耐受能力进行了比较表2为发酵前24h时各菌株的木糖消耗速率表3为发酵24h时，与出发菌株相比，各突变菌株的乙源浓度增加百分比（%）及各菌株基于消耗木糖的乙醇收率（g/g木糖）在所有抑制物条件下，突变菌株的木糖消耗速率均高于出发菌株，特别是在乙酸抑制以及混合抑制物抑制条件下差异尤其显著（表2）在这两个抑制条件下突变菌株335的木糖消耗速率分别提高了约48%和24%相应的乙醇浓度分别提升了55%和37%0在各发酵条件下，突变菌株的乙醇收率普遍优于出发菌株（表3）在乙酸抑制条件下，木糖醇累积觉最低，乙酸的存在可能改变了胞内氧化还原状态〔⑵，有利于木糖醇的进一步转化；而5-HMF和香草醛存在时，细胞会消耗还原力将它们还原124-25]导致产乙醇过程还原力不足，乙醇收率下降，木糖醇更多的积累与无抑制物相比，在含乙酸的条件下，各菌株的木糖消耗速率均受到了显著的影响（表2）但适量的乙酸可以提高乙醇收率，和己有结论

17.⑵一致而在只含5-HMF或香草醛的情况下，各菌株木糖消耗速率没有受到明显的影响（表2）但乙醇收率相比对照组有所下降（表3）0乙酸和含较高浓度乙酸的混和抑制物可能主要抑制菌株的木糖代谢能力，而5-HMF和香草醛可能.主要影响菌株的乙醇收率，本研究获得的突变菌株在木糖代谢能力以及乙醇收率上的同步提升正好减轻了不同抑制物所导致的影响四株突变菌株中，菌株335在各个抑制物条件下都表现出了最优的木糖消耗速率和乙醇收率，表明其具有优良的木糖发酵和抑制物耐受能力表2出发菌株以及突变菌株在不同抑制物条件下发酵24h的木糖消耗速率g/L・hTabic2Xyloseconsumptionrateoforiginalstrainandmutantstrainsafter24h-fcrmcntationunderdifferentinhibitorconditionsg/L・h表3与s6相比，发酵24h诱变菌株的乙醇浓度提升率（%）及基于消耗木糖的乙醇收率（g/g）Table3Comparedtos6theethanolconcentrationincreaserate%andethanolyieldg/gbasedonconsumptionofxyloseofmutantstrainsafter24h-fermentation~抑制条件Inhibitioncondition

2.4突变菌株335利用秸秆糖化液的发酵能力图7为突变菌株335利用秸秆糖化液的发酵结果发酵24h后葡萄糖被完全消耗，乙醇浓度约38g/L发酵72h后剩余木糖

10.26g/L乙醇浓度为

42.05g/L基于消耗总糖的乙醇收率为

0.44g/g基于总糖的乙醇收率为

0.40g/g本研究使用的秸秆糖化液中抑制物含量比较高，发酵初始物料中的甲酸、乙酸和总酚浓度分别为

4.5g/L、

4.6g/L和

5.9g/L发酵过程中除甲酸浓度有所下降外，乙酸和总酚浓度变化不大（发酵物料为固体和液体混合物，其非均相性可能导致样品采集出现不均一性，所测浓度存在波动）突变菌株335能利用抑制物含量如此之高的秸秆水解液进行发酵，且能够将葡萄糖在24h内消耗完，并能发酵部分木糖，表明其具有优良的耐受混合抑制物的能力TALI高表达菌株SEB3-Pubi4-TAL1在利用含甲酸

0.15〜

0.3g/L乙酸3-

3.5g/L，总酚

0.05~

0.065g/L等抑制物的秸秆糖化液发酵时，发酵48h只消耗了约20g/L的葡萄糖，木糖消耗很少，乙醇浓度只有约10g/Ll23o通过短期驯化获得的菌株CR01和KE6-12利用含甲酸

1.08g/L乙酸

4.23g/LHMF

0.54g/L，糠醛

2.7g/L的麦秆水解液发酵，发酵24h时的乙醇浓度分别约为10g/L和30g/Lm】也有较多研究通过接种高浓度细胞，提高实际物料的发酵效率以抵抗抑制物的抑制效应B

26.27］本研究获得的突变菌株335以较低的接种量（1g干细胞/L）可在35°C条件下发酵含高浓度抑制物的实际物料并取得较好发酵结果，表明该菌株的抑制物耐受能力优于同类菌株图7突变菌株335利用秸秆糖化液的发酵结果Fig.7Fermentationresultsofmutantstrain335usingstrawsaccharificationsolution3结论本研究对具有木糖发酵能力的工业重组酿酒酵母菌株s6进行了ARTP诱变，通过平板和批次发酵筛选，获得一株具有优良抑制物耐受能力的突变菌株335与出发菌株相比，在含单一抑制物（

4.8g/L乙酸，

1.9g/L5-羟甲基糠醛，

0.46g/L香草醛）的发酵条件下，突变菌株335利用木糖发酵时的乙醇浓度分别提高了

55.0%

13.7%和

35.0%在含混合抑制物（

2.4g/L乙酸+

1.3g/L5-羟甲基糠醛+

0.23g/L香草醛）的发酵条件下发酵木糖时的乙醇浓度提高了

101.5%该菌株可利用含约15g/L抑制物的秸秆水解液发酵，24h乙醇浓度可达38g/L发酵72h时的乙醇收率为

0.44g/g表现出优良的混合抑制物耐受能力本研究结果表明，ARTP诱变是获得优良抑制物耐受突变菌株的有效手段，突变菌株335对单一抑制物以及混合抑制物均具有较好的耐受能力，具有工业应用潜力后续需对突变菌株335的抑制物耐受分子机理进行深入解析，为构建多抑制物耐受工业菌株提供指导12345678910111213141516171819202122参考文献[References]DuJ.LiangJR.GaoXH.LiuGDQuYB.Optimizationofanartificialcellulasecocktailforhigh-solidsenzymatichydrolysisofcellulosicmaterialswithdifferentpretreatmentmethods|J|.BioresourTechnoL2020295:122272ZhouZYLeiFHLiPFJiangJX.Lignocellulosicbiomasstobiofuelsandbiochemicals:acomprehensivereviewwithafocusonethanolorganosolvpretreatmenttechnology|J].BioiechnolBioeng.2018115:2683-2702JonssonIJAlrikssonBNilvebrantNO.Bioconversionoflignocellulose:inhibitorsanddetoxification[J].BioiechnolBiofuels.20136:16PalmqvistE・Hahn-HagerdaiB.Fermentationoflignocellulosichydrolysates.II:inhibitorsandmechanismsofinhibition[J].BioresourTechnol

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2016.218:380-387陈栋1吴娅菁2切缪晡1汤岳琴％3|中石化上海工程有限公司上海2001202四川大学建筑与环境学院环境生物技术研究中心成都610065突变筒株含乙酸平板含5-HMF平板含香草醛平板MutantstrainPlatecontainingaceticacidPlatecontaining5-HMFPlatecontainingvanillin13X++18++X29++X34—++38+—+42++X44X++46++X141X++145—++148+—+230++=247+X+323+++—333++X334—+++335++++337++X338+++339+—+341+++412++X416X++428++++菌株无抑制物乙酸五羟甲基糠醛香草醛混合抑制物StrainWithoutinhibitorAceticacid5-HMFVanillinMixedinhibitorss

61.

900.

941.

861.

981.

343352.

001.

391.

902.

051.

663382.

011.

251.

902.

031.

573412.

011.

241.

902.

041.

634282.

011.

091.

902.

051.52。