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实验六过氧化物酶活性的测定(比色法)【实验目的】熟悉和掌握比色法测定过氧化物酶活性的原理和过程【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中在有过氧化氢存在下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐色物质,可用分光度计测量生成物的含量【器材与试剂】
1、仪器设备紫外■可见光分光光度计、低温冷冻离心机、秒表、电子天平、研钵、磁力搅拌器
2、实验试剂愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO
4、100mmol/L磷酸缓冲液,pH
6.0(见附表2)反应混合液取100mmol/L磷酸缓冲液(pH
6.0)50mL于烧杯中,加入愈创木酚28口L,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入30%过氧化氢19piL,混合均匀,保存于冰箱中
3、实验材料任何植物材料【实验步骤】
1、粗酶液的提取称取植物材料lg,加入5mL20mmol/L KH2PO4,于研钵中研磨成匀浆,以4000r/min离心15分钟,倾出上清液保存在冷处,残渣再用5ml KH2PO4溶液提取一次,合并两次上清液贮于冷处备用
2、酶活性的测定取光径1cm比色杯2只,于1只中加入反应混合液3ml,KH2PO4lml,作为校零对照,另1只中加入反应混合液3ml,上述酶液lml(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计波长470nm下测量吸光度值,每隔
0.5分钟读数1次以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小,即以△A47o/min-g-FW(或mg蛋白质)表示之蛋白质含量测定参阅蛋白质含量测定【结果与分析】酶活性=AA470/反应时间/样品鲜重【注意事项】
1、根据酶活性大小可测定0-3min或0-5min的OD值,取平均值计算。