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细胞色素是电子传递体,其中细胞色素a和a3不易分离统称为细胞色素aa3,因其在传电子过程中能直接激活氧,使氧激发后成氧离子并与氢离子结合生成H20和能量,故又称细胞色素氧化酶细胞色素氧化酶存在于细胞线粒体的内膜上,它的活性往往作为细胞内氧化代谢的指标,也是线粒体的标志酶之一通过本实验,学习测定细胞色素氧化醇的方法本文介绍了磷钳蓝比色法定量测定植物伤流液无机磷含量的原理、实验器具、实验流程以及实验注意事项
一、原理已知细胞色素ccytochrome c,cytc的特征吸收峰是550nm,其吸收系数是
21.0,of以用单位时间内底物cytc的减少量来表示细胞色素氧化酶的活性在反应的0时,测得底物的最大吸光度为A,然后经酶促反应tmin后,再测定底物的吸光度为At,两者的差值除以吸光系数,就可以表示酶促反应的速率,即酶活性
二、仪器设备
1.分光光度计
2.天平
3.冷冻离心机
4.恒温水浴箱
三、试剂
1.酶液提取介质:1pL・mL-i蔬基乙醇、5mmol-mL-1EDTA、
0.1mol*L-i Tris-柠檬酸缓冲液,pH8,0o
2.测定介质:50mmohL-1磷酸缓冲液、pH
7.1,
0.2mohmL-1蔗糖、20mol・mL-i还原型细胞色素c
五、方法步骤
1.酶液提取:称取欲测定组织1g,加入少量酶液提取介质,冰冻研磨1-2min,用少量提取介质将匀浆转移干净,最后用提取液定容10mL,200目尼龙布过滤,滤液在5000r*min-i,4°C下离心10min,得到的上清液即为粗酶液
2.SS活性测定步骤:测定温度25°Co在光径为1cm的玻璃比色杯中,加入
3.0mL测定介:质,用分光光度计测定550nm处吸光度以不含cytc的测定介质和酶液混合液调零,用加入25队煮死酶液含蛋白约15四测定管测定Ao,用加入25pL酶粗提液测定550nm处的光吸收值的下降值每30s间隔读数连续记录5min每样品测定三个重复
六、结果计算酶活性以每min每g鲜重或每mg酶蛋白氧化1pmol还原型cytc作为酶活力单位细胞色素氧化酶活性〃mol cytc•mi细胞色素c氧化酶比活力〃mol cytc•式中,A杀死酵液的测定管的吸光度值;At:测定tminnj-的吸光度值正:纺胞色素的吸收系数
21.0;Vt淀容体秋!;Vs测定用酶液体积;FW:样品重g;t:测定时间mino相关阅读《植物伤流液中氨基酸与酰胺的分析鉴定-纸层析法》。